svampen Candida guilliermondii er bredt fordelt i naturen, inklusive den humane mikrobiota i huden og slimhindeoverfladerne.22 selvom denne art viser en reduceret virulens sammenlignet med andre Candida-arter,3 betragtes den i øjeblikket som et voksende patogen med en stor forekomst i Latinamerika.18C. guilliermondii er blevet anerkendt som det etiologiske middel til en lang række kliniske infektioner, herunder formidlede infektioner hovedsageligt hos immunkompromitterede patienter,22 og nosokomiale udbrud hos kirurgiske patienter med intravaskulære enheder.13 i øjeblikket inkluderer den anbefalede behandling for invasiv candidiasis hos neutropeniske patienter caspofungin (CFG) eller micafungin (MFG) som førstelinjeterapier, hvor liposomal amphotericin B (LAMB) og anidulafungin (afg) er alternativer, mens FLC kun anbefales, når følsomheden over for dette lægemiddel er bekræftet.23 imidlertid har flere undersøgelser vist,at C. guilliermondii har en nedsat følsomhed over for FLC8,15, 19, og terapeutiske svigt forbundet med isolater med høje amfotericin B (AMB) minimale hæmmende koncentrationer (MICs) er rapporteret.9,12,24 selvom næsten 90% af isolaterne viser echinocandinmic ‘er,der er lig med eller lavere end kliniske breakpoints (CBP) af følsomhed (2 liter/ml), 17 svarende til andre arter af Candida, såsom C. parapsilosis, viser nogle isolater af C. guilliermondii Mic’ er betydeligt høje.8,15 tilgængelige data vedrørende afg-effekten ved invasiv candidiasis er begrænsede, og lægemidlets potentielle rolle i den kliniske praksis er dårligt kendt.23 i denne sammenhæng kan dyreforsøg spille en vigtig rolle for en bedre forståelse af in vitro–in vivo-korrelationen.11 Derfor var vores hovedmål at evaluere AFG ‘ s in vitro-og in vivo-aktiviteter mod forskellige isolater af C. guilliermondii og sammenligne resultaterne med AMB og FLC.
materialer og metodersvampeisolater
fire kliniske isolater af C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 og UTHSC 10-3207) blev anvendt i In vitro-undersøgelsen, og to af dem (UTHSC 11-685 og UTHSC 11-142) blev udvalgt til den murine model på grundlag af deres forskellige in vitro-modtagelighed. Isolaterne blev identificeret ved sekventering af det interne transkriberede afstandsstykke (ITS)–regionen og D1-D2-domænerne i rRNA, sammenligning af sekvenserne med dem af typen stamme af denne art.
In vitro-studier
in vitro-følsomheden af de fire stammer over for AMB, FLC og afg blev evalueret ved hjælp af en referencebuljongmikrofortyndingsmetode,hvor 6Candida parapsilosis ATCC 22019 og Candida krusei ATCC 6258 blev inkluderet som kvalitetskontrol.
time-kill kurver blev udviklet for alle stammer ifølge tidligere undersøgelser.5,20 kort sagt blev der fremstillet en stamopløsning af hvert svampedræbende middel, AMB (Sigma–Aldrich Co., St. Louis, USA) og AFG. Spanien) blev opløst i dimethylsulfoksid og FLC., Madrid, Spanien) i destilleret vand. Yderligere blev lægemiddelfortyndinger fremstillet i 9 ml standard RPMI 1640-medium for at opnå koncentrationer af 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 32 mg / ml af hvert lægemiddel. Isolaterne blev subkultureret ved 35 liter C i 24 timer på kartoffeldestrose agar (PDA) plader. Kulturer af C. guilliermondii blev suspenderet i sterilt saltvand, og de resulterende suspensioner blev justeret ved 5 liter 106 kolonidannende enheder (CFU)/ml ved hæmocytometertællinger og ved seriel plating på PDA for at bekræfte levedygtigheden. Fortyndinger og kontroller (stoffri) blev inokuleret med 1 ml af svampesuspensionerne, hvilket resulterede i et startinokulum på 5 liter 105 cfu / ml og inkuberet ved 35 liter C. en alikvot på 100 liter fra hvert rør blev opsamlet ved 0, 2, 4, 6, 8, 24, og 48 timer efter podning og fortyndet i destilleret vand; 30 liter af dem blev dyrket på PDA-plader og inkuberet ved 35 liter C i 48 timer til CFU/ml bestemmelse. Et CFU-fald på 99,9% eller 3 log10-enhed sammenlignet med start af inokulum blev betragtet som fungicid, mens en reduktion på
log10-enhed blev betragtet som fungistatisk. Detektionsgrænsen var 50CFU / ml. Alle time-kill kurve undersøgelser blev udført i duplicate.In vivo undersøgelser
han af-1 mus (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Spanien) med en gennemsnitlig vægt på 30 g blev anvendt i eksperimentet. Mus blev anbragt i standardkasser med fri adgang til mad og vand. Alle dyreprocedurer blev overvåget og godkendt af Universitat Rovira i Virgili Udvalget for dyrevelfærd og etik.
mus blev gengivet neutropenisk en dag før infektion ved en intraperitoneal (i.p.) injektion af 200 mg / kg cyclophosphamid (Genoksal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Spanien) plus en intravenøs (i.v.) injektion af 5-fluorouracil (fluorouracil; Ferrer Farma SA, Barcelona, Spanien) ved 150 mg/kg.10,14 dagen for infektion, mus blev udfordret i. V.med 1 liter 108cfu/dyr af hver af de to stammer af C. guilliermondii, UTHSC 11-685 og UTHSC 11-142, i 0,2 ml steril saltvand i den laterale halevene.3,4
grupper på otte dyr blev tilfældigt etableret for hver stamme og lægemiddel. Amfotericin B (AMBd) i doser på 0,8 mg/kg i.V. en gang dagligt liposomal amphotericin B (LAMB) (Gilead Sciences S. A., Madrid, Spanien) ved 10mg / kg i.V., Madrid, Spanien) ved 25 mg/kg oralt (p.O.) ved sonde, to gange dagligt (BID); og afg (Ecalta; Pfisator Ltd. 10 mg / kg legemsvægt / dosis i. p., KD. Alle behandlinger begyndte 24 timer efter udfordring og varede i 7 dage. Kontrol fik ingen behandling. For at forhindre bakterieinfektioner modtog alle mus 5 mg/kg dag ceftasidim subkutant fra dag 1 til 7 efter infektion. Mus blev kontrolleret dagligt og blev aflivet på dag 8 efter infektion med CO2-iltmangel. Effekten af hvert lægemiddel blev evalueret ved reduktion af vævsbyrden og histopatologiske undersøgelser. Nyrer blev aseptisk fjernet, og en af dem blev vejet og homogeniseret i 2 ml sterilt saltvand. Serielle 10 gange fortyndinger af homogenaterne blev belagt på PDA og inkuberet i 48 timer ved 35 liter C til CFU/g-beregning. Til histopatologistudiet blev den resterende nyre fikseret med 10% bufret formalin, dehydreret, paraffin indlejret og skåret i 2 liter sektioner, som blev farvet med hæmatoksylin–eosin (H-E) og periodisk syre-Schiff (PAS) plet til undersøgelse ved lysmikroskopi.statistikker fra væv blev analyseret ved hjælp af Mann–Hvidney U-test ved hjælp af Graph Pad Prism 4.0 til vinduer (GraphPad, San Diego, CA, USA). Når p-værdier var under 0,05, blev forskellene betragtet som statistisk signifikante.
Resultaterin vitro–studier
MICs af AMB var 0,25–1 liter/ml, 0,06–0,25 liter/ml for AFG og 0,5-1 liter / ml for FLC. Efter afskæringerne af modtagelighed for AMB, FLC og afg mod C. guilliermondii var 16 Alle isolater modtagelige for de tre lægemidler. Kvalitetskontrolstammer modtagelighed var inden for de accepterede intervaller.6
den dræbende kinetik af AMB viste en hurtig fungicid aktivitet, der steg med lægemiddelkoncentration. Ved koncentrationer svarende til MIC viste dette lægemiddel en fungicid virkning mod tre af de fire testede isolater (Fig. 1). Denne aktivitet startede umiddelbart efter inokulation i koncentrationer over 1 liter/ml, hvor det fungicide endepunkt blev nået efter 4 timer ved 32 liter/ml. AFG ved koncentrationer over 0,5 liter/ml viste fungicid aktivitet startende efter 4 timers inkubation. Det fungicide endepunkt blev nået ved 12-24 timers inkubation ved 32 kg/ml (Fig. 2). FLC viste fungistatisk aktivitet mod alle fire isolater (Fig. 3).
Tidsdrabende kinetikassays af AMB mod fire stammer af C. guilliermondii. (■) Til 0,03 µg/ml (▴) på 0,12 µg/ml (□) på 0,5 µg/ml (○) 1µg/ml (Δ) 2µg/ml (▿) 8µg/ml (♦) 32µg/ml (●) kontrol. Stiplede linjer repræsenterer et CFU-fald på 3log10 enheder i vækst sammenlignet med det indledende inokulum (fungicid aktivitet), stiplede linjer angiver testens kvantificeringsgrænse.
Tidsdrabende kinetikassays af AFG mod fire stammer af C. guilliermondii. (■) Til 0,03 µg/ml (▴) på 0,12 µg/ml (□) på 0,5 µg/ml (○) 1µg/ml (Δ) 2µg/ml (▿) 8µg/ml (♦) 32µg/ml (●) kontrol. Stiplede linjer repræsenterer et CFU-fald på 3 log10 enheder i vækst sammenlignet med det indledende inokulum (fungicid aktivitet), stiplede linjer angiver testens kvantificeringsgrænse.
Tidsdrabende kinetikassays af AFG mod fire stammer af C. guilliermondii. (■) Til 0,03 µg/ml (▴) på 0,12 µg/ml (□) på 0,5 µg/ml (○) 1µg/ml (Δ) 2µg/ml (▿) 8µg/ml (♦) 32µg/ml (●) kontrol. Stiplede linjer repræsenterer et CFU-fald på 3 log10 enheder i vækst sammenlignet med det indledende inokulum (fungicid aktivitet), stiplede linjer angiver testens kvantificeringsgrænse.
Tidsdrabende kinetikassays af FLC mod fire stammer af C. guilliermondii. (■) Til 0,03 µg/mL (▴) på 0,12 µg/ml (□) på 0,5 µg/ml (●) 1µg/ml (Δ) 2µg/ml (▿)8µg/ml (♦) 32µg/ml (●) kontrol. Stiplede linjer repræsenterer et CFU-fald på 3log10 enheder i vækst sammenlignet med det indledende inokulum (fungicid aktivitet), stiplede linjer angiver testens kvantificeringsgrænse.
In vivo-studier
lam ved 10 mg / kg var det eneste lægemiddel, der var i stand til at reducere svampebelastningen i nyrer hos mus inficeret med hver af de to stammer, idet reduktionen var signifikant højere end for de andre terapier (p kur 0,04). AMBd og FLC var kun i stand til at reducere vævsbyrden hos mus inficeret med den stamme, der viste de laveste Mikrofoner for disse to lægemidler, dvs.0,25 larg/ml for AMB og 0,5 larg/ml for FLC (p-larg 0,008). I tilfælde af afg var svampebelastningsreduktionen beskeden og lavere end for AMBd, og den reducerede signifikant vævsbyrden i nyre kun med hensyn til kontrolgruppe for Stamme UTHSC 11-685 (P=0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 og FLC 50; cP0.05 versus afg 10 og FLC 50.
den histologiske undersøgelse viste fokal infiltration af svampeceller i nyrer af ubehandlede dyr og hos mus behandlet med AMBd, FLC eller afg. Nyrer af mus behandlet med lam viste kun en mild svampeinvasion. Tegn på nekrose, inflammatorisk respons eller parenchymaændringer blev heller ikke observeret i kontroller hverken hos behandlede dyr (Fig. 5).
tilstedeværelse af svampeinfiltration (sort pil) i nyresektionen af en kontrolmus inficeret med C. guilliermondii, 8 dage efter infektion (periodisk syre Schiff-farvning, forstørrelse 1000 liter). Bar=10 liter.
Diskussion
in vitro-undersøgelserne afslørede ikke nedsat følsomhed af C. guilliermondii-isolater over for FLC eller afg. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser viste tidsdrabskurver for AMB en koncentrationsafhængig fungicid aktivitet mod alle isolaterne, 4,5,7 og FLC viste en fungistatisk virkning uanset den testede koncentration.7 Det er kendt, at AMBd udviser en højere effekt end dens lipidiske formulering, især i nyre, når den administreres begge i de samme doser.1 farmakokinetiske undersøgelser viste imidlertid, at efter administration af 0,75 mg/kg AMBd var amb ‘ s Cmaks opnået i museserum 0,30 g/ml.25 imidlertid er AMB MIC for et af de to testede isolater højere end denne værdi; derfor brugte vi en høj dosis lam for at nå højere koncentrationer.1 faktisk var administrationen af lam ved 10 mg/kg effektiv til at reducere svampebelastningen af begge stammer. Denne kendsgerning korrelerede med dræbningskurver, hvor AMB opnåede sin fungicide aktivitet mod de to isolater, der blev testet in vivo, i koncentrationer på 1 liter/ml. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der forsøgte at etablere et forhold mellem drabskinetikken og den in vivo eksperimentelle effekt af AFG og FLC mod kliniske isolater af C. guilliermondii. Kun en tidligere undersøgelse af echinocandiner eksisterer, især på caspofungin (CFG) i dissemineret infektion af C. guilliermondii. CFG ved 1 mg/kg var effektiv til at reducere nyresvampbelastningen hos mus inficeret med en stamme af C. guilliermondii med en MIC på 8 liter/ml, mens tidsdrab afslørede, at der ikke blev opnået nogen fungicid aktivitet ved koncentrationer på 64 liter / ml.4 omvendt viste vores undersøgelse en koncentrationsafhængig aktivitet af AFG, som ved 32 Liter/ml udøvede en fungicid aktivitet, som tidligere rapporteret,17 ved 24 timer og ved 8 liter/ml. Tidligere undersøgelser rapporterede afg-koncentrationer i serum og nyre på ca.13 kg/ml efter 7 dages behandling i doser på 10 mg/kg.21 Her var AFG kun i stand til beskedent at reducere svampebyrden i nyrer hos neutropeniske mus inficeret med en af de to testede stammer, hvilket ikke synes at være relateret til den lave afg-Mikrofonforskel mellem de to testede stammer (1 fortynding), hvilket antyder, at responsen på afg-behandling er stammeafhængig. Tilsvarende var FLC også kun i stand til at reducere svampebyrden i nyre hos mus udfordret med en af de to stammer på trods af den administrerede dosis,der når serumkoncentrationer over MICs, 2 hvilket heller ikke var overraskende på grund af dets fungistatiske aktivitet.
afslutningsvis viste vores undersøgelse den højere aktivitet og effektivitet af lam mod de to stammer af C. guilliermondii, i modsætning til den dårlige effekt af FLC og afg. Imidlertid, yderligere undersøgelser med flere isolater af C. guilliermondii, der repræsenterer et bredere udvalg af afg-Mikrofoner, bør udføres for at vurdere, om der er nogen sammenhæng mellem MIC-værdier og afg-effekt.
interessekonflikt
ingen at erklære.
