casestudie: opdagelse af hæmmere af spændingsstyrede natriumkanaler

som en måde at illustrere de spørgsmål, der er relateret til opdagelse af ionkanallægemidler beskrevet ovenfor, vil resten af denne artikel beskrive en casestudie med fokus på identifikation af spændingsstyrede natriumkanalinhibitorer til behandling af kronisk neuropatisk smerte. Behandling af smerte er et alvorligt medicinsk problem, og der er en stor indsats i medicinalindustrien for at udvikle nye terapier til denne tilstand. Især er behandlingen af neuropatisk smerte, defineret som “kronisk smerte, der skyldes en primær læsion eller dysfunktion i det perifere nervesystem” af International Association for the Study of Pain (IASP), fortsat et stort uopfyldt medicinsk behov.

det er klart, at spændingsstyrede natriumkanaler (Nav1) spiller en nøglerolle i oprindelsen og udbredelsen af sensoriske nerveaktionspotentialer, der er nødvendige for smertesignalering. Lokale anvendelser af ikke-subtype-selektive natriumkanalblokkere, såsom novokain, giver fuldstændig smertelindring gennem ledningsblok. Imidlertid er denne tilgang til smertelindring begrænset til meget få applikationer, såsom tandprocedurer, da natriumkanaler også er afgørende for ledning i hjertet, CNS, skeletmuskulatur og ikke-sociceptive sensoriske neuroner. Nav1 super-familien består af 10 medlemmer (Yu og Catterall, 2004). Syv af disse undertyper, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 og Nav1.9, er til stede i det perifere nervesystem (PNS). Af disse udtrykkes Nav1.7, Nav1.8 og Nav1.9 overvejende i nociceptive neuroner og Nav1.3 er overvejende embryonisk, men er opreguleret i den voksne PNS efter skade. Dette begrænsede ekspressionsmønster gør disse undertyper attraktive mål for udvikling af nye smertestillende midler. Imidlertid er deres relative bidrag til smertesignalering og specifikt til neuropatisk smertesignalering uklar og kan variere med forskellige etiologier og sensoriske kvaliteter af smerte.

i fravær af molekylær selektivitet for en Nav1–undertype er det muligt specifikt at målrette Nav1-kanaler i en given konformationstilstand, mens natriumkanalafhængig impulsledning bevares. Denne type tilstandsafhængig hæmning er grundlaget for det terapeutiske vindue set med natriumkanalblokerende antikonvulsiva og antiarytmika, såsom lamotrigin og lidokain. Disse lægemidler har højere affinitet for kanaler i de åbne og/eller inaktiverede tilstande end for hvile, lukkede kanaler. Denne inhiberingsmekanisme favoriserer binding i hurtigt fyring eller delvist depolariserede væv. Neuropatisk smerte bør være følsom over for denne hæmmende mekanisme, da det menes at stamme fra skadeinducerede områder af depolariseringer, en hypotese, der understøttes af den kliniske effekt af lidokain administreret systemisk ved subanæstetiske doser. Desuden kan ikke-subtype-selektiv, statsafhængig blok have den største effektivitet siden individuel knockout af Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 eller Nav1.9 fremlagde ikke overbevisende beviser for en dominerende rolle for nogen af disse kanaler i neuropatisk smertesignalering.

baseret på denne begrundelse blev der truffet en beslutning om oprindeligt at forfølge ikke-subtype selektive, statsafhængige Nav1-hæmmere, mens man overvågede molekylær selektivitet ved at teste forbindelser af interesse på Nav1.7, Nav1.5 (den primære hjertenatriumkanal) og Nav1.8 parallelt.

et membranpotentialbaseret assay blev anvendt til at screene 200.000 forbindelser på Nav1.8 stabilt udtrykt i en rekombinant cellelinie. Dette HTS-assay var baseret på fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) mellem to medlemmer af et membranpotentialfølsomt farvestofpar udviklet af Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Nav1. 8 kanaler blev præinkuberet med testforbindelse og den kemiske agonist deltamethrin i fravær af ekstracellulært natrium. Efterfølgende tilsætning af natrium resulterede i membran depolarisering, og Nav1-blok blev kvantificeret som interferens med den cellulære depolariseringsproces.

selvom den oprindelige skærm på Nav1.8 gav en række hits, kun en enkelt forbindelse blev betragtet som en levedygtig bly til medicinsk kemiindsats. Før man forpligtede ressourcer til dette bly, blev forbindelsen, et disubstitueret succinimid betegnet BPBT’er (N-{ methyl }-N’-(2,2 ‘ -bithien-5-yl methyl)succinimid), undersøgt detaljeret ved manuel spændingsklemme i hele cellen. BPBT ‘ er viste sig at hæmme alle Nav1-undertyper med lignende styrke, og inhiberingen var afhængig af membranpotentiale og stimuleringsfrekvens. Denne hæmmende mekanisme var i overensstemmelse med højere affinitet af forbindelsen til kanaler i åben og inaktiveret tilstand sammenlignet med kanaler i hviletilstand. Derudover var BPBT ‘ er to størrelsesordener mere potente end de klinisk anvendte antikonvulsive og antiarytmiske Nav1-blokkere, hvilket hæmmede den inaktiverede tilstand af Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 og Nav1.2 med Ki-værdier på henholdsvis 0,09, 0,15, 0,08 og 0,14 liter og hviletilstand med Kr-værdier på henholdsvis 1,5, 1,3, 0,3 og 1,2 liter (Priest et al., 2004).

som sådan var BPBTS et attraktivt bly for medicinsk kemi; dets vigtigste forpligtelser er en dårlig farmakokinetisk profil. I løbet af profileringsanaloger af BPBT ‘ er, såvel som offentliggjorte Nav1–hæmmere, anvendelse af membranpotentialebaseret fluorescerende screeningsassay, strukturbaserede uoverensstemmelser mellem potenser bestemt i fluorescerende assay og ved elektrofysiologi blev bemærket for nogle få forbindelser. Disse uoverensstemmelser blev sporet til en interaktion mellem disse forbindelser og agonisten veratridin anvendt til at åbne Nav1.7 kanaler. Efterfølgende blev det fluorescerende assay modificeret således, at Nav1-kanaler blev præinkuberet med testforbindelse i fysiologiske ekstracellulære natriumkoncentrationer, og Nav1-afhængig depolarisering blev initieret ved agonisttilsætning (Fig. 1). Kanalinhiberende kræfter målt i dette modificerede assay korrelerede meget godt med den inaktiverede tilstandsinhibering bestemt ved elektrofysiologi på tværs af mange strukturelle klasser af Nav1-hæmmere., 2004; Liu et al., 2006).

selvom analoger af BPBTS ikke overgik den oprindelige bly i styrke, lykkedes det lægemiddelkemi at forbedre den farmakokinetiske profil og til sidst generere trans-N-{methyl }-N-methyl-n’-cyclopentan-1,2-dicarboksamid (CDA54) med 44% oral biotilgængelighed, en times halveringstid og en clearance på 14 ml / min / kg, som blev profileret i vid udstrækning in vivo (Brochu et al., 2006). I to rottemodeller af neuropatisk smerte reducerede CDA54 (10 mg/kg, givet oralt) signifikant nerveskadeinduceret adfærdsmæssig overfølsomhed med 44-67%. Den samme dosis / plasmakoncentration af CDA54 påvirkede ikke akut nociception (rat hot plate assay), motorisk koordination (rat rotorod assay) eller hjerteledning (elektrofysiologiske parametre målt i den kardiovaskulære hund). Disse egenskaber er i modsætning til de nuværende natriumkanalblokkere, der anvendes i klinikken, hvilket forårsager nedsat motorisk koordination hos rotter og CNS-bivirkninger hos mennesker ved alle effektive doser. Interessant nok var forholdet mellem hjerne og plasma for CDA54 ved oral dosering 0,03. I modsætning hertil akkumuleres klinisk anvendte Nav1-blokkere i CNS med et forhold mellem hjerne og plasma større end 10 for meksiletin. Disse data opnået med CDA54 antydede kraftigt, at inhibering af PNS-natriumkanaler alene er effektiv i dyremodeller for neuropatisk smerte, og at begrænsning af CNS-eksponeringer af Nav1-hæmmere er en levedygtig tilgang til udvikling af Nav1-hæmmere med et forbedret terapeutisk indeks.

en UHTS–kampagne ved hjælp af det membranpotentialbaserede assay, der er beskrevet for at screene for inhibitorer af Nav1.7, opdagede den nye 1-kanals inhibitorer (Hoyt et al., 2007; Thomas et al., 2007). Denne klasse af inhibitorer viste et defineret struktur-aktivitetsforhold, og når de blev evalueret in vivo, var medlemmer af denne serie oralt effektive i gnaver neuropatisk smerte og epilepsi modeller. Det er vigtigt, at nogle medlemmer af denne klasse viste molekylær selektivitet for Nav1.7 kanaler., 2007). For eksempel forbindelse 2 i Fig. 2 var stærkt statsafhængig og 10 gange selektiv for Nav1.7 over Nav1.8 og Nav1.5. Det mest potente, omend ikke subtype-selektive, medlem af denne klasse af Nav1.7-hæmmere (forbindelse 1, BNSE; Fig. 2) blev tritieret. BNA binder med høj affinitet (Kd på 1,6 nM) til rekombinante Nav1.7 kanaler. Dette er den første demonstration af ligandbinding med høj affinitet til Nav1.7 og giver et værdifuldt screeningsværktøj til at søge efter Nav1.7-selektive forbindelser. Data opnået med strukturserien 1-2 – en antyder, at Nav1.7-selektive analoger kan identificeres, og med de passende farmakokinetiske egenskaber og lægemiddelmetabolismeegenskaber kan sådanne forbindelser udvikles som smertestillende midler, der potentielt viser forbedret tolerabilitet over eksisterende lægemidler, der anvendes til behandling af neuropatisk smerte. Støtte til muligheden for at udvikle subtype-selektive natriumkanalinhibitorer som nye analgetika kommer fra den nylige rapport om et selektivt Nav1.8-middel med høj affinitet, som givet intraperitonealt var effektivt i en lang række gnaversmertemodeller (Jarvis et al., 2007).

en potentiel alternativ tilgang til søgning efter subtype-selektive natriumkanalinhibitorer ville være at screene for forbindelser, der er målrettet mod kanalgateringsmekanismer. Flere peptider har tidligere vist sig at modificere gating af natriumkanaler, men få små molekyler, især hæmmere, er blevet beskrevet for at fungere på denne måde. Et sådant middel er Proteks-II, et 30-aminosyre peptid oprenset fra tarantula Gift; dette peptid blokerer natriumkanaler og viser selektivitet for Nav1.7 (Smith et al., 2007). Proteks II binder til hviletilstanden af natriumkanaler og skifter spændingsafhængigheden af kanalaktivering til mere depolariserede potentialer. Stærke depolariseringer overvinder kanalinhibering, hvilket er et kendetegn for denne type gating modifier peptid. En mulig strategi til at identificere små molekyle mimetika af et gating modifier peptid er at radiomærkning Proteks-II i biologisk aktiv form, og at udvikle en bindende assay med Nav1.7 kanaler heterologt udtrykt i en cellelinie. Screening for små molekyler, der modulerer binding, kunne afsløre nye klasser af kanalinhibitorer, der skilles ind i membranen og forstyrrer bevægelsen af gating padle og derved forhindrer kanalåbning. En ekstra fordel ved denne type UHTS er, at der kan anvendes høje koncentrationer af testforbindelser, en situation, der er udelukket i farvestofbaseret screening på grund af fluorescensinterferens, der typisk forekommer med høje koncentrationer af mange små organiske molekyler. I betragtning af at nogle gating modifier peptider binder til regioner, der er unikke for specifikke kanaler inden for en superfamilie, kan subtype-selektive hæmmere identificeres ved hjælp af en sådan strategi.