resultater

identifikation af IL-7-Receptor-Larsen-kæde (CD127) som markør for hukommelses-T-celler. Mens vi søgte efter nye markører til at definere effektor-og hukommelses-T-celleundersæt i musen, analyserede vi overfladeekspression af IL-7-receptoren-Kurt-kæde/CD127 (Fig. 1a). Under primære reaktioner på Lm kan der skelnes mellem forskellige underpopulationer af antigenspecifikke milt-t-cellepopulationer baseret på cd127-ekspressionsniveauer. CD127 celler med lav ekspression (Cd127lavt) dominerer i den akutte effektorfase. Under overgangen til hukommelses-T-cellefasen forsvinder imidlertid Cd127lave celler gradvist, mens populationer, der udtrykker høje niveauer (Cd127høj), forbliver bemærkelsesværdigt stabile i størrelse over tid (Fig. 1 A og c). Disse forskellige kinetiske værdier antyder stærkt, at CD127-ekspression er en selektiv egenskab for T-celler med lang levetid. Under effektorfasen migrerer Cd127lave CD8 + T-celler fortrinsvis til ikke-lymphoide organer, hvorimod kun Cd127høj CD8+ T-celler detekteres i LN (Fig. 1b). Milten repræsenterer et “mellemliggende organ”, hvor alle forskellige underpopulationer findes tidligt efter immunisering (22, 23). Senere i hukommelsesfasen er antigenspecifikke T-celler i alle organer karakteriseret ved en Cd127høj fænotype (Fig. 1 b og c). Sammenligning af mulighederne for Cd127lavt og CD127high antigen-specifikke T-celler til at proliferere som reaktion på stimulering afslørede slående forskelle mellem de to undergrupper. Som vist i Fig. 1D, oprensede Listeria-specifikke Cd127høj T-celler prolifererer hurtigt efter anti-CD3-stimulering, mens Cd127lave T-celler prolifererer Dårligt. Det er usandsynligt, at disse forskelle i proliferation afspejler en fordel ved CD127-positive celler gennem Ab-medieret IL-7R-stimulering, fordi forskellige mAb-kloner med kendt cd127-aktiverende eller blokerende aktivitet viste den samme effekt i kortvarige in vitro-stimuleringsanalyser (data ikke vist).

for mere direkte at demonstrere, AT T-celler med lang levetid udelukkende er til stede i CD127-højekspressionsrummet tidligt efter in vivo-priming, udførte vi adoptivoverførselsundersøgelser ved hjælp af en nyligt udviklet reversibel MHC multimer-farvningsteknik (21) til funktionelt at isolere antigenspecifikke T-celler direkte fra vivo. Efter adoptiv overførsel af Cd127høj LLO91-99-specifikke T-celler fra mus inficeret i 10 dage med Lm, kunne de overførte celler stadig påvises flere uger senere i milten hos naive modtagermus (Fig. 2a), hvorimod cellenumrene efter overførsel af Cd127lave celler var ved detektionsgrænsen. Denne observation skyldtes ikke forskelle i In vivo migration af overførte CD127 høje og Cd127lave celler, fordi vi fandt lignende forskelle for lungen (Fig. 2a) og andre organer (LN og lever, data ikke vist). For yderligere at understøtte fortolkningen af, at CD127high T-celler udelukkende opretholder antigenspecifikke hukommelsesceller, blev modtagermus udfordret efter adoptiv overførsel med Listeria-infektion. Igen var det kun hos mus, der havde modtaget Cd127høj T–celler før infektion, hurtig ekspansion af overførte llo91-99-specifikke T-celler, der kunne påvises (Fig. 2b). Igen skyldtes dette resultat ikke forskelle i migration, fordi vedligeholdelse eller udvidelse af overførte Cd127lave T-celler ikke kunne påvises i noget andet organ (Fig. 2b og data ikke vist). Selvom disse resultater fra adoptivoverførselsundersøgelser stærkt understøtter hypotesen om, AT T-celler med lang levetid udelukkende er til stede i CD127high T-celler rum, vi observerede også betydelige begrænsninger af denne eksperimentelle tilgang. Især synes hukommelses-T-celler med øjeblikkelig effektorfunktion at være ret følsomme over for adoptivoverførselseksperimenter og dør hurtigt efter oprensning og i.V. anvendelse; skønt de overlever i måneder til år, hvis de efterlades uberørt in vivo (11). Selvom vores resultater fra adoptivoverførsel er i overensstemmelse med fortolkningen af, at CD127 er en markør for T-celler med lang levetid, kan vi således ikke udelukke, at iboende problemer med hensyn til overlevelse af forskellige T-celleunderpopulationer også bidrager til resultatet af disse eksperimenter.

Costering af Antigen-specifikke T-cellepopulationer med CD127 og CD62L tillader forskelsbehandling mellem hukommelses-T-Celleunderpopulationer. Yderligere karakterisering af CD127high T-cellepopulationen viste, at den kan opdeles i underpopulationer, der udtrykker høje og lave niveauer af CD62L (Fig. 3). Direkte funktionel analyse (21) af oprensede T-celler (10-12 dage efter infektion, når alle underpopulationer samtidig kan påvises i milten) afdækkede yderligere funktionelle forskelle. Mens Cd62-t-celleundergrupper viser kraftig og øjeblikkelig cytolytisk aktivitet, viser Cd127høj/ Cd62lhøj T-celler meget dårlig lysis af peptidbelagte målceller (Fig. 3). Intracellulær cytokinfarvning af sorterede underpopulationer afslørede, at Cd127høj / Cd62lløse T-celler, ligesom Cd127lavt/Cd62lløs delmængde, producerer effektorcytokinerne INF-larr og tumornekrosefaktor larr; i modsætning hertil producerer Cd127høj/Cd62lhøj delmængde IL-2, men ikke IFN-larr og tumornekrosefaktor larr. Markørkombinationen af CD127 og CD62L muliggør således identifikation af T-celleunderpopulationer med egenskaber, der ligner dem, der tidligere er beskrevet hos mennesker. Cd127lavt / Cd62lav T-celler demonstrerer alle kendte egenskaber ved en reel effektor T-cellepopulation (TE, dårlig proliferativ aktivitet, begrænset in vivo overlevelse og øjeblikkelig effektorfunktion). CD127high / CD62Lhigh subset matcher TCM ‘ s egenskaber, og CD127high/Cd62lav T-celler passer til beskrivelsen af tem.

generering af forskellige hukommelses-T-Celleunderpopulationer afhænger af CD40L-medieret t-Cellehjælp. Fordi vi følte, at det kunne være problematisk udelukkende at basere fortolkningen af, at CD127-udtryk kan bruges som en markør til at skelne mellem effektor og langlevende hukommelse T-celler på adoptivcelleoverførselseksperimenter, besluttede vi at analysere musemutantlinjer med defekter i genereringen af T-cellehukommelse. Hvis CD127 faktisk er en” tidlig ” hukommelses-T-cellemarkør, skal vi være i stand til at identificere forskelle under tidlige og sene tidspunkter inden for de CD127-positive undergrupper hos mus med hukommelsesfejl.

fordi nylige undersøgelser viste vigtigheden af T-cellehjælp til generering af langvarige hukommelsesresponser (2-4), besluttede vi at bestemme, om tilstedeværelsen eller fraværet af CD4+ T-cellehjælp under CD8+ T-celleprimering fører til forskelle i de antigenspecifikke t-celleundersætsammensætninger detekteret i den tidlige posteffektorfase. MHC II-mangelfulde mus, der mangler konventionelle CD4 + T-celler, har en defekt CD8+ hukommelsesrespons, og kvaliteten af beskyttelsen falder over tid (2-4). Farvning for T-celleunderpopulationer 10 dage efter primær infektion afslørede, at Cd127høj/Cd62lløs delmængde er næsten fuldstændig fraværende i MHC II–/– mus (Fig. 4a); de andre underpopulationer er til stede ved frekvenser svarende til dem i vægt C57BL/6 mus. Disse data viser, at fraværet af T-cellehjælp forhindrer effektiv generering af en T-celleundersæt med en effektorhukommelsesfænotype, hvilket synes at være afgørende for hurtig in vivo-ekspansion og effektorfunktion.

fordi vigtige mekanismer for CD4+ T– cellehjælp medieres gennem interaktionen mellem CD40 og CD40L (24-26), undersøgte vi, om CD40L–/– mus viser en fænotype svarende til MHC II– / – mus. I overensstemmelse med andre nylige undersøgelser (27) viser CD40L–/– mus ingen forskelle i bakteriebelastning eller bakterieclearance efter primær Listeria-infektion (data ikke vist) og har normale primære CD8+ T-celleresponser på en subletal dosis Lm (Fig. 4c). Imidlertid reduceres deres evne til hurtigt at rydde reinfektion med en højere dosis Lm (liter 10 liter LD50) (Fig. 4B), der korrelerer med nedsat CD8+ hukommelse T-cellerespons (Fig. 4c) og en meget reduceret Cd127høj/Cd62lav delmængde (Fig. 4 e og f) i den tidlige posteffektorfase. Under reinfektion med Listeria svarer proliferation af responderende T– celler i CD40L–/ – mus til cellepopulationer i VÆGTMUS, hvilket indikerer, at fænotypen ikke skyldes en generel defekt i den proliferative kapacitet af hukommelses-T-celler (Fig. 4d) men snarere til reduceret antal hukommelses-T-celler, der er i stand til straks at reagere på antigen-reencounter. Denne fænotype blev demonstreret ved in vivo-mærkningseksperimenter, hvor BrdUrd blev inkorporeret i hele ekspansionsfasen (Fig. 4D) og ved in vivo brdurd pulse–chase undersøgelser, der overvåger tabet af etiket på spredning (data ikke vist).

reduceret Generation af T-Celleundersæt med en Effektorhukommelsesfænotype tidligt efter Priming overføres til den sene hukommelses T-Cellepulje. Vores data viser, at i fravær af CD4+ T-celler eller CD40L reduceres CD127high/Cd62llovt t-celleundersæt markant tidligt efter priming. Desuden er vi (Fig. 4b) og andre (3-5) viste, at nedsat T-celle hjælp under T-celle priming fører til ændringer i kvaliteten af beskyttende immunitet mod reinfektion med Lm eller lymfocytisk choriomeningitis virus. For mere tydeligt at forbinde den observerede defekt i den tidlige generation af Cd127høj / Cd62lløse T-celler med kvaliteten af efterfølgende t-cellehukommelse i disse mus analyserede vi antigenspecifikke t-cellepopulationer i hukommelsesfasen (5 uger efter primær Listeria-infektion) mere detaljeret. På dette tidspunkt skal analyse af antigenspecifikke T-celler udføres på celler afledt af forskellige væv på grund af deres forskellige migrationsadfærd. Ud over milten valgte vi LN som et repræsentativt væv til lymfoide organer og lungen som et typisk perifert, ikke-lymphoid rum. På dette tidspunkt er de antigenspecifikke T-celler i disse organer næsten alle Cd127høj (Fig. 1B); cellerne i lungen er Cd62lav (data ikke vist), mens de fleste antigenspecifikke hukommelses-T-celler i LN er Cd62lhøj (Fig. 5b ). For at bestemme antallet af antigen-specifikke hukommelses-T-celler med klar øjeblikkelig effektorfunktion i de forskellige organer, vi udførte intracellulær cytokinfarvning for IFN-relur. Som vist i Fig. 5A, CD40L – / – mus er karakteriseret ved væsentligt formindsket antal antigen-specifikke hukommelses-T-celler med øjeblikkelig effektorfunktion sammenlignet med VÆGTMUS. Dette resultat er sandt på frekvensniveauet (procentdel) inden for CD8+ T-cellerummet og i absolutte tal (Fig. 5a). Imidlertid MHC tetramer farvning af LN-afledte lymfocytter (Fig. 5b) afslørede næsten identiske antal antigenspecifikke T-celler med en Cd62lhøj fænotype. Nogle cd62-specifikke antigen-specifikke T-celler kan også påvises i LNS af VÆGTMUS, der korrelerer med frekvenserne af IFN-kursproducerende celler (Fig. 5a). Denne population er dybest set fraværende i LNS af CD40L – / – mus; hele CD8+/ Cd62lav delmængde reduceres i CD40L– / – mus, hvilket antyder en generel defekt i genereringen af denne T-celleundersæt. Sammenfattende viser vores data, at fraværet af CD40L-afhængig CD4+ T-cellehjælp i primerperioden resulterer i kvantitative forskelle i antigenspecifikke CD8+ T-celleunderpopulationer med stærkt reduceret antal celler, der udviser en effektorhukommelsesfænotype (Cd127høj/Cd62). Disse kvantitative forskelle i celler med øjeblikkelig tidlig effektorfunktion overføres til hukommelsesfasen og påvirker kvaliteten af beskyttende immunitet.