fremstilling af proteinkomponenter til rekonstitution

komponenter i E. coli-oversættelsesapparatet, herunder translationsfaktorer og Aar’ er, blev fremstillet som tidligere beskrevet46. Fremstilling af RNA-komponenter, M1 RNA og C5-protein blev også fremstillet som beskrevet tidligere29. Vi ændrede protokollen for C5-proteinet ved at udfælde det med 80% mættet ammoniumsulfat og opløse det ved dialysering mod buffer a (50 mM natriumacetat pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl og 7 mM 2-mercaptoethanol). Det resulterende bundfald blev genvundet ved centrifugering og opløst ved dialysering mod buffer B omfattende 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M urinstof og 10 mM dithiothreitol (DTT). Opløste proteiner blev påført på en 5 mL HiTrap SP HP-søjle (#17115101, GE Healthcare, USA), vasket med buffer B indeholdende 7 mM 2-mercaptoethanol som erstatning for 10 mM DTT og elueret med en lineær gradient fra 100 mM til 2 M NH4Cl i buffer B. fraktioner indeholdende C5-protein blev analyseret af SDS-PAGE, genvundet, dialyseret mod buffer D (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 M NH4Cl, 10 M mm MgCl2, 2 m urinstof, 7 mm 2-mercaptoethanol), derefter yderligere dialyseret mod buffer D uden urinstof. De resulterende opløsninger blev koncentreret under anvendelse af en Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) og dialyseret mod buffer D uden urinstof indeholdende 50% glycerol. Det oprensede C5-protein blev opbevaret ved -30 liter C. Vi bemærker, at vi kan dele alle plasmiderne på anmodninger.

fremstilling af modifikationsmodifikationer for ivttrna ‘er

Modifikationsmodifikationer for ivttrna’ er blev fremstillet som følger. E. coli-gener af TsaB, TsaC, TsaD, Tsae, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE og GidA blev amplificeret fra E. coli A19 genom ved anvendelse af passende primere (supplerende Data 5). Forstærkede gener for TsaC, TsaD, Tsae, GlyA, MnmC, MnmE og GidA blev klonet til pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) som små allestedsnærværende modifikator (SUMO) proteinfusionsproteiner, hvor his-tag, SUMO protein og modifikationssymer blev arrangeret tandemly. Gener for TsaB og TrmD blev klonet til pET15b som hans-tag fusionsprotein. Alle gener blev klonet med Gibson-samlingsteknik (#E2611, Ny England Biolabs, USA). Resulterende plasmider blev omdannet til en E. coli BL21(DE3) stamme og dyrket i 1 L LB medium til en OD660 på 0,6–1,0 ved 37 liter C. Overekspression blev induceret ved tilsætning af IPTG til en endelig koncentration på 1 mM for TsaB, TsaC, TsaD, TsaE og TrmD eller 0,1 mM for GlyA, MnmC, MnmE og GidA. Efter 3 timers dyrkning ved 37 liter C blev celler høstet. TsaB -, TsaC -, TsaE -, TrmD-og MnmE-overeksprimerede celler blev resuspenderet i 40 mL lysisbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2 og 7 mM 2-mercaptoethanol) og forstyrret ved sonikering. Det resulterende lysat blev centrifugeret, og supernatanten blev udvundet og blandet med 5 mL komplet his-tag Oprensningsharpiks (#05893801001, Roche, Sverige) i 1 time med rotator. Harpiksen blev vasket med 100 mL lysisbuffer, og derefter blev proteinet elueret med 25 mL Elueringsbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidasol og 7 mM 2-mercaptoethanol). TsaB og TrmD blev koncentreret af Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) og derefter dialyseret mod Lagerbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-mercaptoethanol og 30% glycerol). De blev flashfrosset med flydende nitrogen og opbevaret ved -80 liter C. For TsaC, TsaE og MnmE blev Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) tilsat til de genvundne fraktioner til en endelig koncentration på 23 liter/ml for at fjerne det his-tagged SUMO protein. Fraktionerne blev dialyseret mod Spaltningsbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl og 7 mM 2-mercaptoethanol) natten over, mens Spaltningsbufferen indeholdt 500 mM KCl til mnme-forberedelse. De dialyserede prøver blev igen blandet med 5 mL komplet his-tag Rensningsharpiks med rotator. Derefter blev de gennemstrømningsfraktioner, der indeholder modifikationsfraktioner, opsamlet. Genvundne prøver blev koncentreret af Amicon Ultra 3 kDa for Tsae eller Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) for TsaC og mnme. De blev dialyseret mod Lagerbuffer, flashfrosset med flydende nitrogen og opbevaret ved -80 liter C. Til GlyA-forberedelse indeholdt al buffer 10% Glycerol, og de andre procedurer var de samme som mnme-præparat. TsaD viste sig at være uopløselig efter sonikering. Proteinet blev derfor pelleteret ved centrifugering ved 20.400 liter g ved 4 liter C i 45 minutter, og det blev resuspenderet i lysisbuffer suppleret med 4% Triton H-100. Suspensionen blev igen pelleteret ved centrifugering ved 20.400 liter g i 45 minutter. Pelleten blev opløst med lysisbuffer suppleret med 6 M urinstof. Den anden procedure var den samme som mnme-præparatet bortset fra at alle buffere indeholdt 2 M urinstof. Til mnmc-forberedelse var alle trin indtil fjernelse af his-tagged SUMO-protein det samme som GlyA-præparat. Fordi MnmC ikke specifikt bundet til his-tag-rensningsharpiksen, blev rensningen med anionbytningskromatografi valgt. Opløsningen efter Ulp1-behandling blev dialyseret mod ieks-buffer (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 7 mM 2-mercaptoethanol) og derefter blev de påført på en 5 mL HiTrap hver HP-kolonne (#17115401, GE Healthcare, USA). Søjlen blev vasket med 25 mL IEKS-buffer, og derefter blev MnmC elueret med en foringsgradient fra 100 mM til 1 M KCl i ieks-buffer. Fraktioner indeholdende MnmC blev koncentreret af Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA), dialyseret mod Lagerbuffer, flashfrosset med flydende nitrogen og opbevaret ved -80 liter C. Vi bemærker, at vi kan dele alle plasmiderne på anmodninger.

fremstilling af Ivttrna

gener for hver iVTtRNA (supplerende Data 1) blev klonet ind i pgemeks-1-vektoren (#P2211, Promega, USA) mellem BamHI-restriktionsstederne. Ved anvendelse af de resulterende plasmider som skabeloner blev DNA-skabeloner til in vitro-transkription PCR-amplificeret ved anvendelse af en T7-promotorprimer som fremadgående primer og passende omvendte primere for hver iVTtRNA (supplerende Data 1). Hver omvendt primer indeholdt en 2 ‘- metoksi modifikation ved det andet nukleotid fra 5’-terminalen for at forhindre skabelonuafhængig tilsætning af et ekstra nukleotid28. Produkterne blev oprenset ved phenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1) ekstraktion efterfulgt af ethanoludfældning, og præcipitanter blev opløst i vand. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). RNase P-komponenter sammensat af C5-protein og M1-RNA blev efterfølgende tilsat til reaktionsblandinger ved 150 nM til fjernelse af de 27 ekstra nukleotider, og reaktionerne blev inkuberet i 1 time ved 37 liter C. transkriberede ivttrna ‘ er blev derefter behandlet med sur phenolekstraktion efterfulgt af chloroform/isoamylalkohol (10:1) ekstraktion, derefter oprensning ved anionbytningskromatografi. Prøver indeholdende ivttrna ‘ er blev indlæst på 10 mL hitrap hver HP-kolonne (#17115401, GE Healthcare, USA) og vasket med en puffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 og 200 mM KCl). ivttrna ‘ er blev elueret med en lineær gradient fra 200 mM til 1 M KCl i kV buffer. Fraktioner indeholdende mål ivttrna ‘er, bestemt af urinstof-side, blev genvundet ved isopropanoludfældning, og udfældede ivttrna’ er blev opløst i vand og opbevaret ved -80 liter C indtil brug. Vi bemærker, at vi kan dele alle plasmiderne på anmodninger.

modifikation af iVTtRNA

t6a37 modifikation blev udført i reaktionsblandingen indeholdende 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pyridoxal-5′-phosphat -, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36.4 µM SAM, 0.1 enhed/µL rekombinant RNase-hæmmer (#2313 En, TaKaRa, Japan), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2.5 µM MnmC, 6 A260 enhed/mL tRNAGluUUC eller tRNAGluCUC. Efter inkubation ved 37 liter C for 2 timer for t6a37 og m1g37 modifikation eller 4 timer for mnm5u34 modifikation blev tRNA ‘ er behandlet med sur phenolekstraktion efterfulgt af chloroform/isoamylalkohol (10:1) ekstraktion og genvundet ved isopropanoludfældning. Udfældede tRNA ‘ er blev opløst i vand og opbevaret ved -80 liter C. Til mnm5u34-modifikation blev reaktionen igen udført med genvundne tRNA ‘ er. De blev behandlet med sur phenolekstraktion efterfulgt af chloroform/isoamylalkohol (10:1) ekstraktion, afsaltet af MicroSpin G-25 kolonner (#27532501, GE Healthcare, USA) og genvundet ved isopropanoludfældning. Udfældede tRNA ‘ er blev opløst i vand og opbevaret ved -80 liter C. for at kvantificere modifikationseffektiviteten blev 57,1 liter Thr anvendt i stedet for 1 mM Thr, og blandingen uden TsaD blev anvendt som kontrol til t6a37-modifikation. 36.Der blev anvendt 4 lusm S–adenosyl-methionin, og blandingen uden TrmD blev anvendt som kontrol for M1G modifikation og uden GidA blev anvendt som kontrol for mnm5u34 modifikation. Efter inkubation ved 37 C, alikvoter (10 C) blev trukket tilbage og set på 25 mm GF/C filterskiver (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterskiver blev vasket to gange med 10% TCA, derefter ethanol, efterfulgt af måling af radioaktivitet med en flydende scintillationstæller. Til kvantificering af mnm5u-modifikation blev tRNA ‘ er oprenset som ovenfor, og derefter blev 0,02 A260-enhed spottet på filterskiverne i stedet.

Aminoacylering

Aminoacyleringsforsøg blev udført i henhold til en tidligere rapport47. Reaktionsblandinger (10 liter) indeholdt 100 mM HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 enhed/re-rekombinant Rnasehæmmer (#2313 a, TaKaRa, Japan), 50 nM eller 1,5 liter Aar svarende til hver aminosyre, 20 liter-aminosyre eller 68 liter Asn til asparagin-aminoacylering og 2 A260 enheder/mL tRNA. Til måling af methylering blev der i stedet anvendt en blanding af 0,6 liter Met og 3,4 liter kold L-methionin. Cys blev opnået ved at reducere-cystin med 50 mM DTT ved 37 liter C i 15 minutter. Til måling af cysteinylering var DTT-koncentrationen 5 mM. når der blev anvendt native tRNA-blandinger, blev der i stedet tilsat 40 A260 enheds/mL tRNA-blandinger (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Efter inkubation ved 37 kr. C i 30 minutter blev alikvoter (8 kr.) trukket tilbage og set på 25 mm GF/C filterskiver (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterskiver blev vasket to gange med 10% TCA, derefter med ethanol, efterfulgt af måling af radioaktivitet af en flydende scintillationstæller.

Octapeptidsyntese med det rene system

DNA-skabeloner, der koder for octapeptider, blev PCR-amplificeret med passende primere (supplerende Data 2) under anvendelse af pURE1-vektoren (#PUREV001, BioComber, Japan) indeholdende en T7-promotorsekvens og ribosombindingsstedet (Shine-Dalgarno-sekvens) som en skabelon. Forstærkede DNA-skabeloner blev oprenset ved hjælp af et PCR-rensningssæt (#28104, CHIAGEN, Tyskland). Octapeptidsyntesereaktioner indeholdt 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM kaliumglutamat, 13 mM magnesiumacetat, 2 mM spermidin, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM kreatinphosphat, 10 liter/mL 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolsyre, 0,2 liter ribosomer, 4 nM DNA-skabelon, proteinholdige rene systemkomponenter inklusive translationsfaktorer og aminosyrer og tRNA ‘ er. Koncentrationerne af proteinholdige rene systemkomponenter var som beskrevet i en tidligere protokol46. Vi bemærker, at alle 20 aaRSs var inkluderet i dette eksperiment, uanset DNA-skabeloner og testkodoner. Sammensætningen og koncentrationen af aminosyrer, der afhænger af testkodonerne, er anført i supplerende Data 2. Sammensætningen af ivttrna ‘er afhænger af skabelonen, og reaktioner blev udført under anvendelse af basale ivttrna’ er (supplerende Data 2) i nærvær eller fravær af test ivttrna ‘ er (supplerende Data 2). Koncentrationen af hver iVTtRNA blev fastsat til 6 liter. Når der blev anvendt native tRNA-blandinger, blev der i stedet tilsat 56 A260 enheds/mL tRNA-blandinger (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Reaktionerne blev udført i 60 minutter ved 37 C, og alikvoter blev trukket tilbage, spottet på 3 MM filterpapir (#1822-025, GE Healthcare, USA), kogt i 10% TCA ved 90 C i 30 minutter for at deacylere aminoacyl-RNA ‘ er. Radioaktiviteten i den 10% TCA-uopløselige fraktion blev målt med en flydende scintillationstæller.

proteinsyntese med det rene system

proteinsynteseforsøg blev udført med et Purefreks 2.0-sæt (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) uden tRNA-blandinger i opløsning i (Bufferblanding). Vi tilføjede desuden 0.2 met, 4 nM PCR-forstærket DNA-skabelon til DHFR-eller Sfgfp-ekspression (supplerende Data 3) og en specificeret mængde iVTtRNA-blanding eller nativ tRNA-blanding. Reaktionerne blev udført ved 30 eller 37 liter C i 12 timer, og syntetiserede proteiner blev analyseret.

analyse af syntetiserede proteiner

syntetiseret DHFR og sfgfp indeholdende radioaktivt Met blev analyseret med 15% SDS-side, og gelbilledet blev visualiseret ved hjælp af en BAS-5000 bio-imaging analysator (GE Healthcare, USA). Tidsforløbsanalyse af sfgfp-ekspression blev udført ved at måle sfgfp-fluorescens hvert 3.minut ved hjælp af et stepon-PCR-system (#4376373, Applied Biosystems, USA). Fluorescensbilleder af syntetiseret sfgfp i reaktionsblandinger blev opnået ved anvendelse af et LAS-4000 instrument (GE Healthcare, USA). Aktiviteten af syntetiseret DHFR blev målt som beskrevet tidligere44. Reaktionsblandinger (2 mL) indeholdt 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM ethanolamin, 100 mM NaCl, 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM EDTA, 100 liter dihydrofolsyre og en 10 liter alikvot af den rene reaktionsblanding, og de blev inkuberet ved 37 liter C i 15 minutter. Dernæst blev 20 mM NADPH tilsat til en endelig koncentration på 200 liter, og faldet i absorbans ved 340 nm blev målt over en periode på 10 minutter med et v-550 spektrofotometer (Jasco, Japan). En enhed af DHFR blev defineret som den mængde, der kræves for at behandle 1 dihydrofolsyre i 1 min ved 37 dihydrofolsyre.

LC-MS-analyse af syntetiserede proteiner

DHFR med FLAGSEKVENS ved dens Terminal (supplerende Data 3) blev syntetiseret med en Purefreks 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) uden tRNA-blandinger i opløsning i (Bufferblanding). Vi tilføjede desuden 4 nM PCR-forstærket DNA-skabelon til DHFR mærket med FLAGSEKVENS ved dens C-terminal (supplerende Data 3) og en specificeret mængde iVTtRNA-blanding eller native tRNA-blanding. Reaktioner blev udført ved 30 liter C i 12 timer. syntetiseret DHFR blev oprenset med Anti-FLAG m2 magnetiske perler (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Alikvoter (55 liter) af reaktionsblandingerne blev blandet med 245 liter af FLAGVASKEBUFFEREN (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg(OAc)2), og yderligere blandet med 30 liter perler i 1 time. perlerne blev vasket med 210 liter af FLAGVASKEBUFFEREN efterfulgt af vask med bufferen uden Mg(OAc)2 to gange (210 liter og 180 liter). Derefter blev DHFR elueret med 50 liter af FLAGVASKEBUFFEREN uden Mg(OAc)2, men suppleret med 100 liter/mL 3 gange peptid (#F4799, Sigma-aldrich, USA) efter forsigtigt blanding i 1 time. forberedelse af prøver til LC-MS-analyse blev udført i henhold til et faseoverføringsoverfladeaktivt middel (PTS) – hjulpet protokol48. Den 4. liter af en tæt PTS-buffer (100 mM natriumn-lauroylsarcosinat, 100 mM natriumn-lauroylsarcosinat og 500 mM NH4HCO3) blev tilsat til 40. De blev reduceret med 10 mM TCEP ved 37 liter C i 30 minutter, alkyleret med 20 mM jodacetamid ved 37 liter C i 30 minutter og slukket med 20 mM Cys. Hver reaktionsopløsning blev opdelt i to portioner. Den ene blev fordøjet af 10 ng / Liter Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) og 10 ng/liter trypsin (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) ved 37 liter C natten over. Den anden blev fordøjet af 10 ng/liter Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) ved 37 liter C natten over. Efter fordøjelsen blev 10% trifluoreddikesyre (TFA) sat til en slutkoncentration på 1%, og reaktionsopløsningerne blev centrifugeret ved 15.000 liter g i 5 minutter for at udfælde vaskemidlerne. Supernatanter blev afsaltet ved hjælp af selvforberedte trin tips49 og tørret med SpeedVac. LC-MS-analyse blev udført ved hjælp af et orbitrap massespektrometer (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA) udstyret med en nanospray ionkilde (Nanospray fleks, Thermo Fisher Scientific, USA) og et nano-LC-system (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). De tørrede peptidblandinger blev opløst i en opløsning indeholdende 5% acetonitril og 0,1% TFA, og hver prøve blev påført nano-LC-systemet. Peptider blev koncentreret under anvendelse af en fældesøjle (#164535, 0.075 liter 20 mm, 3 liter, anerkendelse af PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) og derefter adskilt ved hjælp af en nanokapillærkolonne (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 liter, C18, Nikkyo Technos, Japan) ved hjælp af to mobile faser A (0,1% myresyre) og B (acetonitril og 0,1% myresyre) med en gradient (5% B i 5 min, 5-45% B i 45 min, 45-90% B i 1 min og 90% B i 4 min) ved en strømningshastighed på 500 nL/min. Eluering blev direkte elektrosprøjtet (2,2 kV) i MS (positiv tilstand, scanningsområde på 200-1500 m/å, 60.000 FHM opløsning)50.