resultater

modulering af cellulære P107 niveauer gennem kontrolleret proteolyse. Vi har tidligere vist, at den endogene p107, et medlem af RB–familien af proteiner, som ikke er et naturligt substrat af SCF-Kurtrcp, kan elimineres i c33a-cervikale karcinomceller ved ektopisk ekspression af en kimærisk, allestedsnærværende, allestedsnærværende, allestedsnærværende proteinligase (kurtrcp-E7N), der bærer et p107-bindende peptid afledt af de N-terminale 35-aa-rester af HPV-oncoprotein, E7 (E7N) (1). Funktionerne af mange cellulære proteiner dikteres imidlertid af deres intracellulære overflod og ikke blot af deres tilstedeværelse eller fravær. Indtil videre har der ikke været en pålidelig metode til præcist at modulere de intracellulære proteinniveauer i pattedyrceller.

Vi undersøgte først, om P107-niveauer systematisk kunne reduceres gennem kontrolleret ekspression af forskellige mængder af pristrcp-E7N. de humane c33a cervicale karcinomceller blev inficeret med stigende doser af rekombinant adenovirus, der bærer pristrcp-E7N eller kontroladenovirus i 24 timer. Infektion var 100%, selv ved den laveste anvendte dosis, som bedømt ved ekspression af GFP båret af adenovirus i alle modtagerceller (data ikke vist). Som vist i Fig. 1 (Øvre) blev de endogene P107-niveauer systematisk reduceret til 78%, 25% og 5% af steady-state-niveauerne, når c33a-celler blev transduceret med rekombinant rrtrcp-E7N-adenovirus ved moi ‘ er på 10, 35 og 80, men ikke de samme doser af Ad1-kontrolvirus. Derfor, den konstruerede SCF Pristrcp-BP tilbyder et simpelt og reproducerbart middel til at reducere de samlede mængder målproteiner på definerede niveauer til analyse af doseringseffekterne på biologiske aktiviteter.

P107 associeres stabilt med cyclin A og Cdk2 gennem et bindingssted med høj affinitet i prolifererende celler (13-15). For at undersøge, om disse P107-associerede proteiner også udsættes for målrettet nedbrydning af pristrcp-E7N, blev immunoblotting udført i c33a-celler inficeret af Ad-F-TrCP-E7N-virus. Som vist i Fig. 1 forblev de endogene cyclin A-og Cdk2-niveauer uændrede, mens p107 var dramatisk nedreguleret. Endvidere blev niveauerne af ikke-målrettet karrus-actin ikke påvirket af F-TrCP-E7N (Fig. 1). Dette resultat gav stærke beviser for, at den konstruerede pristrcp-E7N allestedsnærværende proteinligase specifikt nedbryder målrettet substrat p107, men ikke dets associerede proteiner.

selektiv nedbrydning af en specifik Posttranslationelt modificeret delpopulation af Målprotein. Modifikation af et cellulært protein på posttranslationsniveau, såsom phosphorylering, er et grundlæggende middel, som celler anvender til at regulere funktionen eller til at give nye aktiviteter af proteinet. Eksperimentelle værktøjer til at dissekere den funktion, der er knyttet til en bestemt posttranslationel modifikationshændelse, er i øjeblikket begrænsede. Fordi protein knockout opererer på posttranslationalt niveau, der direkte genkender målproteiner, er en applikation at konstruere en specifik E3, der er i stand til at vælge en underbefolkning af posttranslationalt modificerede proteiner til nedbrydning i stedet for at ødelægge hele befolkningen.

HPV16 E7 viste sig selektivt at binde til den hypofosforylerede form af RB (16). Vi undersøgte, om den kimære pristrcp-E7N allestedsnærværende proteinligase kunne skelne mellem hypo–og hyperphosphoryleret RB og kun vælge hypoformen til nedbrydning. De humane u2os osteosarkomceller udtrykker begge former for RB, der let kan identificeres, baseret på deres forskellige elektroforetiske mobilitet på SDS/PAGE (Fig. 2A, Bane 1) (17). Identiteten af disse to RB – arter blev yderligere verificeret ved immunoblotting ved anvendelse af antistoffer, der er specifikke for enten hypo-eller hyperphosphorylerede former for RB (Fig. 2A, spor 2 og 3). U2OS-celler blev inficeret med det rekombinante Ad-F-TrCP-E7N eller kontrol Ad1-adenovirus i 48 h, og steady-state-niveauerne af RB-P og RB blev analyseret samtidigt ved vestlig blotting ved anvendelse af et anti-RB monoklonalt antistof, der genkender begge former. I overensstemmelse med den præferentielle binding af E7N til hypophosphoryleret RB resulterede ektopisk ekspression af F-TrCP-E7N i eliminering af hypophosphoryleret RB, hvorimod den hyperphosphorylerede RB-P blev efterladt intakt (Fig. 2b øvre, sammenlign baner 4-6 med baner 1-3). Dette resultat fremhæver evnen hos den konstruerede F-TrCP-E7N allestedsnærværende proteinligase til valg af en specifik underpopulation af RB til nedbrydning, som var baseret på status for visse posttranslationelle modifikationer af målproteinet.

HPV16 E7 i fuld længde kunne interagere med de cyclinafhængige kinasehæmmere p21vaf1 og p27Kip1, men bindingsdomænet blev kortlagt til det C-terminale domæne (rester 40-98) i stedet for E7N-fragmentet (rester 18-20). For yderligere at undersøge specificiteten af F-TrCP-E7N blev de samme u2os-celleekstrakter også undersøgt med antistoffer mod p21vaf1 og p27Kip1. Som det ses i Fig. 2B (midten) forblev steady-state niveauerne af p21vaf1 og p27Kip1 uændrede. Samlet set demonstrerede den konstruerede F-TrCP-E7N proteolytisk specificitet over for RB-familieproteinerne, men ikke andre cellecyklusregulatorer såsom Cdk2, cyclin a, p21vaf1 og p27Kip1.

Strukturbaseret mutagenese til generering af en meget specifik pristrcp-E7N allestedsnærværende proteinligase. Den kimære karrtrcp-E7N er stadig i stand til at binde de endogene karrtrcp-substrater, herunder IkB, Karr-catenin og ATF4 (3-7). Overekspression af pristrcp-E7N kan forstyrre nedbrydningen af disse native substrater. Omvendt kan bindingen af det endogene substrat til pristrcp-E7N interferere med den korrekte positionering af det tilsigtede substrat for at acceptere allestedsnærværende fra allestedsnærværende konjugerende ferment og derfor reducere effektiviteten af målrettet nedbrydning (Fig. 3AUpper). Endvidere interagerer krotrcp med et pseudosubstrat hnRNP-U, som binder pristrcp og dets derivater i kernen og udelukker deres interaktion med substraterne (21). Ved at indføre specifikke mutationer af aminosyreresterne på kristtrcp for at eliminere dets binding til Krist-catenin, IkB eller Hnrnp-U, forventer vi at forbedre ikke kun specificiteten, men også tilgængeligheden af den konstruerede kristtrcp-E7N til at rekruttere det tilsigtede substrat (Fig. 3nederst).

det substratbindende domæne i det C-terminale område indeholder syv VD40-gentagelser, som foldes ind i den typiske syvbladede kurvpropelstruktur, der er bevaret blandt VD40-proteiner (3-7). Da den overordnede integritet af den HD40-proteins struktur er kritisk for deres funktioner, vil standard deletion mutagenese-tilgang sandsynligvis inducere Grove strukturelle ændringer og er således ikke anvendelig til at definere substratbindingssteder på krrtrcp. Den kendte krystalstruktur af VD40-proteiner kan imidlertid udnyttes til at identificere overfladerester, der er involveret i binding af pristrcp-substrater. En strukturbaseret mutagenesemetode blev designet til at identificere og mutere fem positivt ladede rester (R285, K365, R474, R521 og R524), der forventes at opholde sig på den øverste overflade af VD40-propellen, som er involveret i binding til VD40-associerede proteiner (Fig. 3B) (22). Denne tilgang blev detaljeret beskrevet i Støttemetoder, der offentliggøres som understøttende information på PNAS-hjemmesiden. Se også Fig. 6, som offentliggøres som understøttende information på PNAS ‘ hjemmeside. Desuden vil substitutioner af disse Lys/Arg-rester sandsynligvis ikke ændre den samlede pristrcp-struktur.ved at bruge multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene) har vi samtidig muteret disse rester til Glu. Denne FLAGMÆRKEDE sammensatte mutant, betegnet F-TrCP (m1)-E7N, blev testet for dens binding til både de endogene (IkB) og de tilsigtede (p107) knockout-mål. HeLa-celler blev transient transficeret med F-TrCP (m1)-E7N eller F-TrCP-E7N, og deres interaktioner med IkB og p107 blev bestemt ved coimmunudfældning. F-TrCP-E7N og F-TrCP udviste lignende affiniteter til det phosphorylerede IkB-protein, hvorimod forbindelsen m1 mutationer afskaffede f-TrCP(m1) – E7N binding (Fig. 3c midten). I modsætning hertil blev lignende niveauer af p107 påvist i immunokomplekserne af F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 3c lavere), hvilket indikerer, at den konstruerede F-TrCP(m1)-E7N allestedsnærværende proteinligase er fuldt funktionel til rekruttering af de tilsigtede cellulære mål. Disse resultater er i overensstemmelse med de strukturelle forudsigelser i Fig. 3b, og yderligere definere aminosyreresterne på den kritiske for endogen substratgenkendelse.

den konstruerede F-TrCP (m1)-E7N blev yderligere analyseret for dets styrke ved nedbrydning af endogen p107. C33a-celler blev cotransfected med F-TrCP, F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1)-E7N sammen med et CD19-ekspressionsplasmid. Otteogfyrre timer efter transfektion blev celler høstet og beriget for dem, der modtog de transficerede plasmider ved anvendelse af de immunomagnetiske perler konjugeret til det anti-CD19 monoklonale antistof. Endogene P107-niveauer blev efterfølgende bestemt ved immunoblotting. Som vist i Fig. 3D, ektopisk ekspression af F-TrCP (m1)-E7N resulterede i en 95% reduktion af endogene P107 niveauer, hvorimod en 82% nedregulering af p107 blev observeret for F-TrCP-E7N (Fig. 3D øvre, sammenligne baner 4 og 3). Desuden havde ekspression af F-TrCP (m1)-E7N ingen observerbar effekt på tumornekrosefaktor (TNF)-reluris induceret nedbrydning af IkB af den native SCF–Kurtrcp eller på ødelæggelse af p27kip1 af SCFSkp2 allestedsnærværende proteinligaser (data ikke vist). Derfor forstyrrer ektopisk ekspression af den konstruerede F-TrCP(m1)-E7N ikke den samlede SCF-allestedsnærværende aktivitet ved at kvæle de centrale SCF-komponenter (Skp1, CUL-1 og Rbks1/Roc1), der deles af de endogene f-boks proteiner.

målrettet P107-nedbrydning blev yderligere vurderet i individuelle c33a-celler ved indirekte immunofluorescensassay. Konsekvent blev p107 stort set udryddet i c33a-celler, der udtrykte F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1)-E7N, men ikke F-TrCP alene (Fig. 3E). Samlet set indikerer disse resultater, at den konstruerede f-TrCP(m1)-E7N allestedsnærværende proteinligase viste øget specificitet og robust proteolytisk aktivitet mod det tilsigtede mål ved at eliminere bindingsstederne for de endogene pristrcp–substrater.

minimalt Bindingsdomæne som målretning af peptid til effektiv Substratrekruttering. For at opnå høj specificitet af substratrekruttering og for at minimere uspecifik målretning af andre cellulære proteiner testede vi, om det minimale P107/RB-interaktionsdomæne af E7N (betegnet E7m), som omfatter rester 21-29 af E7, der spænder over motivet (23), kunne opnå effektiv binding og nedbrydning af p107. En kimær allestedsnærværende–proteinligase blev konstrueret, hvor pristrcp og E7m blev kovalent bundet sammen af en fleksibel 20-aa-afstandsstykke bestående af 10 kopier af Gly-Ser-gentagelser (betegnet 10gs). F-TrCP-E7N eller F-TrCP-10gs-E7m blev transient transficeret til c33a-celler, og deres binding til den endogene p107 blev vurderet ved immunudfældning i ekstrakter fremstillet efter behandling med proteasominhibitoren MG132 for at hæmme nedbrydning som en konsekvens af denne interaktion. Som vist i Fig. 4A (Bane 2 og 3), F-TrCP-10gs-E7m havde lidt øget affinitet til p107 end den oprindelige F-TrCP-E7N. F-TrCP-E7N og F-TrCP-10gs-E7m blev yderligere evalueret for deres effektivitet i P107 nedbrydning ved forbigående transfektion i c33a celler som i Fig. 3D. som vist i Fig. 4B, F-TrCP-E7N og F-TrCP-10gs-E7m inducerede op til 92% og 95% nedregulering af p107, hvilket indikerer, at den konstruerede pristrcp, der bærer det minimale P107-bindende domæne, fungerer lige så effektivt som det originale F-TrCP-E7N i nedbrydende målproteiner.

Retroviral-medieret afgivelse af den konstruerede pristrcp til vedvarende nedbrydning af endogene mål. Vi undersøgte derefter, om de konstruerede allestedsnærværende proteinligaser kunne udtrykkes stabilt for at opnå vedvarende nedbrydning af det tilsigtede mål. De HL-60 promyelocytiske leukæmiceller blev transduceret med de rekombinante retrovira, der udtrykte PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N eller kontrol-f-TrCP-E7N(RISDLYC), hvor RB/p107-bindingsstedet blev slettet (1). Inficerede celler med kromosomalt integrerede kimære F-TrCP-transgener blev isoleret ved FACS-sortering baseret på ekspression af GFP fra virusserne, og nedbrydning af den endogene p107 blev vurderet ud fra inficerede HL-60-celler enten umiddelbart efter infektion (Fig. 5A) eller efter 3 måneders dyrkning i vækstmedium (Fig. 5B). Desuden, fordi to andre medlemmer af RB-familieproteinerne, RB og p130, også udtrykkes i HL-60-celler, undersøgte vi, om en enkelt F-TrCP-E7N samtidig kan målrette nedbrydning af hele RB-familien af proteiner, der interagerer med det samme LCC-motiv af E7N. ektopisk ekspression af retroviralt transduceret F-TrCP-E7N induceret dramatisk nedregulering af den hypofosforylerede form af RB såvel som p107 (Fig. 5A) og p130 (data ikke vist) i HL-60-celler, enten umiddelbart efter infektion og FACS-sortering (Fig. 5A) eller 3 måneder efter infektion og kontinuerlig dyrkning (Fig. 5B, Bane 3). I modsætning hertil havde stabil ekspression af F-TrCP-E7N(PRISDLYC) i HL-60-celler ingen effekt på ændring af p107, RB (Fig. 5A, Bane 3) og P130 niveauer (data ikke vist). Overensstemmelse med observationen af, at F-TrCP-E7N fortrinsvis nedbryder hypofosforyleret RB i U2OS-celler (Fig. 2), reduktion af hyperphosphorylerede RB-arter ved stabil ekspression af F-TrCP-E7N var mindre udtalt sammenlignet med den for den hypofosforylerede form i HL-60 celler (Fig. 5A, sammenlign Bane 2 i pRB og pRB-P).

Ved behandling med all-trans retinsyre (atra) forlader HL-60-celler cellecyklus og gennemgår terminal differentiering. En akkumulering af hypofosforyleret RB blev observeret, hvilket tidligere blev rapporteret at bidrage til ATRA-induceret vækststop, hvorimod den hyperphosphorylerede RB ikke kunne påvises (24, 25). For at undersøge, om SCF-Kurtrcp-maskineriet også kan udnyttes under cellecyklusudgang, blev HL-60-celler, der stabilt udtrykker F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1) – E7N, behandlet med 1 liter atra i 72 timer, og nedbrydning af RB-familieproteinerne blev evalueret. HL-60-celler, der stabilt udtrykker F-TrCP-E7N, resulterede i 95%, 98% og 85% fald i henholdsvis RB -, p107-og p130-niveauer sammenlignet med celler inficeret med kontrol-pbmn-GFP-virus (Fig. 5B, Bane 2). Fordi atra også aktiverer transkription af gener under kontrol af Moloney murine leukæmivirus LTR af pBMN-GFP (26), bidrog den øgede ekspression af F-TrCP-E7N ved atra-behandling sandsynligvis yderligere til effektiv nedregulering af p107, p130 og hypofosforyleret RB (Fig. 5B).

virkningen af RB-familieproteinerne på normal cellecyklusprogression er blevet undersøgt i musembryofibroblaster med forstyrrelser i RB -, p107-og p130-gener og fundet ikke at reagere på signaler, der inducerer G1-anholdelse, såsom vækstfaktor tilbagetrækning eller DNA-skade (27, 28). Imidlertid er de kollektive virkninger af RB-familiemedlemmerne i tumorcelleproliferation ikke undersøgt på grund af manglen på effektive omvendte genetiske værktøjer. De stabile HL-60-celler, der udtrykker F-TrCP(m1) – E7N fra denne undersøgelse, tillod os at vurdere, hvordan tumorceller, der var mangelfulde for alle tre RB-familieproteiner, reagerede på G1-arrestationssignaler. I eksponentielt voksende HL-60-celler, der udtrykker F-TrCP(m1)-E7N, der inducerede konstitutiv nedbrydning af RB-familieproteinerne, blev der observeret en markant acceleration af cellecyklusprogression i sammenligning med dem inficeret af kontrol pBMN-GFP-virus (Fig. 5c venstre). Dette resultat er i overensstemmelse med den nedsatte kontrol af G1–s– overgange observeret i RB–/–, p107–/– og p130–/ – triple knockout-musembryofibroblaster (27, 28).

ATRA-behandling hæmmede G1-til-S-faseovergang i HL-60-celler inficeret af kontrol-pBMN-GFP (Fig. 5C) eller f-TrCP-E7N(PRISDLYC) – virus (data ikke vist), hvilket er i overensstemmelse med det, der blev rapporteret for uinficerede HL-60-celler (Fig. 5C) (24). En initial forsinkelse i G1-s-overgang blev også observeret i pbmn-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 celler ved 48 timer efter atra. Imidlertid kunne en fuldstændig G1-anholdelse ikke opnås på det senere stadium (72-96 h), og celler fortsatte forløbet af cellecyklusprogression (Fig. 5C). I modsætning hertil blev kontrol-pBMN-GFP / HL-60-celler alle blokeret i G1 mellem 72 og 96 h. disse observationer antyder, at F-TrCP(m1)-E7N-medieret nedbrydning af RB–familiemedlemmer forringer en sen atra-responshændelse, der er nødvendig for afslutning af vækststop, hvorimod den tidlige dæmpning af G1-s-progression stort set ikke var påvirket. Desuden blev der observeret en dramatisk reduktion i celletal mellem 72 og 96 timer efter atra-behandling på grund af massiv celledød under atra-induceret cellecyklusudgang og differentiering (29). Påfaldende viste HL-60-celler, der udtrykte F – TrCP(m1)-E7N, en gennemsnitlig stigning på 2 til 3 gange i subG1-populationerne sammenlignet med den for kontrolvirusinficerede HL– 60– celler (data ikke vist), hvilket er i overensstemmelse med den øgede celledød i RB–/–, p107–/– og p130-/ – triple knockout-mus embryonale fibroblastceller under væksthæmmende betingelser (28). Samlet set inducerede konstitutiv ekspression af F-TrCP(m1)-E7N nedregulering af hele RB-familieproteinerne, hvilket fører til en hæmning af vækststop og en stigning i celledød ved atra-behandling.

ATRA-induceret G1-anholdelse involverer koordineret regulering af flere cellulære signaler / komponenter, der negativt styrer cellecyklussen (gennemgået i ref. 30). Dimberg et al. (31) rapporterede, at ATRA udløser en sekvens af hændelser i myeloide celler, der involverer en tidlig stigning i p21vaf1-ekspression, stabilisering af p27kip1 og senere dephosphorylering af RB ved begyndelsen af G1-anholdelse. Da kristtrcp(m1)-E7N kun nedbryder RB-familiemedlemmer og ikke har nogen effekt på stabiliteten af p21vaf1 og p27kip1, er det sandsynligt, at kun det sene, RB-afhængige atra-respons påvirkes, hvilket er i overensstemmelse med modstanden af pbmn-F–TrCP(m1) – E7N/HL-60 celler for at fuldføre G1-arrestat72-96 h (Fig. 5C). Den observerede tidlige væksthæmning af ATRA ved 48 h (Fig. 5C) kan i det mindste delvis tilskrives up-reguleringen af p21vaf1 og p27kip1, hvis stabilitet ikke påvirkes af konstitutiv f-TrCP(m1)-E7N-ekspression (Fig. 2 og 5).