tekst

kloning og ekspression

CCAAT/enhancer-bindende protein bærer sekvenshomologi og funktionelle ligheder med leveraktivatorprotein (LAP eller CEBPB; 189965) (Descombes et al., 1990). Se Landschul et al. (1989). brug af rotte Cebp-alpha til at screene et humant lever-cDNA-bibliotek efterfulgt af screening af et humant placenta-genomisk bibliotek. (1997) klonet CEBP-alpha i fuld længde. Det udledte 357-aminosyreprotein har et N-terminal transaktiveringsdomæne og et C-terminal DNA-bindende og dimeriserings domæne. Northern blot-analyse detekterede høj ekspression af et 2,7 kb CEBP-alfa-transkript i human placenta, lever og milt. Lavere ekspression blev påvist i kolon, glat muskel, lunge og nyremedulla, og der blev ikke påvist nogen ekspression i nyrebarken. Cebp-alpha blev også udtrykt i normal og psoriatisk human hud, i dyrkede humane keratinocytter og i rotte aorta og lever. Immunhistokemisk analyse detekterede CEBP-alfa i kerner af epidermale keratinocytter fra normal human hud og læsional psoriatisk hud. Intens farvning blev påvist i suprabasale celler, hårfollikel keratinocytter og glandulære sebocytter, men ikke i celler i det inflammatoriske infiltrat eller kapillærer.

svart et al. (1997) fastslog, at CEBPA-genet er intronløst.

Ved hjælp af somatiske cellehybrider, der adskiller enten humane eller rottekromosomer. (1992) kortlagde cebp-genet til humant kromosom 19 og rottekromosom 1. Disse resultater gav yderligere bevis for bevarelse af synteny på disse kromosomer (og på musekromosomet 7). Brug af humane/hamster somatiske cellehybrider indeholdende begrænsede fragmenter af humant kromosom 19, Hendricks-Taylor et al. (1992) kortlagde cebpa-genet til kromosom 19k13.1, mellem GPI (172400) og TGFB1 (190180) gener. Denne position blev bekræftet ved fluorescens in situ hybridisering. Birkenmeier et al. (1989) kortlagde Cebpa-genet til musekromosom 7.

Miller et al. (1996) karakteriserede promotoren af det humane gen, der koder for leptin (164160), en signalfaktor udtrykt i fedtvæv med en vigtig rolle i kropsvægthomeostase. De fandt ud af, at CEBPA modulerer leptinekspression og foreslog en funktion for CEBPA til behandling af menneskelig fedme. et al. (2001) fandt ud af, at CEBPA direkte interagerer med CDK2 (116953) og CDK4 (123829) og arresterer celleproliferation ved at hæmme disse kinaser. En region mellem aminosyrer 175 og 187 af CEBPA blev bestemt til at være ansvarlig for direkte inhibering af cyclinafhængige kinaser og forårsagede vækststop i dyrkede celler. CEBPA hæmmede CDK2-aktivitet ved at blokere forbindelsen mellem CDK2 og cycliner. Aktiviteterne i Cdk4 og Cdk2 blev øget i mus Cebpa knockout lever, hvilket fører til øget spredning.

den myeloide transkriptionsfaktor CEBPA er afgørende for normal granulopoiesis, og dominerende-negative mutationer af cebpa-genet findes i en betydelig andel af maligne celler fra patienter med myeloblastiske undertyper (M1 og M2) af akut myeloid leukæmi (AML; 601626). Pabst et al. (2001) viste, at aml1 (RUNK1; 151385)-eto (CBFA2T1; 133435) fusionsprotein undertrykte cebpa-ekspression. Helbling et al. (2004) fandt ud af, at det leukæmiske AML1-MDS1-EAI1 (AME; se 151385) fusionsprotein undertrykte cebpa-protein. I modsætning til aml1-eto-fusionen kunne AME ikke undertrykke cebpa mRNA-ekspression. Helbling et al. (2004) fandt ud af, at en formodet hæmmer af cebpa-translation, calreticulin (CRT; 109091), blev stærkt aktiveret efter induktion af AME i et cellelinjeforsøgssystem (14,8 gange) og i ame-patientprøver (12,2 gange). Desuden gendannede hæmning af CRT ved små interfererende RNA cebpa-niveauer. Disse resultater identificerede CEBPA som et nøglemål for det leukæmiske fusionsprotein AME og antydede, at modulering af CEBPA med CRT kan repræsentere en mekanisme involveret i differentieringsblokken i AME leukæmier.

Menard et al. (2002) viste, at Cebpa blev udtrykt i kortikale stamceller fra mus og kunne inducere ekspression af et reportergen indeholdende den minimale promotor af alfa-tubulin (TUBA1A; 602529), et neuronspecifikt gen.

Skokova et al. (2006) fandt signifikant nedsat eller fraværende lef1 (153245) ekspression i arresterede promyelocytter fra patienter med medfødt neutropeni (se 202700). Konkurrencedygtige bindings-og kromatinimmunudfældning (ChIP) analyser viste, at LEF1 direkte bundet til og reguleret CEBPA, hvilket antyder, at LEF1-afhængig nedregulering af CEBPA ved medfødt neutropeni fører til en modningsblok i promyelocytter svarende til den, der ses i cebpa dominerende-negativ AML. ved peptidanalyse af nukleare proteiner, der interagerede med CEBPA, Bararia et al. (2008) identificeret TIP60 (KAT5; 601409) som cebpa-bindende partner. Interaktionen blev bekræftet ved coprecipitation analyse og protein pull-ned assays. TIP60 forbedrede cebpa ‘ s evne til at transaktivere en tk (TK1; 188300) promotor indeholdende 2 CCAAT-steder, og histonacetyltransferaseaktiviteten af TIP60 var nødvendig for dens samarbejdsevne med CEBPA. Domæneanalyse afslørede, at TIP60 interagerede med CEBPA ‘ s DNA-bindende og transaktiveringsdomæner. Immunopræcipitationsanalyse viste, at TIP60 blev rekrutteret til promotorerne af CEBPA og GCSFR (CSF3R; 138971) efter beta-østradiol-induceret differentiering af k562 myelogene leukæmiceller, som var samtidig med histonacetylering ved cebpa-og GCSFR-promotorerne.

Reddy et al. (2009) viste, at microRNA-661 (MIR661; 613716) nedreguleret ekspression af MTA1 (603526), et gen, der er opreguleret i flere kræftformer. De identificerede formodede cebp-alfa-bindingssteder i promotorregionen af MIR661-genet. Reportergenanalyser viste, at CEBP-alpha opregulerede MIR661-ekspression i transficerede HeLa-og MDA-231 brystkræftceller. Ekspression af cebp-alpha og MIR661 var omvendt proportional med mta1 i brystkræftcellelinjer, og niveauet af MTA1-protein blev gradvist opreguleret med stigende metastatisk potentiale. Overekspression af MIR661 i MDA-231 brystkræftceller hæmmede cellemotilitet, invasivitet og forankringsuafhængig vækst, og det reducerede deres evne til at danne tumorer i en fremmedartet model. Reddy et al. (2009) konkluderede, at CEBP-alpha nedregulerer mta1-ekspression og kræftcellevækst ved at opregulere ekspression af MIR661.

Di Ruscio et al. (2013) præsenterede data, der viser, at aktiv transkription regulerer niveauer af genomisk methylering. De identificerede en ny nuklear ikke-polyadenyleret ikke-kodende RNA (ncRNA), der stammer fra CEBPA-genlokuset, der er kritisk til regulering af den lokale DNA-methyleringsprofil. De kaldte dette ncRNA ‘ekstrakodende CEBPA’ (ecCEBPA), fordi det omfatter hele mRNA-sekvensen i samme sanseorientering. ecCEBPA binder til DNMT1 (126375) og forhindrer cebpa gen locus methylering. Dyb sekventering af transkripter associeret med DNMT1 kombineret med genomskala methylering og ekspressionsprofilering udvidede generaliteten af dette fund til adskillige genlok. Di Ruscio et al. (2013) konkluderede, at disse resultater afgrænsede arten af DNMT1-RNA-interaktioner og foreslog strategier for genselektiv demethylering af terapeutiske mål i humane sygdomme.

i musens primære B-celler, Di Stefano et al. (2014) fandt, at forbigående cebpa-ekspression efterfulgt af Oct4 (164177), Sok2 (184429), Klf4 (602253) og Myc (190080) (samlet kendt som Oskm) – aktivering inducerer en 100 gange stigning i induceret pluripotent stamcelle (IPS) – omprogrammeringseffektivitet, der involverer 95% af befolkningen. Under denne konvertering bliver pluripotens og epitel-mesenkymale overgangsgener markant opreguleret, og 60% af cellerne udtrykker Oct4 inden for 2 dage. CEBPA fungerer som en pathbreaker, da det forbigående gør kromatinet af pluripotensgener mere tilgængeligt for DNaseI (125505). Cebpa inducerer også ekspressionen af Dioksygenase Tet2 (612839) og fremmer dens translokation til kernen, hvor den binder til regulatoriske regioner af pluripotensgener, der bliver demethyleret efter oskm-induktion. I tråd med disse fund forbedrer overekspression af Tet2 oskm-induceret B-celle omprogrammering. Da cebpa-induceret immuncellekonvertering også er påkrævet, er dataene fra Di Stefano et al. (2014) angav, at TET2 giver en mekanistisk forbindelse mellem IPS-celleprogrammering og B-celle transdifferentiering.

akut Myeloid leukæmi

hos berørte medlemmer af en familie med akut myeloid leukæmi (AML; 601626), Smith et al. (2004) identificerede en kimlinie 1-bp-deletion (212delc) i CEBPA-genet, hvilket resulterede i tilstedeværelsen af 5 cytosinrester i et område, hvor 6 cytosinrester er til stede i vildtype-sekvensen. Åbenlys leukæmi udviklede sig i Faderen i en alder af 10 år, i den førstefødte søn i en alder af 30 år og i den sidst fødte datter i en alder af 18 år.

somatiske mutationer

Pabst et al. (2001) bemærkede, at CEBPA i det hæmatopoietiske system udelukkende udtrykkes i myelomonocytiske celler. Det opreguleres specifikt under granulocytisk differentiering. Der observeres ingen modne granulocytter i cebpa-mutante mus, mens alle de andre blodcelletyper er til stede i normale proportioner. Ved akut myeloid leukæmi (601626) er den mest fremtrædende abnormitet en blok i differentiering af granulocytiske eksplosioner. Med denne baggrundsinformation, Pabst et al. (2001) undersøgte prøver fra AML-patienter og demonstrerede, at CEBPA er muteret hos 16% af AML – m2-patienter, der mangler 8;21 translokation (ETO, 133435; RUNK1, 151385). De fandt ud af, at 5 mutationer i N-terminalen afkortede proteinet i fuld længde, men påvirkede ikke 30-kD-proteinet, der blev initieret længere nedstrøms. De muterede proteiner blokerede vildtype C / EBP-alfa-DNA-binding og transaktivering af granulocytmålgener på en dominerende negativ måde og inducerede ikke den granulocytiske differentiering. Dette var den første rapport om cebpa-mutationer i human neoplasi. Pabst et al. (2001) detekterede 5 sletninger, 2 indsættelser og 4 punktmutationer i cebpa-genet (se f.eks. 116897.0001-116897.0003). Alle sletninger forårsagede et skift i den samme alternative læseramme, da antallet af manglende basepar var (3n+1). Gennemsnitsalderen ved diagnosticering af patienter med cebpa-mutationer var 66 år. Cebpa-mutationer blev fundet hos 7, 3% af AML-patienterne.

Snaddon et al. (2003) erklærede, at T(8;21) translokationen findes i 10 til 15% af tilfældene med AML, især dem af M2-undertypen, hvor den tegner sig for 40% af tilfældene. Ved hjælp af en PCR-SSCP-og sekventeringsmetode screenede de for CEBPA-mutationer hos 99 patienter med AML-type M1 eller M2. De identificerede 9 somatiske cebpa-mutationer hos 8 patienter. Alle mutationerne blev grupperet mod proteinets C-terminal. To patienter bar bialleliske mutationer: den ene var homosygøs til en 57-BP-indsættelse ved nukleotid 1137 (116897.0004) og den anden var sammensat heterosygøs til en 27-bp-indsættelse ved nukleotid 1096 (116897.0005) og en 4-bp-indsættelse (GGCC) ved nukleotid 363 (116897.0006).

for at udforske udviklingen af genregulering, Schmidt et al. (2010) brugte kromatinimmunudfældning med sekventering med høj kapacitet til eksperimentelt at bestemme den genomomfattende belægning af 2 transkriptionsfaktorer, CEBPA og HNF4A (600281) i lever af 5 hvirveldyr: Homo sapiens, Mus musculus, Canis familiaris, Monodelphis domesticus (short-tailed opossum) og Gallus gallus. Selvom hver transkriptionsfaktor viste stærkt konserverede DNA-bindingspræferencer, mest binding var artsspecifik, og justerede bindingshændelser til stede i alle 5 arter var sjældne. Regioner nær gener med ekspressionsniveauer, der er afhængige af en transkriptionsfaktor, var ofte bundet af transkriptionsfaktoren i flere arter, men viste endnu ingen forbedret DNA-sekvensbegrænsning. Bindende divergens mellem arter kan i vid udstrækning forklares ved sekvensændringer i de bundne motiver. Blandt de bindende begivenheder, der er gået tabt i en slægt, gendannes kun halvdelen af en anden bindende begivenhed inden for 10 kb. Schmidt et al. (2010) konkluderede, at deres resultater afslørede store forskelle mellem arter i transkriptionel regulering og gav indsigt i lovgivningsmæssig udvikling.

i henhold til nomenklaturen foreslået af Cao et al. (1991) er CCAAT/enhancer-bindende protein C/EBP-alpha og NF-IL6 (LAP) er C/EBP-beta, hvor de tilsvarende gener er CEBPA og CEBPB (189965). CEBPB blev tidligere symboliseret TCF5.

Vang et al. (1995) fandt ud af, at mus, der var homosygøse til målrettet sletning af Cebpa-genet, ikke lagrede leverglykogen og døde af hypoglykæmi inden for 8 timer efter fødslen. I disse mutante mus var mængderne af glycogensyntase (138571) mRNA 50 til 70% af det normale, og den transkriptionelle induktion af generne for 2 glukoneogene stoffer, phosphoenolpyruvatcarboksykinase (261680) og glucose-6-phosphatase (613742) blev forsinket. Hepatocytterne og adipocytterne fra de mutante mus kunne ikke akkumulere lipid, og ekspressionen af genet for afkobling af protein (113730), den definerende markør for brunt fedtvæv, blev reduceret. Resultaterne viste, at C/EBP-alpha er kritisk for etablering og vedligeholdelse af energihomeostase hos nyfødte.

Flodby et al. (1996) lavede transgene knockout-mus, hvor CEBPA-genet blev selektivt forstyrret. De homosygøse mutante cebpa – / – mus døde, normalt inden for de første 20 timer efter fødslen og havde defekter i kontrollen med levervækst og lungeudvikling. Histologisk analyse afslørede, at disse dyr havde alvorligt forstyrret leverarkitektur, med acinar dannelse, i et mønster, der tyder på enten regenererende lever eller hepatocellulært carcinom. Pulmonal histologi viste hyperproliferation af type II pneumocytter og forstyrret alveolær arkitektur. Molekylær analyse viste, at akkumulering af glykogen og lipider i leveren og fedtvæv er nedsat, og at de mutante dyr er alvorligt hypoglykæmiske. Forfatterne fandt ved Northern blot-analyse, at niveauer af C-myc og c-jun RNA ‘ er specifikt induceres af flere fold i leverene til disse dyr, hvilket indikerer en aktiv proliferativ tilstand. De fandt ved immunhistologi, at cyclinfarvede celler er til stede i leveren af cebpa- / – mus med en 5 til 10 gange højere frekvens end normalt, hvilket også indikerer unormalt aktiv proliferation. Flodby et al. (1996) foreslog, at CEBPA kan have en vigtig rolle i erhvervelsen og vedligeholdelsen af terminal differentiering i hepatocytter.

mus, der mangler cebpa, har defekt udvikling af fedtvæv. Et al. (1999) brugte fibroblaster fra cebpa -/- mus i kombination med retrovirale vektorer, der udtrykte Cebpa og peroksisomproliferatoraktiveret receptor-gamma (PPARG; 601487) for at bestemme den nøjagtige rolle CEBPA i adipogenese. Forfatterne fandt ud af, at Cebpa -/- fibroblaster gennemgik fedtdifferentiering gennem ekspression og aktivering af Pparg. Cebpa-mangelfulde adipocytter akkumulerede mindre lipid og inducerede ikke endogent Pparg, hvilket indikerer, at krydsregulering mellem CEBPA og PPARG er vigtig for at opretholde den differentierede tilstand. Cellerne viste også et fuldstændigt fravær af insulin (INS; 176730)-stimuleret glukosetransport, sekundært til reduceret genekspression og tyrosinphosphorylering for Ins-receptoren (147670) og Ins-receptorsubstrat-1 (147545). Et al. (1999) konkluderede, at CEBPA har flere roller i adipogenese, og at krydsregulering mellem PPARG og CEBPA er en nøglekomponent i den transkriptionelle kontrol af denne cellelinie.