abstrakt
Spændingsgated L-Type Cav1.2 calciumkanaler par membran depolarisering til forbigående stigning i cytoplasmatisk fri Ca2+ koncentration, der initierer en række væsentlige cellulære funktioner, herunder hjerte-og vaskulær muskelkontraktion, genekspression, neuronal plasticitet og eksocytose. Inaktivering eller spontan afslutning af calciumstrømmen gennem Cav1.2 er et kritisk trin i reguleringen af disse processer. Den patofysiologiske Betydning af denne proces manifesteres i hypertension, hjertesvigt, arytmi og en række andre sygdomme, hvor acceleration af calciumstrømforfaldet bør udgøre en fordelfunktion. Det centrale spørgsmål i dette papir er inaktivering af Cav1.2 calciumkanal medieret af flere determinanter.
1. Introduktion
den spændingsstyrede indadgående Ca2 + strøm () er en almindelig mekanisme for forbigående stigning i den cytoplasmatiske frie Ca2+ koncentration udløst af celledepolarisering. Denne form for Ca2 + – signalering aktiverer essentielle cellulære processer, herunder hjertekontraktion , regulering af en glat muskelton , genekspression, synaptisk plasticitet og eksocytose . Komplet og hurtig afslutning af Ca2+-tilstrømning medieres af en indviklet mekanisme for spontan calciumkanalinaktivering, hvilket er afgørende for at forhindre Ca2+ overbelastning af cellen under handlingspotentialer og gendannelse af den hvilende sub-lutm cytoplasmatiske frie Ca2+ koncentration . Dette papir vil fokusere på molekylær basis og flere determinanter for Cav1.2 calciumkanalinaktivering.
2. Cav1. 2: udfordringer og løsninger
2.1. Molekylær kompleksitet
Cav1.2-calciumkanalen er et oligomerkompleks sammensat af A1C -, karr2-og Karr-underenhederne . Ionkanalporen dannes af A1C-peptidet (Figur 1), der er kodet af CACNA1C-genet. Hjælpemembranen og underenhederne er essentielle for den funktionelle ekspression og plasmamembran (PM) målretning af kanalen . De findes i flere genomiske isoformer genereret af fire cacnb–gener (CACNB1–4) og tre CACNA2D-gener (CACNA2D1-3). Alle tre underenheder er underlagt alternativ splejsning. Tilføjelse til kompleksiteten af Cav1 .2 molekylær organisation, har kurr-underenheder en tendens til at oligomerisere. Alt sammen genererer genomisk variabilitet, alternativ splejsning og hetero-oligomerisering en overflod af Cav1.2 splejsningsvarianter, der udtrykkes i celler på art -, væv-og udviklingsafhængig måde, mens ændringen af deres fine balance kan have betydelige patofysiologiske konsekvenser .
2.2. Udfordringer i udvælgelsen af værtscellen
naturligt forekommende mangfoldighed af Cav1.2 komplicerer fortolkningen af data opnået fra native celler, endsige enkeltkanaldataene. Dette ligger til grund for vigtigheden af Cav1.2-forskning i rekombinante ekspressionssystemer, hvor kanalens molekylære sammensætning og strukturen af dens bestanddele er foruddefineret. Denne eksperimentelle tilgang stødte imidlertid på det største problem med udvælgelsen af en passende værtscelle.
de fleste af undersøgelserne af calciumkanaler blev udført under anvendelse af HEK293 celler. Disse celler tilvejebringer høj ekspressionseffektivitet af rekombinante Ca2 + kanaler, men indeholder desværre endogene calciumkanaler, der udviser Ca2+ strømme op til 3 pA/pF . HEK293-celler tillader således kun tilstrækkelig undersøgelse af rekombinante Ca2+ – kanaler, når strømens amplitude er stor nok til at ignorere bidraget fra de endogene kanaler. Korrekt vurdering af de funktionelle determinanter for Ca2 + kanaler kræver imidlertid anvendelse af værtsceller, der er helt fri for endogene Ca2+ kanalunderenheder. Cos1-eller COS7-celler passer godt til dette krav, fordi de ikke genererer nogen mærkbar calciumstrøm, ikke indeholder endogene Ca2+ – kanalunderenheder eller deres forstadier og ikke viser nogen induktion af endogene Cav1.2-underenheder som reaktion på ekspressionen af de rekombinante . Kinetikparametre og spændingsafhængighed af aktivering og inaktivering af Cav1.2-kanalstrømmene målt i cos1-celler er i overensstemmelse med data opnået i andre ekspressionssystemer . En vigtig fordel ved COS-celler er deres relativt langsomme delingshastighed, der giver mulighed for bedre kontrol over effektiviteten af ekspression og samling af Cav1.2-kanalunderenheder af forskellig størrelse.
2, 3. Problemer med fluorescerende mærkning og måling
Fusion af GFP-lignende fluoroforer til n – og/eller C-termini af den rekombinante a1C eller til N-terminalen af Larsen ændrer ikke markant de elektrofysiologiske egenskaber af de udtrykte kanaler, muliggør anvendelse af fluorescerende og FRET (fluorescerende resonansenergioverførsel) mikroskopi til undersøgelsen af subcellulær distribution og samling af Cav1.2 samt indviklede aspekter af molekylær arkitektur og dynamik i kanalen. Kanalen bevarer store elektrofysiologiske egenskaber uændret, når a1C C-terminal sekvens kodet af distale eksoner 46-50 (Figur 1,rester 1833-2138 i A1C, 77) erstattes af ECFP. Imidlertid er a1C smeltet af dets N-eller / og C-termini til EYFP meget følsom over for fotoblegning, der irreversibelt inaktiverer det. Kendt som fluoroforassisteret lysinaktivering (FALI) begrænser denne interessante egenskab anvendeligheden af acceptor fotoblegning til målinger af FRET i Cav1.2 på grund af usikkerhed i kanalens funktionelle tilstand . Imidlertid afspejler den ratiometriske analyse af korrigeret bånd mellem fluorophorerne, smeltet sammen med halerne i A1C-og/eller kur-underenhederne, de reversible tilstandsafhængige strukturelle omlejringer af kanalen induceret af ændringerne af transmembranspænding under patchklemme .
2, 4. Rekombinant Cav1. 2: Hvad har det brug for til funktionelt udtryk, og hvordan ser det ud?
typiske egenskaber for en “vildtype” rekombinant Cav1.2 er illustreret i figur 2(A) ved hjælp af et eksempel på den allestedsnærværende humane A1C,77 isoform (GenBank nr. 34815). Når EYFP-mærket a1C blev udtrykt i cos1-celler alene, blev det fluorescerende mærkede kanalprotein diffust fordelt over cytoplasmaet og genererede ikke målbar calciumstrøm (figur 2(a), panel a). Den kvantitative analyse af fordelingen af A1C mellem PM og cytoplasma (figur 2(B)) bekræftede mangel på signifikant PM-målretning af A1C uafhængigt af tilstedeværelsen af purpur2 Purpur (Bar A og b). Udtryk af Cav-kur i fravær af-kur 2-kursist stimulerede PM-målretning af a1C, men kanalen forblev tavs (figur 2(a), panel c), medmindre-kursist 2-kursist blev coudtrykt (panel d). Således, β og α2δ underenheder er tilstrækkelige til, at den funktionelle kanal; under disse eksperimentelle betingelser, β underenheder stimulere PM målretning af den kanal, komplekse og, i overværelse af α2δ, lette spænding gating af Cav1.2-kanal.
rolle Cav1.2 hjælpeenheder. (A) Epifluorescerende billeder af de udtrykkelige cos1-celler, der viser fordeling af EYFPN-Kurt 1C opnået med YFP-filteret (skaleringsstænger, 4 larm) og spor af den maksimale calciumstrøm, der er registreret som reaktion på 600 ms-trin til +30 mV fra holdepotentialet mV (til venstre). (B) den Relative fordeling af EYFPN-α 1C i plasma membranen (PM) i cytoplasma i mangel (en) eller tilstedeværelsen af α 2δ (b), β 2d (c), eller α 2δ + β 2d (d). Forholdet mellem fluorescensintensitet i PM over området under PM blev gennemsnitligt efter baggrundssubtraktion i hver celle. Forholdet mindre end 1.0 angiver manglende signifikant PM-målretning ved hjælp af venstre 1C.* .
formen og udseendet af den maksimale calciumstrøm, der er vist i figur 2(a) (panel d), er ret typisk for den prip2-modulerede Cav1.2 . Dens vigtigste træk inkluderer den relativt langsomme forfaldshastighed og en stor del af den vedvarende resterende ende af den depolariserende puls . Det er klart, at sådanne egenskaber under langvarige handlingspotentialer kan føre til patogen calciumoverbelastning af cellen, hvis den ikke er afbalanceret af robuste kompenserende mekanismer. Det var den ultimative rolle Cav1.2 ved at definere varigheden af handlingspotentialet i hjerteceller, der udløste forskning og udvikling af calciumkanalblokkere, en klasse af lægemidler, der nu har et milliardmarked. Det er denne rolle Cav1.2, der stimulerer den nuværende interesse for identifikation af molekylære determinanter for Cav1.2 inaktivering i håb om at finde mere specifikke og mere effektive lægemidler.
2, 5. Sidst men ikke mindst en komplikation: Cav1.2 Clustering
en enkelt ventrikulær myocyt indeholder ~300.000 Cav1.2 kanaler, men kun ~3% af kanalerne er åbne i toppen . I modsætning til den populære tro er Cav1.2-kanaler ikke jævnt fordelt over plasmamembranen. I native neuronale og hjertemuskelceller danner de store klynger. Enkeltmolekylebilleddannelse af de funktionelle rekombinante EYFPN-A1C/lyr2a/lyr2 LYR-kanaler udtrykt i HEK293-celler afslørede klynger sammensat af ~40 kanaler, der var mobile i plasmamembranen . Både fluorescenskorrelationsspektroskopi og fluorescensgenopretning efter fotoblegningseksperimenter gav en lateral diffusionskonstant af prism2/s. den funktionelle betydning af cav1.2-klyngens mobilitet er ikke klar. Det antages, at i hjertemuskelceller kan sådan mobilitet begrænses ved interaktioner med andre proteiner, for eksempel ryanodinreceptorer . Størrelsen af Cav1 .2-klynger og deres specifikke tæthed i plasmamembranen afhænger af typen af udtrykt kur-underenhed. Afstanden mellem termini af nabo a1C-underenheder varierer fra 67 liter med neuronal/hjertelyrus1b til 79 liter med vaskulær liter 3. Den højeste tæthed af Cav1.2-klynger i plasmamembranen og den mindste klyngestørrelse blev observeret med rr1b til stede. Indsigt i molekylære mekanismer, der definerer arkitektur og egenskaber ved Cav1.2-klynger, er vigtig for bedre forståelse af patofysiologi af koblingen mellem Cav1.2-aktiviteten og de inducerede reaktioner i Ca2+ signaltransduktion.
3. Spænding-og Ca2+ – afhængig inaktivering af Cav1.2 Calciumkanalen
i tilfælde af Cav1.2 calciumkanaler er to forskellige mekanismer i kontrol af Ca2+ strøminaktivering. En mekanisme drives af Ca2 + ioner på den cytoplasmatiske side af plasmamembranen, mens den anden afhænger af transmembranspænding. Eksperimentelt udskiftning af Ca2 + til Ba2 + som ladebærer eliminerer Ca2 + – afhængig inaktivering (CDI), så de Ba2+-ledende calciumkanaler inaktiveres på en spændingsafhængig måde ved hjælp af hurtige (FI) og langsomme (SI) mekanismer . Disse tre inaktiveringsmekanismer, FI, SI og CDI, og deres vigtigste determinanter er illustreret på figur 3.
molekylære determinanter for Cav1.2 inaktivering. Sammenligning af vildtype Cav1.2 (A) med samme kanal berøvet CDI (B) og SI (C) determinanter. De fem vandrette paneler viser (a) arrangement af kritiske determinanter for inaktivering. ADSI er sammensat af konserverede hydrofobe aminosyrer i en -2 position af S6 segmenter i gentagelser II, III og IV (gule cirkler: Ala, Val og ile, resp.) samt Ser rest I -1 position af IS6 (cyan cirkel). Det Knastbindende domæne (CBD) af den røde 1C C-hale vises med et rødt afrundet rektangel. En underenhed (grøn) binder sig til domænet for interaktion mellem gentagelser I og II og på en Ca2+-afhængig måde til ik-regionen for underenheden af underenheden C-tail (ikke vist). Den distale struktur af kr2 (kr2ced, blå kugle) binder til CBD . B) bevis for coimmunudfældning af de angivne underenheder. (c) normaliserede spor af (sort) og (rød) og (d) spændingsafhængighed af (rød) og tidskonstant af FI (, sort) præsenteres for at illustrere CDI i (A) og mangel på CDI i (B) og (C). E) forbindelse mellem CDI og differentialmodulation af Kris-underenheder (D-modulering) i Cav1.2. A) differentiel modulering af inaktiveringen ved hjælp af 1A (sort spor) og 2a (grøn spor) i vægt Cav1.2. Forstyrrelse af CBD (kurst1c, 86) eliminerer CDI og SI målrettet af CDI og D-Kurstm (B). Mutation af ADSI (Kurt 1C,IS-IV) fjernede CDI og hæmmede SI fuldt ud, så kanalen forbliver ledende i varigheden af depolariseringsstimuleringen (C).
3.1. Ca2 + – afhængig inaktivering og Calmodulin-bindende domæne af a1C
Der er flere forskellige determinanter for CDI, men det var først i 1997, at Ca2+-sensorstedet for CDI var blevet indsnævret til en strækning af den 80-aminosyre C-terminale sekvens af A1C kodet af eksoner 40-42 (figur 2) markeret med rød blok i figur 3(a) (panel a). En naturligt forekommende splejsningsvariation i denne region i A1C,86 (figur 3(B)) hæmmede fuldstændigt CDI, da det fremgår af manglen på deceleration af strømmen med Ba2+ som ladningsbærer (panel c, sort spor) sammenlignet med (rød spor). Et andet karakteristisk træk ved den hæmmede CDI var manglen på den aktuelle størrelsesafhængighed af spænding (figur 3(B), panel d, åbne symboler), der forbliver i modsætning til U-formafhængigheden af tidskonstanten for hurtig inaktivering () på membranpotentiale i vildtype Cav1.2 (Se figur 3(a), panel d). To forskellige sekvenser, L og K, blev identificeret inden for denne 80-aminosyrestrækning,hvis a1C , 86-lignende mutationer i vildtype A1C er i overensstemmelse med de samme karakteristiske træk, hvilket antyder eksistensen af to tilstødende CDI-sensorer. En af dem blev skitseret i K-regionen som calmodulin – (CaM -) bindende ik-motiv, og senere blev forbindelsen mellem ik-motivet og CDI som det funktionelle Ca2+ – CaM-bindingssted bekræftet i tre uafhængige undersøgelser ved brug af CaM-mutanter, der mangler affinitet til Ca2+. Tilsvarende var La-motivet knyttet til CDI som apo-CaM-bindingssted udstyret med kanalens hviletilstand. Et enkelt CaM-molekyle bundet til dette Ca2+-afhængige CaM-bindende domæne (CBD) af A1C er kanalens største Ca2+ sensor .
Splice variation af A1C i CBD-regionen af A1C,86 hæmmer ikke kun CDI fuldstændigt, men fjerner også SI (figur 3(B), panel c) og fratager kanalen med differentiel følsomhed over for Kurt-underenhedsmodulation (figur 3(B), panel e) på trods af det faktum,at Purpur forbliver forbundet med a1C, 86 (figur 3(B), panel B). Dette indikerer, at alle tre egenskaber ved kanalen—CDI, SI og Kris-underenhedsmodulation—er knyttet sammen .
3.2. Langsom inaktivering
Der er fremlagt en række beviser for, at aminosyrer begrænset til den distale del af S6-segmenter i A1C spiller en vigtig rolle i SI . Systematisk undersøgelse af denne region skitserede den “årlige determinant for langsom inaktivering” (ADSI) som en struktur sammensat af fire stærkt konserverede aminosyrer i fire transmembransegmenter S6, der udgør den cytoplasmatiske ende af porerne (figur 3(a), panel a). Deres samtidige mutation (S405I i IS6, A752T i IIS6, V1165T i IIIS6 og I1475T i IVS6) genererer A1C, IS-IV-kanalen. Analyse af den aktuelle kinetik af A1C, IS-IV-kanalen viste en enorm acceleration af den hurtigt inaktiverende komponent (ren 10 ms), der udgør omkring 50% af den samlede (eller ) amplitude. Langsom spændingsafhængig inaktivering af A1C, IS-IV er fuldt hæmmet, og kanalen forbliver ledende i varigheden af depolarisering. Udskiftning af Ca2 + til Ba2 + som ladebærer (panel c) ændrede ikke signifikant dette mønster af inaktivering, mens analysen af spændingsafhængighed af for den inaktiverende komponent af gennem A1C,IS-IV-kanalen (panel d) bekræftede mangel på CDI. Udskiftningen af karrus1a til karrus2a (panel e) ændrede ikke inaktivering af A1C,IS-IV-kanalstrøm, hvilket tyder på mangel på differentiel karrus-underenhedsmodulation,mens co-immunopræcipitationsanalysen (panel B) gav direkte bevis for sammenhæng mellem a1C, IS-IV og karrus.
samlet set antyder resultater, der er præsenteret i figur 3, at der er en krydssnak mellem ADSI, CBD og kurr, understøttet af direkte interaktioner mellem dem og / eller specifik konformationsfoldning af bestanddelene i polypeptidbundtet, der ligger til grund for porerne. Faktisk blev både interaktionen mellem kurr og CBD og vigtigheden af funktionel konformation direkte demonstreret i levende celler, der udtrykte rekombinant Cav1.2.
3, 3. Rolle af A1c C-tail Folding
kvantitativ spændingsafhængig FRETMIKROSKOPI kombineret med patchklemme i den levende celle viste, at A1C-underenheden C-terminal hale er underlagt reversible spændingsstyrede konformationsarrangementer . Forankringen af A1C C-halen til den indre folder af plasmamembranen via pleckstrin homologi (PH) domæne smeltet til C-terminalen af A1C (A1C-) afskaffede denne konformationelle omlejring og hæmmede både SI og CDI (figur 4(A)) på en måde,der meget ligner den, der blev observeret med A1C, IS-IV (figur 3(C)). Denne ændring, der begrænsede mobiliteten af A1C-terminalen, havde stor implikation på Ca2 + signaltransduktion. CREB-afhængig transkriptionsaktivering forbundet med aktiviteten af Cav1.2 blev fuldstændigt undertrykt på trods af robust genereret af den “C-forankrede” kanal som reaktion på depolarisering. Frigivelse af A1c C-tail ved aktivering af PIP2-hydrolyse ved aktivering af phospholipase C gendanner fuldt ud alle disse mangelfulde funktioner, inklusive SI, CDI, og den effektive kobling af til den CREB-afhængige transkription . Det er således specifik funktionel foldning af A1c C-terminalhalen, der er afgørende for inaktivering. Det er afgørende for signaltransduktion, fordi det er designet til at bur den gennemtrængende Ca2+ i CaM fastgjort til CBD og til effektivt at flytte dette bur Ca2+ til nedstrøms signalmål forbundet med CREB-afhængig transkription eller hjertemuskelkontraktion . Frem for alt forekommer denne funktion i tæt koordinering med ekstracellulære stimuli, der aktiverer kanalen. Med hensyn til signaltransduktion er SI en lås på indersiden af kanalen, der frigøres af den gennemtrængende Ca2+ for at fremskynde dens lukning og indlede bevægelsen af den C-terminale hale .
3.4. A1C N-Terminus rolle
alle ovennævnte funktioner afhænger også af integriteten af A1c N-terminalen. Inaktiveringsegenskaberne for den rekombinante A1C/LS/LS2-kanal ændres ikke væsentligt ved strukturelle ændringer af den proksimale del af a1C N-halen, for eksempel ved fusion af et fluorescerende protein, ved PH-domæne eller ved alternativ splejsning af eksoner 1 / 1A , der genererer den lange isoform af a1C . Den allerførste funktionelle analyse af effekten af delvis deletion af A1c N-terminalen viste, at den er involveret i inaktivering, mens larr forhindrer inhibering af kanalen ved N-halen. Ved hjælp af FRETMIKROSKOPI kombineret med patch clamp, vi fandt ud af, at inaktivering forårsager stærk gensidig omorientering af A1C og lyr1a NH2-termini, men deres afstand over for plasmamembranen ændres ikke mærkbart . Denne relative mangel på mobilitet er tillagt af krus på en måde, der letter kanal respons på spænding gating. Eksperimenter med afkobling af A1c-underenheden N-terminalhale fra reguleringen af kanalen blev udført i fravær af kr. Forankring af A1C N-halen i den indre folder af plasmamembranen via fastgjort PH-domæne skabte betingelser, når PHN-A1C og kurt2 var tilstrækkelige til at generere en robust indadgående strøm (figur 4(B)). Denne kanal er imidlertid berøvet CDI og enhver spændingsafhængig inaktivering. Faktisk har hverken Ba2+ eller Ca2+ strøm vist mærkbart forfald (se overlappede spor). Frigivelse af A1c N-tail ved PIP2-hydrolyse ved aktivering af phospholipase C hæmmede fuldstændigt den ris-mangelfulde kanal . Lignende egenskaber, bortset fra en meget langsommere aktivering af strømmen, blev observeret ved sletning af hele (men 4 aminosyrer) N-terminal hale af a1C (figur 4(C)). Med begge typer frakobling af a1C N-terminal Hale—hvad enten det er gennem en sletning eller ved PM—forankring,-en forsinkelse i aktiveringen af helcellestrømmen ser ud til at være forbundet med forlængelse af den første latenstid. Enkeltkanaloptagelser afslørede, at sletning af N-halen i det væsentlige stabiliserede den åbne tilstand af den russiske kanal, som viste længere åbninger under langvarig depolarisering .
således medieres CDI af CBD-determinanter for a1C C – halen, af ADSI i det cytoplasmatiske poreområde og ved foldning af A1c C-og N-termini. Calmodulin integrerer disse determinanter og tilvejebringer en Ca2+-afhængig kontakt, der afslutter langsom inaktivering, frigiver a1C C-halen og pendler den tilknyttede Ca2+/calmodulin, der fungerer som en aktiverende stimulus af Ca2+ signaltransduktion .
3, 5. Udtryk og Inaktivering af Cav1.2 i Mangel af β og α2δ
Er β og α2δ underenheder afgørende betydning for det funktionelle udtryk for Cav1.2-kanal? Analysen af effekter af eksogene CaM (CaMex) på udtryk og egenskaber Cav1.2 i mangel af enten β eller α2δ klart viste, at hverken β eller α2δ er afgørende. Overekspression af Cameks ændrer kun lidt spændingsgatingen af A1C/lr2d / LR2-kanalen ved at skifte spændingsafhængigheden af aktivering og inaktivering mod mere negative potentialer, lette (men ikke accelerere) inaktivering og øge densiteten på cirka 2 gange . CDI bevares, som det fremgår af effekten af udskiftningen af Ca2+ for Ba2+ som ladningsbæreren, der signifikant øgede tidsforløbet for inaktivering af strømmen (figur 5(a)). Ny forståelse af den rolle, β og α2δ kommer med konstateringen af, at CaMex gør ekspression og aktivitet af a1C-kanal i mangel af β (Figur 5(B)) eller α2δ (Figur 5(C)), men ikke begge disse ekstra enheder. Selv om Cameks er strukturelt uden relation til Kristian og kristian2, støtter det menneskehandel, CDI og kanal gating. Kvantitativ analyse viste, at Cameks ikke stimulerede omfordeling af A1C i PM over cytoplasmaet, men signifikant forbedret plasmamembranmålretning af A1C/liter 2-kanaler. På den anden side forstærkede Cameks ikke den relative fordeling af A1C/lut2d-og A1C/lut2d/lut2-kanalerne i plasmamembranen over cytoplasmaet. Afhængig af den tilstedeværende hjælpeunderenhed er Cameks-understøttet kanalaktivitet af A1C/lr2d og A1C/LR2 LR under kontrol af forskellige mekanismer. På trods af dette udviser de Cameks-faciliterede, enkelt-hjælpeunderenhedskanaler ret lignende egenskaber, herunder signifikant langsommere inaktiveringskinetik af calciumstrømmen og et stærkt skift af spændingsafhængigheden af aktivering og inaktivering mod mere negative potentialer. I lighed med de konventionelle A1C/ls2d/LS2-kanaler bevarer disse kanaler CDI og høj følsomhed over for dihydropyridin-calciumkanalblokkere . Imidlertid viser kun A1C/karrus / Cameks-kanalen lettelse af calciumstrømmen ved stærk depolariseringspræpuls (data ikke vist).
da CaM forbundet med CBD er involveret i CDI, er det klart, at effekten af Cameks medieres af forskellige CaM-bindingssted(er). En af de potentielle kandidater på et sådant sted er til stede i den distale del af A1c N-terminalhalen . Det skal stadig ses, om dette sted faktisk spiller en integrerende rolle i det regulatoriske bundt af flere molekylære determinanter, der understøtter Cav1.2 inaktivering. En anden mulighed begrænser Cameks rolle til aktivering af silent Cav1.2 inden for de store klynger, hvor begrænset lokal tilgængelighed af CaM kan være årsagen til den lave fraktionsaktivitet beskrevet i afsnit 2.5. Uanset hvilke mekanismer der er forbundet med regulering af Cav1.2 af CaM, synes de at have ringe praktisk implikation til brug i medicin på dette tidspunkt, netop fordi CaM er et allestedsnærværende og multifunktionelt peptid, der regulerer mange andre cellulære funktioner, mens dets tilstedeværelse i Cav1.2 er afgørende for CDI.
4. – underenhed modulering af Cav1.2
bemærkelsesværdig molekylær variabilitet af karrus-underenheder, afspejlet i ændrede inaktiveringsegenskaber af den differentielt modulerede Cav1.2 , eksemplificeret i figur 3(a) (panel e) præsenterer en ny mulighed for udvikling af innovative tilgange til behandling af sygdomme forbundet med Ca2+ mishandling. Flere nylige observationer giver et fundament for en sådan optimistisk opfattelse. For det første udviser karrus – underenheder en tendens til at danne homo-og hetero-oligomerer, der blev direkte demonstreret ved en række biokemiske teknikker i både native celler og i rekombinant ekspressionssystem. Mens en forstørrelse af homooligomerisering af homooligomerisering signifikant øger densiteten af, heterooligomerisering af kur2-splejsningsvarianter med andre kur-underenheder kan også ændre Spændingsafhængigheden og Inaktiveringskinetikken i Cav1.2 . Det krisoligomerisering medieres af flere molekylære determinanter og har således brug for flere interventioner, der skal styres, for eksempel i tilfælde af patogen overekspression af luris2. Det ser imidlertid ud til at være mere gennemførligt at målrette mod selve lus2; molekylær determinant for lus2-specifik langsom og ufuldstændig inaktivering (se figur 2(a), panel d) blev identificeret som den 40-aminosyre C-terminale determinant (lus2ced) til stede i alle 7 kendte naturligt forekommende lus2-splejsningsvarianter. Afkobling af dets Ca2+-og CaM-uafhængig interaktion med CBD (figur 3(a), panel a) genopretter de inaktiveringsegenskaber , der er karakteristiske for karr1b/karr3-moduleret Cav1.2, der udviser hurtig og fuldstændig inaktivering af, som det blev vist i sletningseksperimenter. Efter min mening er en sådan selektiv afkobling af kr2ced fra binding til dets receptor i CBD en ny attraktiv strategi til at styre Ca2+ overbelastning, fordi andre krus-underenheder ikke skal påvirkes. Desuden bevares en krydssnak mellem Cav1.2 og det nærmeste mål Ca2+/CaM-afhængig proteinkinase II.
5. Konklusioner
dette papir har vist, at vi ved, hvordan man fremskynder inaktivering af Cav1.2 til mindre end 10 ms (figur 3(C)), for at fratage det fra inaktivering fuldstændigt (figur 4(B) og 4(C)) eller for at eliminere afhængigheden af dets udtryk fra Prip eller prip2 Prip uden væsentlige konsekvenser for inaktivering. Vi skitserede de ultimative roller i A1C termini og CaM til inaktivering, og alligevel har ingen af disse undersøgelser bragt os tættere på det ultimative mål om at styre calciummishandling forbundet med Cav1.2 undtagen Gamle og desværre ikke for selektive calciumkanalblokkere. Det eneste nye gennemførlige mål er patogen lut2-modulering af Cav1.2, hvor effektor-receptor-interaktion er etableret.
Med hensyn til molekylærbiologi er Cav1.2 bestemt blandt de mest komplicerede reguleringssystemer, der er kendt. Bemærkelsesværdig molekylær mangfoldighed af hver af Cav1.2 bestanddele giver anledning til flere genetiske/splejsningsvarianter af kanalen, der er genstand for adskillelse i store og forskellige klynger og til kontinuerlig funktionel ændring gennem homo – og hetero-oligomerisering af kurr og andre signalkomponenter, for ikke at tale om arter, væv og udviklingsvariabilitet. Vi er overraskede over redundansen af egenskaberne ved flere Cav1 .2 isoformer og er endnu mere overraskede, når nogle af dem, der kun viser “konventionelle” elektrofysiologiske egenskaber, viser sig at være forbundet med en sygdom. Når vi leder efter en forklaring, bør vores indsigt ikke intuitivt fokuseres kun på egenskaberne ved calciumstrømspændingsafhængighed, amplitude og varighed. Slutresponsen , såsom rumlig og tidsmæssig organisering af CREB-signalhændelser forbundet med specifik Cav1.2-isoform og dens konkurrence med andre (f.eks.campafhængige) signalmekanismer eller andre Cav1.2-isoformer, der er til stede, kan give nye ideer og åbne nye grænser til undersøgelse af rollerne for individuelle Cav1. 2-splejsningsvarianter i normale og syge celler og væv.
Abbreviations
| ADSI: | Annual determinant of slow inactivation |
| CaM: | Calmodulin |
| CBD: | Calmodulin-binding domain |
| CDI: | Ca-dependent inactivation |
| ECFP: | Enhanced cyan fluorescent protein |
| EYFP: | Enhanced yellow fluorescent protein |
| FALI: | Fluorophore-assisted light inactivation |
| FI: | Fast inactivation |
| FRET: | Fluorescent resonance energy transfer |
| GFP: | Green fluorescent protein |
| SI: | Slow voltage-dependent inactivation. |
