resultater

vi vurderede først, om CD63 og H, K-ATPase befinder sig i det samme subcellulære rum i gastriske parietalceller. Tidligere arbejde har vist, at rotte parietalceller udtrykker høje niveauer af CD63 (22). Immunofluorescensmikroskopi på frosne sektioner af rottemaven indikerer, at CD63 er til stede i de fleste celler i rottemaven, inklusive parietalceller (Fig. 1A). CD63 kolokaliseres delvist med HKa i parietalceller. Derudover analyserede vi et stærkt oprenset TVE-præparat fra hog mave (en venlig gave fra C. T. Okamoto). H, K-ATPase bidrager med 50% af proteinindholdet i lignende præparater (23). Vestlig blot-analyse indikerer, at CD63 er rigeligt til stede i dette oprensede præparat af tv ‘ er (Fig. 1B).

for at undersøge en mulig in situ-interaktion mellem CD63 og H,K-ATPase udførte vi nedtrækningseksperimenter ved hjælp af biotinyleret tomatlektin. Tidligere undersøgelser har vist, at dette lectin binder specifikt og entydigt til HK-karret i gastriske præparater (24-27). Vi blottede et TVE-præparat med anti-HK Kurt mAb og biotinyleret tomatlektin for at bekræfte, at lektinet associeres specifikt med den glycosylerede HK-Kurt (Fig. 1C). Vi brugte derefter biotinyleret tomatlektin til at isolere proteiner, der interagerer med HK-Kruset i TVE-præparatet. Vestlig blot analyse indikerer, at CD63 udfældes af tomat lectin (Fig. 1D), der viser, at CD63 og H, K-ATPase associerer in situ og antyder, at denne tilknytning kan være fysiologisk relevant. Forbehandling af TVE-præparatet med 4% SDS efterfulgt af en 20 gange fortynding i lysisbuffer reducerede signifikant mængden af CD63, der blev udfældet. Mængden af HK-kur, der blev udfældet, blev ikke ændret ved denne behandling (data ikke vist). Disse data tyder på, at tilstedeværelsen af CD63 i nedtrapningen kan henføres til dens tilknytning til HK-kursen og ikke til en direkte sammenhæng mellem CD63 og tomatlektin.

for at undersøge den funktionelle betydning af interaktionen mellem CD63 og HK-Karten yderligere transficerede vi COS-7-celler med en cDNA, der koder for kanin HK Karru enten enkeltvis eller sammen med en cDNA, der koder for en FLAG-mærket CD63-konstruktion (CD63-FL). Vi har vist, at hk ‘en ikke behøver at samle sig med HKa’ en for at nå celleoverfladen i transficerede COS-celler (20). Vi brugte en CD63-konstruktion, der bærer et flag-epitopmærke på sin N-terminal, fordi C-terminalen på CD63 indeholder et tyrosinbaseret motiv, der kræves til intracellulær handel med denne tetraspanin (13).

COS-celler cotransfekteret med HK ‘ en og CD63-FL blev udsat for immunudfældning ved anvendelse af en anti-FLAG pAb. Vestlig blot-analyse af det immunopræcipiterede materiale indikerer, at hk-Larsen coprecipiterer med CD63 (Fig. 2, hk kr + CD63-FL). CD63-FL-og HK-proteinerne coimmunopræcipiterer i en række vaskemidler, herunder 2% CHAPS, 1% Brij 96 og 1% Triton H-100. Forbindelsen mellem CD63 og HK-Karsten udgør et af de få beskrevne tetraspaninkomplekser, der overlever opløseliggørelse i Triton H-100 og repræsenterer således sandsynligvis en direkte interaktion (28). Karrus-underenheden har to former: karrus (moden), som er modificeret med komplekse kulhydrater, og karrus (kerne), som er modificeret med kulhydrater med høj mannose (29). Begge former coprecipitate med CD63, skønt forholdet mellem KRP og KRP i bundfaldet varierer som en funktion af opløsningsbetingelserne.

HK-kranen blev ikke detekteret i FLAG-immunudfældningerne udført på celler transficeret med HK-kranen alene, hvilket viser, at FLAG-pAb ikke interagerer med kr-underenheden (Fig. 2, hk). HK-kroen coimmunopræcipiterer ikke med FLAG pAb fra en blanding (50: 50, vol/vol) af lysater fremstillet ud fra celler, der er transficeret enkeltvis med CD63-FL og Purpur-underenheden, hvilket bekræfter, at interaktionen forekommer in vivo (Fig. 2, anden bane). Prøver, der inkuberes med FLAG pAb, udfælder ikke den lysosomale proteinlampe-1, hvilket indikerer, at interaktionen mellem CD63-FL og HK-Larsen er specifik og ikke en artefakt af ufuldstændig opløseliggørelse af CD63-rummet (Fig. 2).

Vi undersøgte derefter, om interaktionen mellem HK ‘en og CD63’ en påvirker den subcellulære lokalisering af karrus-underenheden. HK-kursen er til stede ved celleoverfladen i forbigående transficerede COS-celler (Fig. 3 A-C). Der er en markant omfordeling af den karrus-underenhed til intracellulære cd63-holdige vesikler, når COS-celler cotransfekteres med både HK-Karrus og CD63-FL (Fig. 3 D-F). For at udelukke muligheden for, at denne ændrede lokalisering kunne være en uspecifik effekt af CD63-overekspression, undersøgte vi effekten af CD63-udtryk på fordelingen af AKV4. AKP4 er en vandkanal, der er til stede i de basolaterale plasmamembraner i parietalceller. Det gennemgår ikke reguleret endocytose og eksocytose med H,K-ATPase (30, 31). Denne kanal coimmunopræcipiterer ikke med CD63-FL i et Triton 100 lysat af cotransfected COS-celler (Fig. 4A). Når cotransfekterede celler visualiseres ved immunofluorescens konfokal mikroskopi, er AKP4 ikke til stede i det CD63-holdige rum (Fig. 4B), hvilket indikerer, at CD63-induceret omfordeling til intracellulære vesikler er specifik for proteiner, der interagerer med dette tetraspanin.

for at undersøge mekanismerne i den CD63-medierede omfordeling af HK-Kristen udnyttede vi det nylige arbejde, der har karakteriseret den intracellulære handel med CD63. Rous et al. (13) påvist, at det tyrosinbaserede motiv, der er til stede ved den ekstreme C-terminal af CD63, interagerer med adapterunderenhederne L. R. 2 og L. 3. Prirus2-proteinet er et medlem af det heterotetramiske AP-2-kompleks. Dette kompleks er til stede ved plasmamembranen og forbinder lastproteiner med clathrin-kappen og medierer deres endocytose (14). Pri3-proteinet er et medlem af det heterotetramiske AP-3-kompleks. Dette kompleks deltager i lysosomal målretning og findes både i trans-Golgi-netværket og i et vesikulært rum, der delvist kolokaliserer med endosomer (12). Når det yevm tyrosinbaserede motiv af CD63 er muteret til AEVM, er CD63 ikke i stand til at interagere med hverken lyr2 eller lyr3 og udtrykkes primært på celleoverfladen (13). Når HK-kursen udtrykkes sammen med den FLAGMÆRKEDE CD63-AEVM-konstruktion, fordeles både CD63-Aevm og kurr-underenheden på celleoverfladen (Fig. 3 G-I). Således påvirkes den intracellulære fordeling af HK Kros af menneskehandlingssignaler indlejret i den CD63 cytoplasmatiske hale.

Når yevm-sekvensen i halen af CD63 muteres til YEVI, fortsætter det modificerede motiv med at interagere med lyr3, men forbinder ikke længere med lyr2 (13). CD63-YEVI er lokaliseret primært til det sene endosomale lysosomale rum, sandsynligvis fordi det ændrede tetraspaninprotein bevæger sig direkte til dette rum efter dets indledende biosyntetiske passage gennem Golgi (13). Den lille population af CD63-YEVI, der når plasmamembranen, udviser nedsat internalisering, fordi den ikke længere kan interagere med kr2 (13). Når HK Krist og en FLAG-mærket CD63-YEVI-konstruktion er coudtrykt i COS–celler, er meget af CD63-YEVI lokaliseret til det sene endosomale-lysosomale rum; imidlertid forbliver karrus-underenheden på celleoverfladen og omfordeles ikke til et intracellulært rum (Fig. 3 J-L). Coimmunoprecipitation analyse bekræfter, at hk kur kan associere med både CD63-YEVI og CD63-aevm (data ikke vist). Disse data antyder, at disse proteiner skal interagere ved celleoverfladen og endocytoseres som et kompleks for at hk-Larsen kan distribueres til et CD63-positivt intracellulært rum.

for at bestemme, om HK-Larsen detekteret i intracellulære vesikler svarer til protein, der blev endocytoseret fra overfladen af cellen, observerede vi internaliseringen af karrus-underenheden i nærvær og fravær af eksogen cd63-ekspression. COS-celler blev cotransfected med HK-karret og CD63-FL. Cellerne blev derefter afkølet til 4 liter C for at stoppe endocytose og overflade mærket med HK liter mAb. De mærkede celler blev inkuberet ved 37 liter C i 40 minutter for at tillade endocytose at genoptage. Efter inkubationen blev cellerne afkølet til 4 liter C og overflade mærket med Cy5-konjugeret ged anti-mus IgG. Celler blev fikseret og inkuberet med anti-FLAG pAb og blev derefter mærket med både fluoresceinisothiocyanat-konjugeret ged anti-mus IgG og rhodamin-konjugeret ged anti-kanin IgG. Således blev HK-kursen, der forblev på overfladen, visualiseret på Cy5-kanalen, internaliseret HK-kur blev visualiseret på fluoresceinisothiocyanatkanalen, og CD63-FL blev visualiseret på rhodaminkanalen. Denne analyse demonstrerede, at internaliseret karrus-underenhed kolokaliseres med CD63, hvilket antyder, at puljen af HK-Karrus, der er kolokaliseret med CD63, er afledt gennem endocytose fra cellemembranen (Fig. 5 E-H). Celler, der ikke overudtrykker CD63, udviser meget mindre internaliseret kur-underenhed efter en 40-min inkubation (Fig. 5 A-D).

for at kvantificere internaliseringen af HK-kranen og kontrollere yderligere, at hk-kranen og CD63 associeres ved overfladen af cellen, udførte vi celleoverfladebiotinyleringseksperimenter. I det første forsøg blev cos-celler transfekteret med den alene og biotinyleret med biotin-SS-n-hydroksysuccinimidester ved 4 C. Duplicate prøver blev derefter inkuberet ved 37 C i forskellige længder af tid til at tillade endocytose at genoptage. Celler blev returneret til 4 liter C, og en plade fra hvert tidspunkt blev strippet af det resterende celleoverfladebiotin ved eksponering for det membranimpermante reduktionsmiddel MesNa. Cellerne blev lyseret og inkuberet med streptavidinperler. Proteiner, der var forbundet med streptavidin-perlerne, blev adskilt af SDS/PAGE, og membranerne blev undersøgt med HK-Kurt-mAb (Fig. 6A). Fraktionen af kurp-underenhed på celleoverfladen ændrer sig ikke mærkbart, når 37-internaliseringen af kurp C fortsætter. Efter den første 10 min, en lille brøkdel af den overflademærkede HK-Krar sekvestreres inde i cellen, og forholdet mellem overflade og internaliseret HK-Krar forbliver højt. Disse data tyder på, at det ikke er forbundet med CD63-underenhed enten internaliserer meget langsomt eller internaliseres, men genbruges hurtigt tilbage til overfladen, ligesom transferrinreceptoren.

Vi forsøgte næste gang at karakterisere HK ‘ s opførsel, der forbinder med CD63. COS-celler blev cotransfected med HK-karret og CD63-FL. Cellerne blev biotinyleret og strippet som beskrevet ovenfor. For at isolere populationen af HK-kursen, der er forbundet med CD63, blev cellelysatet inkuberet med FLAG-pAb og protein-A-konjugerede agaroseperler. Det immunopræcipiterede materiale blev elueret med en lille mængde buffer indeholdende 3% SDS, fortyndet 30 gange med 1% Triton H-100 og inkuberet med streptavidinperler. Proteiner, der var forbundet med streptavidin-perlerne, blev adskilt af SDS/PAGE og probet med HK-Kurt-mAb (Fig. 6B). For celler, der ikke blev udsat for en strippingsprotokol, repræsenterer signalet detekteret i denne vestlige plet den samlede pulje af overflademærkede larr-underenhed forbundet med CD63, inklusive komplekser, der stadig var ved plasmamembranen og komplekser, der var blevet internaliseret i vesikler. For celler, der blev udsat for en strippingsprotokol, repræsenterer signalet populationen af Kris-underenhed associeret med CD63, der var til stede ved celleoverfladen under biotinylering og blev efterfølgende internaliseret og beskyttet mod MesNa-strimlen.

på 0-min-tidspunktet detekteres biotinyleret HK-Karr let i Anti-FLAG-immunopræcipitater fra ikke-strippede celler, hvilket viser, at hk-Karr og CD63 er i stand til at associeres ved celleoverfladen. Alle de biotinylerede HK-Kurter, der er genvundet på 0-min-tidspunktet, er følsomme over for MesNa-strimlen. Mængden af CD63-associeret, biotinyleret LARP-underenhed beskyttet mod MesNa-reagenset øges, efterhånden som cellerne får lov til at inkubere ved 37 larp C. Faktisk er mængden af HK-LARP, der er til stede på overfladen og forbundet med CD63 ved 0 min, omtrent den samme som mængden af HK-LARP, der er forbundet med CD63 og beskyttet mod stripping ved 45 min. Disse fund tyder på, at den underenhed, der er forbundet med CD63, er internaliseret og ikke vender tilbage til celleoverfladen.