abstrakt

Syndecan-1 (CD138) er en transmembranproteoglycan, der vides at være udtrykt i forskellige normale og ondartede væv. Det er af interesse på grund af en mulig prognostisk rolle differentiel ekspression i tumorer og dens rolle som et mål for indatuksimab, et monoklonalt antistof kombineret med et cytotoksisk middel. For omfattende at analysere CD138 i normale og neoplastiske væv brugte vi vævsmikroarrays (TMA ‘ er) til analyse af immunhistokemisk detekterbar CD138-ekspression i 2.518 vævsprøver fra 85 forskellige tumorenheder og 76 forskellige normale vævstyper. Dataene viste, at cd138-ekspression er rigelig i tumorer. Mindst en lejlighedsvis svag CD138-immunfarvning kunne påvises i 71 af 82 (87%) forskellige tumortyper, og 58 enheder (71%) havde mindst en tumor med en stærk positivitet. I normale væv blev der fundet et særligt stærkt udtryk i normalt pladepitel af forskellige organer, bæger og søjleformede celler i mave-tarmkanalen og i hepatocytter. Den stærkt standardiserede analyse af de fleste humane kræftformer resulterede i en rangorden af tumorer i henhold til hyppigheden og niveauerne af CD138-ekspression. CD138-immunfarvning var højest i pladecellecarcinomer såsom fra spiserøret (100%), livmoderhalsen (79,5%), lunge (85,7%), vagina (89,7%) eller vulva (73,3%) og ved invasiv urotelcancer (76,2%). I adenocarcinomer var CD138 også høj i lunge (82,9%) og kolorektal cancer (85,3%), men ofte lavere i bugspytkirtlen (73,3%), mave (54,2% i tarmtype) eller prostatacarcinomer (16,3%). CD138-ekspression var normalt lav eller fraværende i kimcelletumorer, sarkomer, endokrine tumorer inklusive kræft i skjoldbruskkirtlen og neuroendokrine tumorer. Sammenfattende gør præferenceudtrykket i pladecellecarcinomer på forskellige steder disse kræftformer primære mål for anti-CD138-behandlinger, når disse muligvis bliver tilgængelige. Rigelig ekspression i mange forskellige normale væv kan dog udgøre hindringer for at udnytte CD138 som et terapeutisk mål.

1. Introduktion

Syndecan-1 (CD138) er et af fire medlemmer af syndecan-familien. Det er et celleoverfladeprotein bestående af tre strukturelle domæner, hvoraf den ene er ekstracellulær og binder heparinsulfater og chondroitinsulfater . Syndecan – 1 har relevans for Celle-Celle og celle-matrice interaktioner . Det er involveret i reguleringen af celleproliferation, migration og organisationen af cytoskelettet . I normale væv er CD138 kendt for at være udtrykt på plasmaceller og forskellige epitelcelletyper.CD138-ekspression i kræft er af potentiel klinisk interesse, da specifikke lægemidler rettet mod CD138 i øjeblikket evalueres i kliniske forsøg. I et fase II-forsøg med plasmocytom er klinisk effekt og lave bivirkninger rapporteret . I prækliniske undersøgelser viste disse antistoffer også effekt mod tredobbelt negativ brystkræft og melanom . Hvis anti-CD138-terapier skulle vise sig at være vellykkede, kan andre CD138-positive kræftformer lige så godt drage fordel af sådanne behandlinger.

ændret CD138-ekspression er blevet beskrevet i forskellige maligne tumorer. For eksempel er der rapporteret om overekspression af CD138 i bryst -, urinblære, galdeblære, bugspytkirtel, ovarie, endometrie og prostatacancer . I andre kræftformer, såsom lunge, hoved/hals, gastrisk, nyre og kolorektal cancer, CD138 ekspression viste sig at være reduceret sammenlignet med tilstødende normalt epitel . I flere af disse tumortyper var enten reduceret eller øget cd138-ekspression knyttet til ugunstig tumorfænotype og dårlig patientprognose . Tidligere undersøgelser af CD138 i kræft har anvendt forskellige reagenser og protokoller til deres immunhistokemiske farvning. Det er sandsynligvis på grund af dette, at den eksisterende litteratur er meget uoverensstemmende med hensyn til forekomsten af CD138-ekspression i forskellige tumortyper. For eksempel varierer området for den rapporterede CD138-positivitet fra 26% til 100% i urinblærecancer, fra 23% Til 89% i pladecellecancer, fra 33% til 100% i brystkræft, fra 50,5% til 87% i pladecellecarcinom i spiserøret og fra 24,7% til 89,7% i pladecellecarcinom i livmoderhalsen.

i betragtning af disse heterogene data tillader den eksisterende litteratur ikke let at bestemme disse kræftformer, hvor CD138 spiller en særlig vigtig rolle. For at sammenligne forekomsten og intensiteten af CD138-ekspression mellem tumorenheder og for at identificere disse kræftformer, der kan være optimale kandidater til anti-CD138-lægemidler, analyserede vi således mere end 2500 kræftformer og 76 normale væv ved hjælp af en standardprotokol. Til dette formål blev der anvendt en multitumorvævsmikroarray (TMA) indeholdende op til 50 forskellige tumorer fra 85 forskellige tumortyper og undertyper. Resultaterne af vores undersøgelse identificerer en bred vifte af stærkt CD138-ekspressive tumorenheder.

2. Materialer og metoder

2.1. Tissue Microarrays (TMA ‘er)

Vi brugte to forskellige sæt allerede eksisterende TMA’ er til at studere CD138-ekspression i normale humane og kræftformede humane væv. Den første TMA var sammensat af en prøve på 76 forskellige normale vævstyper (608 prøver på et dias). Den anden TMA indeholdt i alt 3.642 primære tumorer fra 85 tumortyper og undertyper. Prøverne blev fordelt på 7 forskellige TMA-blokke (indeholdende mellem 414 og 522 prøver). Sammensætningen af TMA er beskrevet i tabel 1 I resultater. Alle prøver blev afledt af arkiverne fra Institut for patologi, Universitetshospital i Hamborg (Hamborg, Tyskland). Hver TMA-blok indeholder en identisk standardkontrolsektion med 40 normale og tumorvævspletter for at kontrollere for mulig glide-til-glide-variabilitet af immunfarvning. Væv blev fikseret i 4% bufret formalin og derefter indlejret i paraffin. TMA tissue spot diameter var 0,6 mm. alle værker var i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Informeret samtykke var ikke nødvendigt.

2.2. Immunhistokemi

friskskårne TMA-sektioner blev immuniseret på en dag og i et eksperiment. Slides blev deparaffiniseret og udsat for varmeinduceret antigenudtagning i 5 minutter i en autoklave ved 121 liter C i pH 9 Dako Target Retrieval Solution buffer. Primært antistof specifikt for total Syndecan – 1 (musemonoklonalt antistof, klon JASY1, Dianova, Hamborg, Tyskland, fortynding 1 : 200) blev påført ved 37 liter C i 60 minutter. Bundet antistof blev derefter visualiseret ved hjælp af EnVision Kit (Dako, Glostrup, Danmark) i henhold til producentens anvisninger. For tumorvæv blev procentdelen af positive epithelceller estimeret, og farvningsintensiteten blev semikvantitativt registreret (0, 1+, 2+ og 3+). Til statistiske analyser blev farvningsresultaterne kategoriseret i fire grupper. Tumorer uden farvning blev betragtet som negative. Tumorer med 1 + farvningsintensitet i kvit 70% af cellerne og 2 + intensitet i kvit 30% af cellerne blev betragtet som svagt positive. Tumorer med 1 + farvningsintensitet i > 70% af cellerne, 2+ intensitet i 30% til 70% eller 3+ intensitet i liter 30% blev betragtet som moderat positive. Tumorer med 2 + intensitet i >70% eller 3+ intensitet i > 30% af cellerne blev betragtet som stærkt positive. Disse kategorier repræsenterer standard cutoffs, som andre og os har brugt i adskillige IHC-undersøgelser .

3. Resultater

3.1. Tekniske problemer

i alt 2.518 (69%) af de 3.642 tumorvævsprøver kunne fortolkes i vores TMA-analyse. Årsager til analysefejl omfattede en brøkdel af manglende prøver eller prøver, der manglede utvetydige tumorceller. Et tilstrækkeligt antal prøver var analyserbare for alle 76 normale vævstyper, der muliggør en fuldstændig normal vævsvurdering.

3.2. Syndecan – 1 i normalt væv

alle positive CD138-immunbeholdere i normalt væv er opsummeret i tabel 2. CD138 blev rigeligt udtrykt, hovedsagelig i forskellige epitelcelletyper. Et særligt stærkt udtryk for CD138 blev observeret i pladeepitelceller i forskellige organer (Figur 1(a)), bægerceller i mave-tarmkanalen (Figur 1(b)), søjleceller i galdeblæren (Figur 1(c)) og hepatocytter (Figur 1(d)). Der blev ikke påvist nogen cd138-farvning i følgende væv: aorta/intima, aorta/medier, hjerte (venstre ventrikel), skeletmuskulatur, skeletmuskulatur/tunge, myometrium, muskelvægsbilag, spiserør, mave, ileum, kolon nedstigninger, nyrebækkenet og urinblære, penis (glans/corpus spongiosum), æggestok (stroma), fedtvæv (hvid), milt, thymus, æggestok (corpus luteum), æggestok (follikulær cyste), skjoldbruskkirtel, cerebellum, cerebrum, hypofyse (posterior lob), hypofyse (anterior lob) og knoglemarv.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 1

repræsentative billeder af CD138 immunfarvning i normale og tumorvæv: (a) normal lever, (b) hepatocellulært carcinom, (c) normal spiserør, (d) pladecellecarcinom i spiserøret, (e) tyktarmsadenom og (f) tyktarmskræft.

3.3. CD138 i tumorvæv

immunfarvning var overvejende membranøs, men undertiden også i cytoplasmaet. Lejlighedsvis stroma-farvning forekom også, men blev ignoreret for denne analyse. CD138-positivitet blev set i 1.118 af 2.518 analyserbare tumorer (tabel 1). CD138 immunfarvning blev betragtet som svag i 330 (13%), moderat i 226 (9%) og stærk i 562 tumorer (22%). Repræsentative tumorvævspletter med CD138-ekspression er vist i Figur 1(e) og 1(h) . Mindst nogle CD138-ekspression kunne detekteres i 75 af 85 (88%) af vores tumorkategorier, herunder 60 (71%) kategorier, hvor mindst en tumor viste en stærk positivitet (tabel 1). Tumortyperne, hvor nogle CD138 blev set i alle analyserede tilfælde, omfattede basalcelleadenom, tyktarmsadenom, pladecarcinom i spiserøret, granulær celletumor og ovarie Brenner-tumor. En særlig signifikant cd138-ekspression blev også påvist i analkarcinom (90,9%), pladecarcinom i huden (92,9%), hepatocellulært carcinom (97,7%), phyllodes carcinom i brystet (94,4%) og i Vortetynd tumor i parotis (92,7%). Tumortyper med en særlig lav eller fraværende cd138-immunfarvning omfattede testikulære kimcelletumorer, flere sarkomer, melanom, ondartet mesotheliom og småcellet urinblærekarcinom.

4. Diskussion

resultaterne af denne undersøgelse giver et omfattende overblik over Syndecan-1-ekspression i humane tumorer. Dataene viser, at—på tværs af alle oprindelsesorganer-pladecellecarcinomer (og urotel) er særligt tilbøjelige til at udtrykke Syndecan-1, ofte på høje niveauer. Selvom adenocarcinomer afledt af tyktarmen og lungen også er høje Ekspres, synes CD138 immunfarvning generelt at være mindre intens og mindre hyppig i adenocarcinomer. Dette er bedst synligt i organer, hvor både adenocarcinomer og pladecellecarcinomer forekommer som i livmoderhalsen og i spiserøret. Pladecelleovervejelsen af CD138-ekspression bliver endda tydelig i kræftformer med identisk patogenese, såsom livmoderhalskræft, oral kræft eller pladecellecarcinom i anus, som ofte er humant papillomavirus forbundet. Klinisk vigtige kræftformer med lave til mellemliggende frekvenser og niveauer af CD138-ekspression inkluderer kræft i nyrerne og endometrium, mens lave frekvenser af positivitet blev fundet i prostatacancer, endokrine tumorer inklusive kræft i skjoldbruskkirtlen, og neuroendokrine tumorer såvel som kimcellecancer. På trods af nogle outliers er vores data stort set i overensstemmelse med litteraturen. Flere andre efterforskere havde tidligere beskrevet særligt høje niveauer af CD138-ekspression i pladecellecancer .

den standardiserede vurdering af 85 forskellige tumortyper og undertyper gjorde det muligt for os at definere en rangordningsrækkefølge med hensyn til niveauet af CD138-ekspression i kræft. Vi mener, at disse data er særligt nyttige for disse tumortyper, for hvilke tidligere data havde været delvist uoverensstemmende. Undersøgelsen gav også information om en række relevante tumortyper, for hvilke CD138-data hidtil manglede. Disse inkluderer for eksempel pladecellecarcinom i vulva og analkanalen, adenocarcinom i spiserøret, seminom, embryonalt karcinom og æggesæk tumor i testiklerne, småcellet blærekræft, neuroendokrine tumorer i bugspytkirtlen, feokromocytom, thymom, gastrointestinal stroma tumor (GIST), angiosarcoma og leiomyosarcoma. I øvrigt, subtype-specifikke data blev opnået for flere tumortyper, for hvilke tidligere analyser blev udført på tumorkohorter med mindre detaljerede oplysninger om tumormorfologi såsom urothelial carcinom, bryst, endometrium, og kræft i æggestokkene. Disse data repræsenterer således et andet eksempel på egnetheden af TMA ‘ er sammensat af prøver af mange forskellige tumortyper og normale væv til omfattende karakterisering af en biomarkør eller antistof (demonstration af vores data sammenlignet med tidligere undersøgelser er vist i figur 2) .

figur 2

oversigt over CD138-ekspression i tumorvæv fra forskellige undersøgelser rangeret efter den foreliggende undersøgelse (Røde Kors), prikker til undersøgelser med subtype-specifikke data, firkanter til undersøgelser uden subtype-specifikke data og farvekode angiver antallet af tumorer inkluderet i tidligere undersøgelser: rød: <10, gul: 10-25 og sort: >25.

forskellige tidligere undersøgelser har foreslået et link til dårligt patientresultat for enten øget eller nedsat Syndecan-1 niveauer . CD138-protein kan have tumorundertrykkende og tumorfremmende funktioner, der afhænger af tumoren . Vores tumorkohorte var blottet for enhver tumorstadium eller klinisk resultatinformation. Indirekte bevis for en variabel rolle for differentiel CD138-ekspression for tumorprogression kommer imidlertid fra sammenligningen af relaterede tumorundertyper. For eksempel argumenterer de lavere ekspressionsniveauer af CD138 i kolorektal adenocarcinom og i invasivt urotelkarcinom (pT2-4) sammenlignet med kolonadenomer og ikke-invasive blæretumorer (pTa) for et tab af CD138 parallelt tumorprogression i disse tumorer. Den lavere ekspression af CD138 i chromophobe nyrekarcinom sammenlignet med dets godartede modstykke oncocytom kan også ses som et argument for, at CD138-nedregulering er knyttet til tumor aggressivitet i disse nyrekræft afledt af den distale nefron tubulus. Imidlertid antyder højere niveauer af CD138-ekspression i det kortikale binyrekarcinom end i binyreadenom, at øgede CD138-niveauer kan ledsage progression i disse tumorer.

CD138 er et membranprotein og som sådan et potentielt mål for antistofterapeutika. Der er bestræbelser på at udvikle en passende terapi til CD138-positive kræftformer. CD138 blev vist at være overudtrykt på overfladen af multipelt myelomceller, som anvendes i en præklinisk undersøgelse til en antitumoral behandling med indatuksimab, et monoklonalt antistof kombineret med et cytotoksisk middel, som i øjeblikket evalueres i prækliniske undersøgelser af plasmacytom og triple-negativ brystkræft i kombination med andre lægemidler . Baseret på vores data fremkommer pladecellecarcinomer, uanset deres oprindelsessted, som yderligere mulige kandidater til anti-CD138-behandling, når en sådan behandling skal vise sig at være effektiv og blive tilgængelig. Den rigelige ekspression af CD138 i forskellige normale væv inklusive pladeepitel fra forskellige forskellige organer identificerer forskellige steder, hvor potentielle bivirkninger af disse terapier kan opstå.CD138 ekspressionsanalyse anvendes i øjeblikket i rutinemæssig diagnostisk patologi til at skelne og kvantificere plasmaceller, for eksempel i knoglemarven og i endometriebiopsier, hvor tilstedeværelsen af plasmaceller indikerer kronisk endometritis. Bortset fra to mulige undtagelser, vores data giver lidt bevis for Syndecan-1 ekspressionsanalyse, der giver diagnostiske spor i vanskelige diagnostiske situationer. Den lave ekspression i mesotheliom sammenlignet med den høje forekomst af stærk ekspression i lungeadenocarcinom antyder, at Syndecan-1 potentielt kunne føjes til den lange liste over antistoffer, der hjælper med at skelne mellem disse tumorenheder. En lav frekvens af Syndecan – 1-ekspression (10%) er for nylig også blevet beskrevet for peritoneal mesotheliom . Desuden var CD138 markant højere i hepatocellulært carcinom sammenlignet med cholangiocellulært carcinom i leveren. Imidlertid er andre antistoffer som for eksempel arginase eller BSEP bedre separatorer af disse tumorenheder .

det er en begrænsning af denne undersøgelse, at immunhistokemi nærmer sig, især når man bruger lysfeltvisualisering, ikke er optimale til proteinkvantificering. Det er vigtigt, at manglen på immunfarvning ikke udelukker et biologisk relevant CD138-udtryk i “negative” normale eller neoplastiske celler. Hver protokol definerer en detektionstærskel under hvilke væv betragtes som negative. Over denne detektionsgrænse muliggør farvningsintensiteten en vis kvantificering af proteiner, men dette er begrænset af en maksimal intensitetsfarvning, som ikke kan ses stærkere i tilfælde af endnu højere proteinekspressionsniveauer. Desuden var lejlighedsvis stromalfarvning blevet ignoreret i vores undersøgelse, skønt andre og os har vist, at der er bevis for en klinisk relevant rolle af CD138-ekspression i den tumorassocierede stroma . Imidlertid, stroma-farvning er sjælden og ville kræve større prøvetal pr.kræfttype for en meningsfuld analyse.

sammenfattende giver denne undersøgelse et omfattende overblik over CD138-ekspression i humane tumorer. Præferenceekspressionen i pladecellecarcinomer på forskellige steder gør disse kræftformer til primære mål for anti-CD138-behandlinger, når disse muligvis bliver tilgængelige. Rigelig ekspression i mange forskellige normale væv kan dog udgøre hindringer for at udnytte CD138 som et terapeutisk mål.

datatilgængelighed

de immunhistokemiske data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen.

interessekonflikter

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt med hensyn til offentliggørelsen af dette papir.

forfatterens bidrag

JI, DP, C H-M, GS, RS, CM og C M-K udtænkt og designet undersøgelsen, analyserede dataene og udarbejdede manuskriptet. SV, CF, og SK udførte de fleste af de vigtigste immunhistokemiske analyser. GS, SK og RS var involveret i den oprindelige opfattelse af undersøgelsen. TC, FB, FJ og C H-M leverede dataene. VC, al, AH, DH, GS, SK og KM deltog i vævsbehandling, patologisk diagnose og immunhistokemisk analyse. DD, AB, CG, AM, GS og RS leverede materialerne, klinisk opfølgningsdata og teknisk assistance. Alle forfattere har læst og godkendt manuskriptet.