figur 2

struktur af CDK9/cyclin T1/Tat kompleks (model baseret på PDB 3MIA). Rygradsrepræsentation af CDK9-rester, der er til stede i den oprindelige FBF—struktur, er vist i grøn farve, cyclin T1—i violet og Tat-i rødt. Placering af thr-29, Ser-175, Thr-186 og C-terminal Ser/Thr-klynge er angivet. Også vist er ATP-bindingssted og SN-ioner, der letter tat-cyclin T1-interaktion.

4.1. C-Terminal CDK9-phosphorylering

en klynge af CDK9 ‘ S C-terminale rester (Ser-347, Ser-353 og Ser-357; Thr-350 og Thr-354) er autophosphoryleret, og denne phosphorylering er vigtig for bindingen af CDK9 / cyclin T1 til tjære-RNA . Dette blev påvist ved manglende evne til ensymatisk aktiv C-terminalt afkortet CDK9 til at binde tjære-RNA . Rekombinant CDK9 / cyclin T1, der var autophosphoryleret in vitro, blev effektivt dephoshoryleret af proteinphosphatase 2a (PP2A), men ikke proteinphosphatase-1 (PP1) . Behandling med PP2A forhindrede også binding af CDK9 / cyclin T1 til Tat og TAR RNA in vitro . Disse observationer antydede, at PP2A kan målrette mod C-terminalen af CDK9 og potentielt kontrollere interaktionen mellem P-TEFb og TAR RNA. Autophosphorylering af CDK9 associeret med præinitieringskomplekset in vitro blev hæmmet af TFIIH . PP2A blev senere fundet at være essentiel for basal HIV-1-transkription in vitro, da PP2A-udtømning hæmmede basal HIV-1-transkription og tilføjelsen af PP2A til de udtømte ekstrakter gendannede transkriptionen . PP2A-målet blev anset for at være Thr-29 (se nedenfor), men dette blev ikke bevist med sikkerhed, og effekten blev ikke reproduceret in vivo. I en tidlig undersøgelse observerede vi en mild induktion af basal, men ikke Tat-induceret HIV-1-transkription ved PP2A-hæmmende lave koncentrationer af okadainsyre . Vi observerede også induktion af basal og ikke den Tat-aktiverede HIV-1-transkription med overekspression af LIS1-protein, som vi fandt at binde og hæmme PP2A in vitro og interagere med HIV-1 Tat-protein . Samlet indikerer disse undersøgelser, at PP2A kan regulere basal HIV-1-transkription og også kontrollere interaktionen mellem P-TEFb og tjære-RNA ved dephosphorylering af C-terminalen af CDK9.

4.2. N-Terminal THR-29 phosphorylering

phosphorylering af CDK9 ‘ s Thr-29 blev vist at være induceret af HTLV-1 Skatteprotein . CDK9 / cyclin T1 rekrutteres til kromatineret HIV-1 LTR og andre promotorer af BRD4 . Denne brd4-rekruttering var knyttet til phosphoryleringen af CDK9 Thr-29 og kravet om PP2A-dephosphorylering af John Bradys gruppe . CDK9 skal phosphoryleres på Ser-175 for at binde til BRD4 , hvilket for nylig blev bekræftet af Jonathan Karns gruppe (Se detaljeret diskussion nedenfor). CDK9 ‘ s Thr – 29 er homolog med Thr-15 på CDK2, hvor phosphorylering hæmmer CDK2-aktivitet . Faktisk blev phosphorylering af Thr-29 vist at hæmme CDK9-aktivitet og HIV-1-transkription . Vi kunne imidlertid ikke påvise CDK9 Thr-29-phosphorylering i celler behandlet med okadainsyre, der inhiberede både PP2A og PP1 ved hjælp af en kombination af Hunter 2D-tyndlagselektroforese og massespektrometri med høj opløsning, som kun viste phosphorylering af C-terminal Ser/Thr-klynge og Ser-175, hvoraf kun Ser-175-phosphorylering blev induceret af okadainsyre . Således kan CDK9 Thr-29-phosphorylering muligvis ikke kontrolleres af PP2A og skal valideres yderligere for at afklare dens rolle under HIV-1-transkription.

4, 3. CDK9 ‘ S T-Loop Thr-186 phosphorylering

CDK9 t loop indeholder flere phosphoryleringssteder, herunder Ser-175 og Thr-186 (figur 2). Fosforylering af den konserverede Thr – 186 er nødvendig for CDK9 ‘ s ensymatiske aktivitet . Også foreningen af CDK9 / cyclin T1 med 7SK RNA snRNP kræver CDK9 ‘ s THR-186 phosphorylering . I CDK ‘er udløser phosphorylering af T-sløjfen større konformationsændringer, der åbner ATP-bindingslomme og et substratbindingssted, der gør CDK’ er fuldt aktive som en kinase .

for nylig viste kemisk-genetisk analyse ved anvendelse af selektiv kemisk inhibering af CDK7, at den alene er ansvarlig for CDK9 Thr-186 phosphorylering og for P-TEFb-afhængig CTD Ser-2 phosphorylering og histon H2B allestedsnærværende in vivo . Således fungerer CDK7/cyclin H, som tidligere blev identificeret som CDK-aktiverende kinase (CAK) for CDK ‘erne involveret i cellecyklussen, såsom CDK1, 2 og 4, også som CAK for CDK’ er involveret i reguleringen af transkription, der inkluderer CDK8, 9, 12 og 13 (gennemgået i ). Global analyse af kinaser, der kan phosphorylere CDK9 T-loop ved hjælp af siRNA identificeret Ca(2+)/calmodulin-afhængig kinase 1D (CaMK1D) slå ned ved siRNA nedsat THR-186 phosphorylering . Følgelig reducerede lille molekylinhibering af Ca (2+) signalvej THR-186 phosphorylering og hæmmede Tat-induceret HIV-1-transkription, men ikke Skattemedieret HTLV-1-transkription . Fordi Skattemedieret transkription er drevet af P-TEFb, er det fortsat at undersøge, hvorfor kun HIV-1-transkription blev påvirket.CDK9 Thr-186 phosphorylering kan også styres af cellulære phosphataser. Vores undersøgelser i det sidste årti fokuserede på PP1, som vi oprindeligt observerede for at stimulere Tat-afhængig HIV-1-transkription in vitro . Når vi overudtrykt en af de store nukleare regulatoriske underenheder af PP1, NIPP1 (nuklear hæmmer af PP1), observerede vi PP1-specifik hæmning af HIV-1 transkription og viral replikation . Vi bemærkede, at Tat indeholder en sekvens, der ligner et konserveret PP1-bindende RVF-motiv og viste, at dette motiv medierer Tat-binding til PP1 in vitro og in vivo, og at mutation af rester i PP1-bindingsmotivet (V36A og F38A) forhindrede Tat i at inducere HIV-1-transkription . CDK9, der blev phosphoryleret i dyrkede celler tilsat (32P)orthophosphat og behandlet med okadainsyre, blev effektivt dephophosphoryleret in vitro af PP1, men ikke PP2A i modsætning til den in vitro autophosphorylerede CDK9, der blev dephosphoryleret af PP2A og ikke af PP1 . Disse resultater antydede, at PP1 kan kontrollere CDK9-phosphorylering under HIV-1-transkription. Faktisk blev den alfa-katalytiske underenhed af PP1, PP1a vist at virke kooperativt og sekventielt med (Ca2+)-calmodulin-proteinphosphatase 2b (PP2B) i UV-bestrålede eller HC-metethylenbisacetamid (HMBA) – behandlede celler, hvori P-TEFb frigives fra 7SK snRNP-kompleks . Mens PP2B inducerer en konformationsændring i 7SK snRNP, dephosphorylerer PP1a CDK9 Thr-186 og letter frigivelserne af P-TEFb fra 7SK snRNP . CDK9 forblev dephosphoryleret, mens den var forbundet med BRD4 og blev rekrutteret til præinitieringskomplekset, hvor det kan genaktiveres af TFIIH-associeret CDK7. I overensstemmelse med denne undersøgelse observerede vi øget CDK9 Thr-186 phosphorylering i cellerne, der stabilt udtrykte et PP1-hæmmende peptid, det centrale domæne af NIPP1, og observerede også øget tilknytning af CDK9/cyclin T1 med 7SK RNA . Stabil ekspression af cdNIPP1 forstyrrede interaktionen mellem Tat og PP1 og hæmmede HIV-1-transkription , hvilket antyder, at der skal opretholdes en balance mellem phosphorylering og dephosphorylering af CDK9 Thr-186, og at forskydning af denne balance mod phosphoryleringen er hæmmende for HIV-1-transkription. Ekspression af cdNIPP1 på en fysiologisk relevant måde som en del af HIV-1-genomet i stedet for nef kraftigt hæmmet HIV-1-replikation , hvilket yderligere antyder, at PP1-målrettede hæmmere kan være til brug som potentielle anti-HIV-1-terapeutiske midler. Mens PP1 er kandidat til THR-186 dephosphorylering, fandt vi også, at det dephosphorylerer CDK9 Ser-175 (se nedenfor). En yderligere CDK9 Thr-186 phosphatase, magnesiumafhængig proteinphosphatase 1a (tidligere 2C) (PPM1A) blev identificeret ved anvendelse af et phosphataseekspressionsbibliotek og Thr-186-phosphospecifikke antistoffer . PPM1A overekspression faldt THR-186 phosphorylering og siRNA-medieret udtømning øgede det, og P-TEFb og PPM1A coprecipiterede også sammen, hvilket tyder på, at CDK9 kan være et fysiologisk substrat for PPM1A . En nyere undersøgelse viste, at CDK9 ‘ s THR-186-phosphorylering er nedsat i hvilende CD4(+) T-celler, som ikke er tilladelige til HIV-1-replikation, og at dette fald korrelerede med overflod af PPM1A og begrænset rekruttering af CDK9 til det store P-TEFb-kompleks . Dette fund understøtter yderligere nødvendigheden af det store kompleks til HIV-1-transkription og den kritiske rolle af PPM1A i HIV-1-undertrykkelsen i hvilende T-celler. Da PPM1A-ekspression ikke blev ændret ved aktivering af T-celler , kan endnu ukendte regulatoriske faktorer være involveret i reguleringen af PPM1A-aktiviteten.

4, 4. CDK9 ‘ S T-Loop Ser-175 phosphorylering

når CDK9/cyclin T1 adskiller sig fra det store P-TEFb-kompleks, kan CDK9 blive phosphoryleret på Ser-175. Mens Thr-186 dephosphorylering fuldstændigt hæmmede CDK9/cyclin T1 kinaseaktivitet, blev der ikke fundet nogen forskel i kinaseaktiviteterne af CDK9 S175A og CDK9 S175D mutanter af David Price og kolleger . I modsætning hertil viste han og hans gruppe, at CDK9 s175a mutant var inaktiv, mens CDK9 S175D mutant var aktiv som kinase . De viste også, at ser-175 phosphorylering fremmer binding af CDK9/cyclin T1 til Brd4 . Det blev foreslået, at phosphorylering af Ser-175 kan forårsage en konformationsændring i CDK9, hvilket tillader BRD4 at binde til cyclin T1 . I vores nylige undersøgelse fandt vi, at dynamisk inhibering af PP1 førte til eksklusiv phosphorylering af CDK9 Ser-175 som bestemt ved en kombination af Hunter 2D peptidkortlægning og LC-MS-analyse in vivo . Inhibering af PP1 førte til inhibering af CDK9-aktivitet og reduktion af rnapii-phosphorylering in vitro og in vivo . Vi fandt ud af, at CDK9 s175a mutant var aktiv og induceret HIV-1 transkription . Interessant nok, mens CDK9 S175D-mutant var mindre aktiv som kinase, dannede den lettere lille P-TEFb-kompleks, især når PP1 blev hæmmet. Således konkluderede vi, at PP1 aktiverer HIV-1-transkription ved dephosphorylering af CDK9 Ser-175-rest. Vi bemærkede også, at ser-175 phosphoryleringsaktivitet var meget mere rigelig end Thr-186-aktivitet i celleekstrakter, hvilket antyder, at CDK9-aktivitet kan undertrykkes naturligt gennem overphosphorylering af Ser-175. En nylig undersøgelse foretaget af Jonathan Karns gruppe viste, at aktivering af T-celler gennem T-cellereceptor (TCR) eller phorbolester (PMA) signalering stærkt induceret phosphorylering af CDK9 Ser-175 . Baseret på den molekylære modellering foreslog de, at phosphoryleret Ser-175 danner en hydrogenbinding med Tat Lys-14, der styrker bindingen af Tat til CDK9/cyclin T1 og fremmer HIV-1 transkriptionsaktivering . Også i overensstemmelse med de tidlige observationer blev CDK9 S175A-mutation fundet at afskaffe bindingen til BRD4 . I overensstemmelse med vores observationer viste CDK9 s175a-mutant sig også i høj grad at inducere Tat-afhængig latent HIV-1-reaktivering, som Jonathan Karn og hans kolleger tilskrev denne mutants manglende evne til at binde BRD4, mens han var i stand til at binde til Tat . De fandt også, at CDK9 phosphoryleret ved Ser-175 er udelukket fra 7SK RNP-komplekset , hvilket er parallelt med vores tidligere observation, at CDK9 S175D phosphomimetisk mutant blev fundet i lille P-TEFb-kompleks . Denne seneste undersøgelse peger således på Ser-175 som et vigtigt mål for HIV-1-reaktivering og potentiel udvikling af småmolekyleterapeutika.

Vi udviklede for nylig PP1-målrettede små molekyler, der blev modelleret til at passe til det rvksf-imødekommende hulrum på PP1 . Vi screenede næsten omkring 300.000 forbindelser og derefter fysisk screenede omkring 1000 forbindelser og identificerede en hitforbindelse, 1H4, som hæmmede HIV-1 transkription og replikation ved ikke-cytotoksiske koncentrationer . 1H4 forhindrede PP1-medieret dephosphorylering af et substratpeptid indeholdende en rvksf-sekvens in vitro, forstyrrede associeringen af PP1 med Tat i dyrkede celler og forhindrede translokationen af PP1 til kernen . Vi er i øjeblikket i færd med at raffinere hitforbindelsen og også udvikle PP1-målrettede forbindelser til aktivering af latent provirus.

4, 5. CDK9 ‘ S ser-90 phosphorylering

Vi og andre har tidligere vist, at HIV-1-transkription aktiveres af Tat i G1-fasen, men ikke i G2-fasen . Således antog vi, at Tat kunne engagere en cellecyklusregulerende kinase, som vi viste at være CDK2/cyclin E . HIV-1 hæmmes i CDK2-nedslagscellerne og også i makrofager-differentiering fra inducerede pluripotente stamceller med CDK2-nedslag , hvilket yderligere antyder, at CDK2 er vigtig for HIV-1-transkription og replikation. Den funktionelle forbindelse mellem CDK2 og CDK9 blev fundet, da vi analyserede inhibering af HIV-1 af jernchelatorer. HIV-1-transkription blev hæmmet i T-celler behandlet med jernchelatorer 311 og ICL670, som også hæmmede den cellulære aktivitet af CDK2 og CDK9 . Mere potente DI-2-pyridylketon-baserede tridentatjernchelatorer hæmmede HIV-1-transkription og virusreplikation ved meget lavere koncentrationer end 311 eller ILC670 og hæmmede også CDK2-og CDK9-aktivitet . Mens mekanismen for CDK2-inhibering endnu ikke er afklaret, vil den sandsynligvis omfatte induktion af p21 gennem opregulering af hypoksiinduceret faktor 1 (HIF-1), da jernudtømning fjerner jern fra prolylhydroksylase og øger HIF-1 og HIF-2 proteinniveauer, der efterligner virkningen af hypoksi . Vi analyserede CDK9-phosphorylering ved CDK2 in vitro og identificerede et motiv (90SPYNR94), der repræsenterede et konsensus-CDK2-phosphoryleringssted, og som effektivt blev phosphoryleret . Phosphorylering af CDK9 på Ser – 90 blev påvist med phosphospecifikke antistoffer, og det blev reduceret efter nedskydningen af CDK2. CDK9 s90a mutant association med det store P-TEFb-kompleks blev reduceret, og dets overekspression hæmmede HIV-1-transkription. I modsætning hertil viste CDK9 s90d-mutant uændret tilknytning til store og små P-TEFb-komplekser og induceret Tat-afhængig HIV-1-transkription. Den phosphomimetiske S90 viste imidlertid et samlet fald i CDK9-ekspression, hvilket antyder, at en phosphorylering/dephosphoryleringsbalance skal opretholdes for at danne de store og små P-TEFb-komplekser. Molekylær modellering viste, at Ser-90 af CDK9 var placeret på en fleksibel sløjfe udsat for opløsningsmiddel, hvilket antyder, at den muligvis gennemgår phosphorylering (også set på figur 2). Således identificerede vores nylige undersøgelser et nyt regulatorisk phosphoryleringssted på CDK9, der kan være målrettet mod aktivering eller hæmning af HIV-1-transkription.

5. Konklusion

phosphorylering og dephosphorylering af specifikke steder på CDK9 forekommer under hele transkriptionsprocessen og skal kontrolleres tæt. Ændringer ved visse threonin / serinrester bestemmer, om CDK9 associeres med stort P-TEFb-kompleks for at blive tilgængeligt til rekruttering, og om dissociationen af det store kompleks effektivt vil forekomme. Phosphorylering af Thr-186 i T-sløjfen af CDK9 og Ser-90, som ligger uden for T-sløjfen, bestemmer, om CDK9 forbliver sekvestreret i det inaktive store kompleks, og også om kinasen er aktiv, når den er adskilt fra 7SK snRNP. Dephosphorylering på et af disse steder fører til destabilisering af det store kompleks og frigivelse af CDK9/Cyclin T1, hvorved tat-rekruttering begrænses til HIV-1 LTR. Modifikationer i CDK9 ‘ S C-terminal tillader cyclin T1: TJÆREBINDING og dephosphorylering på disse steder forhindrer binding til toTAR RNA. I modsætning hertil hæmmer phosphorylering ved THR-29 eller Ser-175 rester CDK9. Således synes det nye billede af CDK9-regulering gennem phosphorylering at være komplekst og delvis parallelt med det, der er kendt for andre CDK ‘ er. De nyligt identificerede CDK9-målrettede kinaser, CDK7, CDK2 og fosfataser, PP1 og PPM1A vil sandsynligvis fremstå som nye mål for anti-HIV-1 og kræftterapeutika.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt vedrørende offentliggørelsen af dette papir.

anerkendelser

dette projekt blev støttet af District of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), Rcmi-NIH 2g12rr003048 fra programmet research Centers in Minority Institutions (RCMI) (Division of Research Infrastructure, National Center for Research Resources, NIH), Russian Foundation for Basic Research (no. 12-04-91444-NIS) og det russiske ministerium for uddannelse og videnskab (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). Forfatterne vil også gerne takke medlemmer af nekhai lab for forslag og undskylde dem, hvis arbejde ikke blev citeret på grund af pladsmangel.