CPS dæmper colitis uafhængigt af TRPV1
for at udfordre den mekanisme, hvormed CPS-klyster dæmper eksperimentel colitis, inducerede vi dekstran sulfatnatrium (DSS) colitis i vildtype (vægt) og TRPV1-mangelfulde mus (hver gruppe N = 8). Selvom der findes modstridende rapporter, udviklede TRPV1-mangelfulde mus DSS colitis og vægttab i samme grad som de congeniske VÆGTMUS i vores laboratorium, hvilket overholder vores resultater fra modellen af tnbs colitis, som vi tidligere havde offentliggjort7,8,9,10,11,12. Til behandling af klyster, brugte vi den samme koncentration af KKP (531 liter), som tidligere blev rapporteret at dæmpe DSS (5%) colitis hos rats8. Forløbet af colitis blev overvåget dagligt ved hjælp af kropsvægtmålinger og endoskopi. To gange dagligt blev DSS-colitis svækket i samme grad i både vægt− og TRPV1−/ – mus, hvilket blev afspejlet ved en forbedret endoskopisk score og reduceret tab af kropsvægt (Fig. 1A-C). H &e pletter fra den distale kolon i slutningen af 7-dages DSS-eksperimentet afslørede ødelagt slimhindevævsarkitektur med adskillige infiltrerende immunceller i kolonerne af kontroller. Dette var i skarp kontrast til en bredt intakt slimhinde og fraværet af signifikant immuncelleinfiltration i kolonerne af CPSA-behandlede mus af begge genotyper (Fig. 1D). I overensstemmelse med disse fund blev den histologiske score kraftigt reduceret i de CPSA-behandlede mus af begge genotyper (Fig. 1E).
CPA aktiverer TRPA1
in vivo-observationen om, at CPA-klyster effektivt hæmmede colitis i TRPV1-null-mutante mus pålagde spørgsmålet om TRPV1-uafhængige neuronale virkninger af CPA. Da TRPA1 havde vist sig at være afgørende i forskellige modeller af inflammation,herunder colitis6,12, 14, testede vi, om CCP virker på TRPA1.Patchklemmeeksperimenter blev udført i spændingsklemme-tilstand på HEK293t-celler, der udtrykte rekombinant hTRPA1 (hTRPA1-HEK293t-celler). Ved et holdepotentiale på -60 mV inducerede CPSE (10-liter) en indadgående strøm, der næsten fuldstændigt blev hæmmet (93% inhibering, n = 5) af den selektive TRPA1-antagonist HC-030031 (HC, 10-liter) (Fig. 2A). I alle celler, hvor der blev registreret en indadgående strøm, fremkaldte carvacrol (100 liter) en etableret TRPA1-agonist også store indadgående strømme ved det samme holdepotentiale, hvilket demonstrerede funktionel ekspression af htrpa1. Disse htrpa1-HEK293 celler blev også udsat for spændingsramper fra -100 til +100 mV med 400 ms varighed hver 4.s (Fig. 2B). Strømspændingsforholdet viste en smule udadrettet udbedring og et reverseringspotentiale tæt på 0 mV (Fig. 2C). De strømme, der blev fremkaldt af CPC (10 liter), blev hæmmet af HC (10 liter). Effekten var mere udtalt ved negative potentialer (89% – 5% – inhibering ved -80 mV, gennemsnitlig-SD SD, n = 7) end ved positive potentialer (80% – 9% – inhibering ved +80 mV).
(a) HTRPA1-medierede strømme fremkalder htrpa1-medierede strømme i transficerede HEK293t-celler. Bemærk den fuldstændige hæmning af strømme af den selektive TRPA1-antagonist HC030031 (HC, 10 liter). (B) repræsentative rampestrømme fremkaldt i en HTRPA1-transficeret HEK293-celle med 400 ms spændingsramper fra -100 til +100 mV anvendt hver 4. s.hvert symbol repræsenterer den aktuelle amplitude ved -80 mV (firkanter) og +80 mV (cirkler). Den CPC-inducerede strøm blev stærkt hæmmet af HC. (C) eksempler på individuelle rampestrømme svarende til de udfyldte symboler og tal i B. (D) CPC (50 liter, 10 sek) fremkalder store calciumtransienter i htrpa1-HEK293 celler (sort spor, n = 128). HC (20 liter; rødt spor, n = 209) og a-967079 (10 liter; blåt spor, n = 140) hæmmede fuldstændigt responsen på CPC. Data repræsenterer midler (lige linjer) Kurt SEMs (stiplede linjer). (E) aktiveringen af hTRPA1 med KKP (10 liter) er koncentrationsafhængig. Sort spor: htrpa1-HEK293 celler (n = 52) blev stimuleret ved stigende koncentrationer af CPR i 20 s med 3 min-intervaller. Grå spor: ikke-overførte HEK293-celler (n = 101) blev udsat for de samme CPC-koncentrationer. (F) aktivering af hTRPA1 ved hjælp af CPC (1 liter) involverer tre kritiske cysteiner i kanalens N-terminal. Black trace: respons af N = 123 HEK293 celler, der udtrykker vægt hTRPA1 på successive anvendelser af CPR (1-lp), carvacrol (100-lp) og allylisothiocyanat (aitc, 50-lp). Grå spor: respons af n = 165 HEK293 celler, der udtrykker den mutante hTRPA1-3c til den samme sekvens af stimuli. Bemærk den betydelige reduktion i responsen fra htrpa1-3c-mutanten til CCP og AITC, men ikke til carvacrol. G) forskellen i følsomhed mellem genotyper blev afskaffet ved 100 HKP. H) aktivering af hTRPA1 ved hjælp af HTRPA kan forhindres af opfangeren N-acetyl cystein (NAC). Black trace: i kontroleksperimenter blev htrpa1-HEK293 celler udfordret med CPC (50 liter; 60 sek; n = 74). Rød spor: i et separat eksperiment blev celler først eksponeret i 30 s for en kombination af CPR (50 liter) og NAC (15 mM), umiddelbart efterfulgt af CPR alene i yderligere 30 s (n = 83).
CCP-induceret calciumtilstrømning gennem hTRPA1
selektiv virkning af CCP på TRPA1 blev bekræftet ved anvendelse af calciummikrofluorimetri-teknikken. htrpa1-HEK293 celler blev stimuleret af to anvendelser af CPR (50 liter) i 10 sekunder med 5 minutters intervaller (Fig. 2D). De selektive antagonister HC (20 liter) og A-967079 (10 liter) blev ansøgt i 1 min før og under den første CPR-udfordring. Begge antagonister afskaffer deres reaktion fuldstændigt. Det er værd at bemærke, at fjernelsen af HC førte til en calciumtilstrømning, sandsynligvis på grund af resterende CCP-virkning, mens denne off-effekt var fraværende i tilfælde af a-967079, som kan løsne langsommere (Fig. 2D). Vi analyserede derefter koncentrationsafhængigheden af CPC-effekter. Stigende koncentrationer (100 nM, 500 nM, 5 liter og 50 liter) blev påført htrpa1-HEK293 celler i 20 sekunder hver med 3 minutters intervaller. Begyndende med 100 nM fremkaldte alle koncentrationer af CPR calciumtransienter med stadig større amplituder (Fig. 2E). Carvacrol (100 liter) blev anvendt i slutningen af eksperimentet for at kontrollere for funktionel trpa1-ekspression, men carvacrol-responsen efter 50 liter var iøjnefaldende lille, hvilket antydede krydsdesensibilisering. Ikke-inficerede HEK293-celler blev udsat for de samme applikationer, og kun den højeste testede koncentration (50 liter) inducerede en minimal stigning i calcium. Vi forventede, at CCP ville engagere de tre kritiske cysteinrester i kanalens N-terminale domæne, fordi det er en elektrofil forbindelse. HEK293-celler, der udtrykker vægt hTRPA1 og celler, der udtrykker den tredobbelte cysteinmutant hTRPA1 – 3c (C621S, C641S, C665S), blev udsat for CPC-applikation (1 liter, 20 sekunder) efterfulgt af den ikke-elektrofile agonist carvacrol (100 liter, 20 sekunder) og den stærkt elektrofile AITC (50 liter, 30 sekunder). Ionomycin blev anvendt i slutningen af eksperimentet som en positiv kontrol. Amplituden af calcium transient fremkaldt af 1 liter KKP blev væsentligt reduceret (>80%) i celler, der udtrykker hTRPA1-3c sammenlignet med celler, der udtrykker vægt hTRPA1 (Fig. 2F), mens forskellen i CPR-følsomhed mellem genotyperne blev afskaffet ved 100 liter CPR-koncentration (Fig. 2G). Aitc-responsen blev nedsat i de mutante celler, mens carvacrol fremkaldte store calciumiontransienter i både vægt-og 3C-mutanter. Samlet set indikerer disse celleresponser, at den relativt høje styrke af CPR afhænger af de tre kritiske cysteiner. Når koncentrationen af HTRPA er 100 gange højere, overtager andre bindingssteder imidlertid aktiveringen af hTRPA1. Denne høje koncentration af den lipofile CPC kunne også interagere med den cellulære lipidmembran, indirekte aktiverende TRPA1, som tidligere vist for lipid a-komponenten af lipopolysaccharider16. I nærvær af den elektrofile scavenger N-acetylcystein (NAC) ved en mætningskoncentration (15 mM) var 50 liter ikke i stand til at fremkalde noget respons. Efter fjernelse af NAC fremkaldte CPSA store calciumtransienter i de htrpa1-transficerede HEK293t-celler (Fig. 2H), som bekræfter, at CPC fungerer som en elektrofil agonist for hTRPA1.
CPSA aktiverer en subpopulation af aitc-følsomme dorsale rodganglion (DRG) neuroner
DRG neuroner blev opretholdt i primær Kultur og undersøgt ved calciummikrofluorimetri. Celler blev stimuleret af CPC (50 liter, 20 sekunder), efterfulgt af AITC (100 liter, 30 sekunder), capsaicin (CAP, 1 liter, 10 sekunder) og KCl (60 mM, 30 sekunder). Figur 3a illustrerer eksempler på DRG-neuroner, der reagerer på alle disse fire stimuli. En typisk fraktion af DRG-neuroner blev aktiveret af aitc (301 af 906 neuroner, 33%, n = 8 mus), der indikerer funktionel ekspression af TRPA1. En subpopulation af disse aitc-følsomme neuroner blev også aktiveret af CPR (185 af 301 neuroner, 61%). Følsomheden over for CCP var næsten fuldstændig begrænset til aitc-responsive neuroner. Af i alt 200 CPC-følsomme neuroner blev 185 (93%) også aktiveret af aitc, hvilket indikerer en stærk overensstemmelse med følsomhed over for CPC og Aitc (Fig. 3). Som i tilfældet med HTRPA1-eksprimerende HEK293-celler var calciumtransienterne fremkaldt af CPR i DRG-neuroner koncentrationsafhængige med en EC50-værdi estimeret til 30 liter CPR, og det lille aitc-respons efter 100 liter CPR foreslog igen krydsdesensibilisering (Fig. 3B, C). 14% af DRG-neuronerne reagerede på AITC, men ikke på CAP (125/906), 16% reagerede på CAP, men ikke på aitc, mens CPC inducerede calciumtransienter i 78% af neuronerne, der reagerede på både AITC og CAP (137 af 176). For at demonstrere specificiteten af de observerede effekter blev TRPV1−/− og TRPA1−/− DRG-neuroner udsat for ovenstående protokol. Cirka 90% af de TRPV1-mangelfulde DRG-neuroner, der var aitc-følsomme, reagerede også på CPR (509/572-celler), mens ingen af de 448 trpa1-mangelfulde DRG-neuroner, der blev testet, viste calciumtilstrømning som reaktion på CPR (100 liter) som illustreret af repræsentative eksempler i Fig. 3E, F.
(a) CPA (50 liter) aktiverer en subpopulation af aitc (100 liter)-følsomme mus dorsal rod ganglion (DRG) neuroner. Individuelle responser fra tre forskellige aitc-og capsaicin (CAP, 1 liter) – følsomme DRG-neuroner, der blev aktiveret af CPC. CPC blev anvendt i 20 s, AITC i 30 s og CAP i 10 s med intervaller på 4 min, hvilket muliggør genopretning. KCl (60 mM) blev anvendt i slutningen af eksperimentet for at sikre levedygtigheden af dyrkede neuroner. (B) gennemsnitligt respons på n = 135 aitc-følsomme neuroner til tre forskellige koncentrationer af CPR (25, 50, 100 liter, 20 s hver). Bemærk koncentrationsafhængigheden af amplituden af Ca2+ transienter. Lige spor repræsenterer gennemsnitlige og stiplede spor repræsenterer SEMs. I AITC-følsomme DRG-neuroner normaliseret til en depolariserende stimulus med KCl (60 mM). EC50 på 30 liter pr. liter blev beregnet ved tilpasning til Dosisresponsfunktionen. Data er repræsentative for to sæt eksperimenter og viser betyder kr.sem; for kr. 1, 10, 25 kr.: n = 169, for kr. 25, 50, 100 kr.: n = 138. D) at illustrere populationer af CPC -, AITC-og CAP-følsomme DRG-neuroner og deres overlapning. I alt 906 afbildede neuroner (valgt ved deres respons på KCl) blev 200 (22%) aktiveret af CPR (50 liter), 301 (33%) af AITC (100 liter) og 323 (36%) af CAP (1 liter) (detaljeret analyse af fraktioner, se si figur legende 3). (E) CPR (100 liter, 20 sek) aktiverer aitc (100 liter, 20 sek)-følsomme DRG-neuroner fra TRPV1-mangelfulde mus. Individuelle reaktioner fra forskellige aitc-følsomme neuroner, der blev aktiveret af CPC. Cirka 90% (509/572 celler) af de TRPV1-mangelfulde DRG-neuroner, der var aitc-følsomme, reagerede på CPR. CAP (1 liter, 10 s) inducerede ikke Ca2+ transienter i TRPV1−/− neuroner. (F) mangel på Ca2+ tilstrømning i TRPA1-mangelfulde DRG-neuroner. Individuelle responser fra forskellige CAP-følsomme DRG-neuroner (ud af 448 testede neuroner), som hverken blev aktiveret af CCP eller AITC (10-liter).
systemisk desensibilisering gennem TRPA1 dæmper smerte
efter at vi havde opdaget, at CPA er en potent TRPA1-agonist, forstod vi, hvorfor de første CPA-klyster (to gange dagligt) var åbenlyst smertefulde i VÆGTMUSENE. Vi kvantificerede derefter den CPR (531 liter) enema-induceret nocifensiv adfærd hos raske dyr (hver n = 6) ved at tælle de vridende reaktioner og registrere visceromotoriske refleksresponser (VMRs) gennem den integrerede elektromyografi (EMG) i mavemuskelvæggen (Fig. 4A, B). I løbet af gentagelsen af de to daglige CPC-behandlinger bemærkede vi, at TRPA1-knockouts ikke viste smerterelateret adfærd på noget tidspunkt. Derudover præsenterede VÆGTMUSENE et progressivt fald i oprindeligt stærke smerteresponser med et kraftigt fald omkring dag 3, hvilket førte til en endelig fuldstændig desensibilisering i begge nocifensive parametre. Dette tab af kolon smerteopfattelse hos ellers normale mus rejste forventningen om, at klyster kunne have leveret CCP en farmakodynamisk mængde tilstrækkelig til at inducere systemisk hypoalgesi. For at teste denne hypotese anvendte vi øjetørretest ved hjælp af AITC (100 liter) og hætte (1 mM) (Fig. 4C, D) (n = 6). Begge tests viste en tydelig dæmpning af øjetørretællinger i VÆGTMUSENE, der var blevet behandlet med CPC-klyster (indtil 12-16 timer før testen). Disse virkninger blev sandsynligvis medieret af TRPA1-desensibilisering snarere end TRPV1-blok, da TRPV1-mangelfulde mus var ufølsomme over for sennepsolie (aitc, 100 liter) instillation i øjet i samme grad som VÆGTMUS (Fig. 4C). Omvendt var CPC-klyster ineffektive i TRPA1 – / – mus, da disse mus blev udfordret af CAP-instillationer i øjet (Fig. 4D).
Capsepin enemas desensibilisere lokale og fjerne smerte reaktioner.
(A) akutte vridningsreaktioner som reaktion på CPC (531 lm) lavementer i løbet af de første 5 minutter efter påføring. Gentagne klyster (to gange dagligt) førte til et progressivt fald i vridende reaktioner. En dramatisk trinreduktion blev observeret efter 5 enemas i VÆGTMUS. I modsætning hertil viste TRPA1−/− mus, der blev behandlet med CPA (531 liter) eller VÆGTMUS, der blev behandlet med vehikel (PBS) – klyster, kun få vridninger, der opstod inden for de første 30 sekunder (hver n = 6). (B) Visceromotoriske reaktioner (VMRs) på CPC-klyster. Enemas to gange dagligt førte til et kontinuerligt fald i VMR ‘ er i VÆGTMUS, svarende til løbet af vridningsreaktioner. VMR ‘ er som reaktion på køretøjet var ikke signifikant forskellige fra dem til CPC− klyster i TRPA1−/ – (begge n = 6). (A, B) KØRETØJSGRUPPE i forhold til køretøjsgruppe. (C) gentagne klyster dæmper øjetørringsadfærd til AITC (100 liter). Både vægt-og TRPV1−/− mus behandlet med lavement viste en dyb reduktion af antallet af øjetørre sammenlignet med køretøjet (begge n = 6). Kontroller var VÆGTMUS uden enemas modtagende køretøj (PBS) falder ind i øjet. (D) klyster dæmper øjetørringsadfærd til hætten (1 mM). Mus behandlet med vehikel og TRPA1 – / – mus behandlet med klyster to gange dagligt i 7 d viste adskillige øjentørrende reaktioner på Cap-instillation i øjet, testet 12 timer efter den sidste klyster (begge n = 6). Mus, der blev behandlet med klyster, viste en dybtgående reduktion af antallet af øjetørring. (E) termiske og (f) mekaniske tilbagetrækningstærskler for begge bagpote i løbet af oral CPR (531 liter) eller aitc (500 liter) medicin via drikkevand. (E) CPC og AITC over 10 d sammenlignet med den køretøjsbehandlede gruppe inducerede en progressiv stigning i løbet af 3-5 d i tilbagetrækningsforsinkelser til strålevarme stimulering, som normaliseres inden for 2 uger efter udvaskning (hver n = 6). F) mekaniske tærskler for stimulering med et elektrodynamisk von Frey-filament viste ingen systematisk tendens under begge forbindelser (hver n = 6). Alle gentagne målinger ANOVA og Dunnetts post-test, undtagen i (C,D) Mann Hvidney U-test.
da gentagne klyster er en ubehagelig indgivelsesvej, testede vi for en mulig anti-nociceptiv virkning af peroral CPC (531 lp) i drikkevandet. Drikkeordningen over 10 dage blev godt tolereret uden nogen åbenlyse bivirkninger. I løbet af kontinuerlig oral indgift Pot-tilbagetrækning latenstid til strålevarme stimulering (Hargreaves metode) steg gradvist i begge bagpote (Fig. 4E). Tolerancetiden var omkring fordoblet på dag 7 og forblev signifikant forhøjet fra dag 2 til 10. Efter 2 ugers bedring med rent drikkevand var tilbagetrækningsforsinkelser vendt tilbage til baseline-niveau. Den mekaniske lydhørhed over for stimulering med den lineært stigende kraft af et elektrodynamisk von Frey-filament blev ikke signifikant påvirket i løbet af de ti dage, hvor man drikker (Fig. 4F). Spørgsmålet opstod, om varme og kemisk hypoalgesi repræsenterede en klasseeffekt af desensibiliserende TRPA1-agonister, eller om det var specifikt for CPSA. Således administrerede vi AITC i en lignende og godt tolereret koncentration (500 liter) via drikkevandet. Det samme dosisregime for AITC som beskrevet for CPR resulterede i en progressiv stigning i latenstid for pote-tilbagetrækning til strålevarmestimulering, der var signifikant mindre end den inducerede af CPR (Fig. 4E). Mekanisk reaktionsevne blev ikke ændret under aitc-drikkeplanen (Fig. 4F).
CPSA forårsager vedvarende desensibilisering af TRPA1/TRPV1, der udtrykker peptidergiske sensoriske neuroner
vi stillede derefter spørgsmålet om, hvorvidt desensibilisering af hele dyr ved CPSA kunne reproduceres på cellulært niveau. Til dette formål udførte vi calciumafbildningseksperimenter med isolerede DRG-neuroner, der var opnået fra kontrolmus og fra dyr behandlet i 7 dage to gange dagligt med CPC-klyster. Disse neuroner blev nødvendigvis holdt i kultur i 16 til 24 timer i nærvær af NGF. I alt 399 neuroner fra kontrolmus og 584 neuroner fra enema-behandlede mus blev fyldt med Fura-2 og calcium transienter fremkaldt af aitc, carvacrol, CAP og en KCl-rig opløsning blev registreret. Responserne på disse TRPA1 (aitc og carvacrol) og TRPV1 (CAP)-agonister var ikke signifikant forskellige i DRG-neuroner fra kontroldyr og klysterbehandlede dyr (Fig. S1). Imidlertid var trpa1 mRNA-ekspression ca.to gange opreguleret i lumbosacral DRG fremstillet umiddelbart efter den endelige CPR-klyster (Fig. S2), mens der ikke blev påvist nogen ændring i trpa1-ekspression, når 24 timer var gået in vivo efter den sidste klyster. TRPV1 mRNA ændrede sig ikke under begge omstændigheder. Transkriptionel opregulering af TRPA1 – genekspressionen havde således fundet sted på grund af de mange CPR-klyster, men blev hurtigt vendt, da CPR-forsyningen blev afbrudt. Under DRG-dyrkningsbetingelser havde den samme epigenetiske reversering sandsynligvis fundet sted, og al resterende CPR blev sandsynligvis udvasket, så der faktisk ikke kunne forventes nogen resterende desensibilisering. Da de cellulære modeller ikke afspejlede den outlasting CPSA-inducerede desensibilisering af hele dyrene in vivo, så vi efter en anden stærk indikator for den overraskende systemiske effekt. Størstedelen af nociceptive neuroner er peptidergiske og udtrykker overvejende calcitonin-genrelateret peptid (CGRP) og stof P (SP)15,17. Ved depolarisering, som ved KCl og calciumtilstrømning, på grund af aktivering af spændingsstyrede calciumkanaler frigives disse neuropeptider fra nervefibrene i en kvasi-efferent funktion (neurogen inflammation). På den anden side er aktiverede TRP-kanaler i sig selv meget gode calciumledere og kræver ikke støtte fra nogen spændingsstyrede natrium-eller calciumkanaler for at fremkalde vesikulær eksocytose af CGRP18. Således kan stimuleret frigivelse af CGRP tjene som et indeks for (peptidergisk) nociceptoraktivering. På samme måde har vasoaktive neuropeptider forskellige virkninger på inflammationsprocessen i sig selv,og udtømning eller desensibilisering af den peptidergiske sensoriske neuronpopulation har vist sig at dæmpe colitis19,20, 21. For at afgøre, om KKP (531 liter) enemas desensibiliserer gennem TRPA1, lokalt og systemisk, anvendte vi isolerede musekolon og hudpræparater. Koloner af sunde C57BL / 6-mus (n = 8) blev udsat for CPR (100 liter), hvilket inducerede massiv CGRP-frigivelse (Fig. 5); efterfølgende anvendelser af AITC (100 liter) 5 min eller 15 min efter CPC (Fig. 5A, B) kunne ikke længere inducere CGRP-frigivelse, hvilket antyder en dyb akut funktionel kryds-desensibilisering til TRPA1-agonisten. Denne effekt kan ikke skyldes udtømning, da den efterfølgende KCL (60 mM) respons var normal. Koloner fra mus, der gentagne gange var blevet behandlet med CPC (531 liter) enemas in vivo, to gange dagligt for 7 d blev isoleret og testet 12-16 timer efter den sidste enema. Hverken CGRP (100 liter) eller AITC (100 liter) inducerede nogen CGRP-frigivelse i denne tilstand (Fig. 5C, D); især CAP (30 nM)-induceret CGRP-frigivelse blev stærkt reduceret, men ikke afskaffet (Fig. 5E). I modsætning hertil blev KCl (60 mM)-induceret CGRP-frigivelse ved uspecifik depolarisering ikke kun reduceret, men faktisk forbedret efter CPC-klyster. Dette indikerede, at kolonnervefibrene ikke var udtømt af CGRP, men snarere overfyldte, men alligevel i det væsentlige desensibiliseret på en vedvarende måde til kemisk aktivering gennem TRPA1 såvel som TRPV1 (n = 6). Endelig viste også hudpræparatet, isoleret 12-16 timer efter den sidste CPCE-klyster, at AITC (100 liter) og CAP (1 liter)-induceret CGRP-frigivelse blev kraftigt reduceret i overensstemmelse med den kropsbrede desensibilisering observeret i adfærdstestene (Fig. 5F, G, Se Fig. 4A-F) (n = 6).
lokal og systemisk desensibilisering CGRP).
(A) akut CGRP-frigivelse fra isolerede kolonpræparater af VÆGTMUS induceret af CPR (100 liter); efterfølgende sennepsolie (aitc, 100 liter) eksponeringer inducerer ikke CGRP-frigivelse, mens uspecifik depolarisering med KCl (60 mM) er effektiv som normalt. Data er midler + SEMs (n = 8). CGRP-frigivelse blev afskaffet hos mus forbehandlet med to gange dagligt CGR-klyster i 7 d indtil dagen før frigivelseseksperimentet, mens CAP (1 kolon)-induceret CGRP-frigivelse blev kraftigt reduceret, men ikke afskaffet i disse mus sammenlignet med kontroller. (**P <0.01, ***P < 0.001, Mann U-test, hver n = 6). (E) Tilsvarende blev aitc (100 liter)-induceret CGRP-frigivelse afskaffet i isolerede hudpræparater fra bagpoterne hos mus, der var forbehandlet med CPC-klyster. (F) i modsætning hertil blev CAP (1 liter)-induceret CGRP-frigivelse stærkt reduceret fra huden på disse mus sammenlignet med kontroller. (**P <0.01, ***P < 0.001, Mann U-test, hver n = 6). Bemærk,at alle KCL (60 mM) responser efter desensibiliseret CPR-og AITC-responser var normale (B,C, E), hvorimod KCl-responserne fra den ufuldstændigt desensibiliserede CAP-stimulerede neuronpopulation (D,F) var lige så meget reduceret som i alle kontroleksperimenter, hvilket antyder CGRP-lagerudtømning, som forhindres ved effektiv desensibilisering af den CPR/aitc-følsomme neuron-subpopulation.
