Diskussion

denne undersøgelse har afdækket en rolle for SR luminal Ca-bindende protein, CSK2 i regulering af eksitation–sammentrækningskobling og CICR i hjertet. Specifikt viser vi, at Ad-medieret overekspression af CSK2 dramatisk øgede størrelsen af begge cellegennemsnitlige Ica-inducerede Ca-transienter og spontane Ca-gnister i isolerede hjerteceller. Analyse af den stigende fase og ændringshastighed for disse Ca-signaler indikerede, at deres forøgede størrelse skyldtes langsom afslutning af underliggende Ca-frigivelsesstrømme fra SR. ud over at forlænge aktiv Ca-frigivelse blev dynamikken i funktionel genopladning af SR Ca-butikker også bremset i celler med forhøjede csk2-proteinniveauer, som indikeret ved nedsat restitutionstid for gentagne ca-gnister. Vi opnåede i det væsentlige de modsatte resultater i myocytter, hvor csk2-niveauer blev reduceret ved Ad-medieret antisense-transduktion. Disse myocytter viste kortere ca-frigivelse, men accelererede restitution af Ca-frigivelsessteder. Desuden forårsagede anvendelse af isoproterenol i periodisk stimulerede myocytter med nedsatte csk2-niveauer arytmogene oscillationer af intracellulære. Disse resultater viser, at CSK2 er en vigtig determinant for SR Ca-frigivelsesfunktionen, der virker ved at styre Ca-frigivelsesvarighed og frigivelsesstedets refraktoritet. I lyset af de observerede isoproterenolafhængige forstyrrelser i rytmisk ca-cykling i myocytter, der underudtrykker CSK2, er vores resultater relevante for at forstå de cellulære mekanismer for catecholamin-inducerede arytmier forbundet med mutationer af csk2-genet.

molekylære mekanismer for CSK2-handling. Vi tilskriver de observerede effekter af CSK2 på SR Ca-frigivelse til dette proteins evne til at fungere som en molekylær buffer, der styrer det frie i SR-luminalrummet (se foreslået skema i Fig. 5). Det er kendt fra lipid-dobbeltlagsundersøgelser, at binding af Ca til luminalaspektet af RyR-komplekset (dvs.luminal Ca-sensor) øger kanalaktiviteten, hvorimod ved sænket luminal reduceres kanalaktiviteten (EC50-styrke 1 mM; ref. 26). Fordi mange RYR ‘ er ville være i en aktiveret tilstand ved normale hvilende luminale Ca-niveauer (CRT 1 mM), ville sænkning af luminal under frigivelsesprocessen derfor reducere den samlede kanalaktivitet (en proces kaldet luminal Ca-afhængig deaktivering; ref. 3). Vores resultater antyder, at ved at stabilisere den lokale frie luminal i nærheden af RyRs under frigivelsesprocessen, csk2 bremser den luminale Ca-afhængige lukning af RyR-kanalen, derved øges mængden af Ca frigivet fra SR til cytosolen. CSK2 styrer også gendannelsesdynamikken for fri intra-SR under Ca-genoptagelse ved at tjene som en vask for Ca i SR-lumen. Således forstærker CSK2 ikke kun SR Ca-udstrømningen, men stabiliserer også CICR ved at modulere den funktionelle restitution eller beredskab af Ca-frigivelsessteder efter hver frigivelse. For nylig påberåbte vi en lignende mekanisme til at forklare virkningerne af Ca-chelatorer med lav affinitet (organiske salte) indlæst i SR Ved Ca-frigivelse (3). Betydningen af vores nuværende fund er, at de viser, hvordan frigivelsesprocessen styres af et endogent, SR-resident Ca-bindende protein, CSK2. De afslører også de patologiske konsekvenser af reducerede CSK2-mængder i SR af hjerteceller.

det er blevet foreslået, at CSK2 kunne påvirke Ca-frigivelseskanal-funktionen gennem direkte interaktioner med proteiner, der omfatter Ca-frigivelseskanal-komplekset (dvs.RyR, junctin og / eller triadin) (ref. 13; til gennemgang, se ref. 9). 3 gange forhøjede niveauer af csk2-protein og celler, hvor organiske buffere blev indlæst i SR (3). Den enkleste forklaring på vores fund er således, at de dominerende virkninger af CSK2 på SR Ca-frigivelse skyldes buffervirkningen af dette protein inde i SR. belysning af den detaljerede mekanisme, hvormed CSK2 og associerede proteiner såsom junctin og triadin regulerer Ca-frigivelse, skal afvente undersøgelser, der involverer manipulation af niveauer og ekspression af mutante former for disse proteiner med ændrede evner til at interagere indbyrdes og RyR.

den maksimale Ca-frigivelseshastighed fra stimulerede myocytter var ens uanset mængderne af CSK2 udtrykt i SR (Fig. 2B og 3D). Disse resultater understøtter forestillingen om, at CSK2 styrer ophør af frigivelsesprocessen, men disse resultater er ikke , hvad man nødvendigvis ville forudsige baseret på de forventede buffereffekter af dette protein i SR. faktisk forventes den maksimale frigivelseshastighed at være højere i celler med øgede luminale Ca-bufferstyrker forårsaget af nedsat tilbagegang af den frie intra-SR, fordi det forsinkede fald i Ca-gradienten over SR-membranen i disse celler forventes at give større Ca-strømningsintensiteter. Flere mulige årsager forklarer, hvorfor dette ikke blev observeret. En mulighed er, at den oprindelige frie intra-SR kan være lavere i csk2-overudtrykkende end i csk2-underudtrykkende celler. Selvom det frie i et lukket rum, såsom SR, ved steady state ikke bør påvirkes af antallet af Ca-bindingssteder (dette bør kun påvirke kinetikken, hvor steady-state intra-SR opnås), er det muligt, at en ægte steady-state ikke blev opnået i vores eksperimenter (dvs.myocytter, der gennemgår stimulering med lav hastighed). En anden mulighed er, at tilstedeværelsen af forhøjede niveauer af csk2-protein bremser diffusionen af Ca i luminalrummet og derved bremser udvandringen af Ca gennem de åbne kanaler. Det er klart, at der er behov for mere forskning, både eksperimentel og teoretisk, for at løse dette problem.

afslutning af CICR. Hvordan CICR, en proces med en iboende tilbøjelighed til selvregenerering, afsluttes, har været genstand for intens forskning, først ved at bruge målinger af globale Ca-transienter og for nylig ved at undersøge ca-gnister (3, 27-30). En mulighed, der er blevet overvejet, er, at RyR-kanalerne gennemgår Ca-afhængig inaktivering eller tilpasning som et resultat af stigningen af på den cytosoliske side af kanalen (27-29). En anden mulighed er, at faldet i intra-SR giver et aktivt signal til lukning af RYR ‘ er, når de åbnes (3, 30-32). Vi har for nylig fundet direkte eksperimentelle beviser for en rolle af luminale Ca-inducerede ændringer i RyR-aktivitet (dvs.luminal Ca-afhængig deaktivering) ved afslutning af SR Ca-frigivelse ved at klemme niveauerne af intra-SR med Ca-buffere med lav affinitet indlæst i SR cisternae (3). Ved hjælp af disse buffere forlængede vi dramatisk varigheden af aktiv Ca-frigivelse, der ligger til grund for både fokale og globale Ca-transienter i myocytter. I overensstemmelse med disse fund, vores nuværende resultater viser, at forøgelse af niveauerne af den høje kapacitet SR luminal Ca buffer CSK2 forlænger Ca-frigivelsesvarighed, hvorimod reduktion af mængder af denne endogene buffer forkortede frigivelsesvarighed, tilsyneladende ved at bremse eller accelerere luminal Ca-afhængig lukning af RYR, henholdsvis. Sammen giver disse resultater overbevisende bevis for rollen som luminal Ca-afhængig deaktivering af RYR ‘ er i ophør af cicr. Selvom det viser vigtigheden af ændringer i luminal Ca ved afslutning af SR Ca-frigivelse, vores resultater udelukker ikke nødvendigvis muligheden for, at yderligere mekanismer, såsom RyR-inaktivering eller tilpasning på cytosoliske ca-reguleringssteder, også kan påvirke Ca-frigivelsesafslutning.

selvom der findes klare beviser for en rolle for ændringer i luminal Ca i ophør af hjerte gnister (ref. 3; nuværende undersøgelse) viste tidligere undersøgelser, at ca-gnister i skeletmuskulatur muligvis ikke ledsages af væsentlig udtømning af SR . Lacampagne et al. (33) brugt kinetisk analyse af Ca-gnistoptagelser med høj tidsmæssig opløsning for at antyde, at Ca-frigørelsesstrømmen, der ligger til grund for Ca-gnisten, er konstant i amfibiske muskelfibre. Fordi SR Ca-strømmen skal falde, når SR falder, dette resultat kan betyde, at luminale Ca-niveauer forbliver stabile under Ca-gnisterne. Således eksisterer muligheden for, at de grundlæggende mekanismer, der er ansvarlige for gnistafslutning, er forskellige i hjerte-og skeletmuskulatur. Udførelsen af komplementære undersøgelser i disse to celletyper (dvs.modulering af CSK-proteinniveauer i skeletmuskelfibre og hurtige Ca-gnistkinetikmålinger i hjertemyocytter) bør bidrage til at afklare dette problem.

relevans for CPVT. Et af de vigtigste aspekter af vores resultater er, at de viser, hvordan reducerede CSK2-niveauer kan forårsage hjertearytmier på celleniveau. CPVT er en arytmogen sygdom karakteriseret ved synkope og pludselig død inducerbar ved motion og catecholamin infusion (34). Indtil videre har fire mutationer været knyttet til CPVT. Tre af disse mutationer ser ud til at resultere i reduceret csk2-ekspression (17), og en mutation er blevet foreslået at føre til forstyrret binding af Ca (16). Vores resultater antyder, at den underliggende årsag til CPVT kan være relateret til unormal restitution af Ca-frigivelsesmekanismen forårsaget af reducerede csk2-niveauer (Fig. 5). På grund af den lavere koncentration af Ca-bindingssteder i SR af celler, der underudtrykker CSK2, sker genopfyldning af Ca-lageret med SERCA-pumpen hurtigere end i normale celler. Store genopladning bliver endnu hurtigere, når aktiviteten af SERCA stimuleres af proteinkinase A, der potentielt tegner sig for afhængigheden af kliniske episoder af CPVT på catecholaminer. I myocytter med reducerede CSK2-niveauer førte for tidlig genopretning af Ca-frigivelseskanaler fra en luminal Ca-afhængig ildfast tilstand til spontane, ekstrasystoliske udledninger af SR Ca-butikker. Det er kendt, at spontan Ca-frigivelse kan inducere indadgående strømme og svingninger i membranpotentialet, hvilket resulterer i udløst arytmi (4-7). Derfor kunne de observerede forstyrrelser i Ca-håndtering i det mindste delvist forklare patogenesen af CPVT forbundet med genetiske defekter, der resulterer i enten reduceret Ca-bindingsaktivitet (16) eller reducerede ekspressionsniveauer af CSK2 (17).

sammenligning med tidligere undersøgelser i transgene mus. Vores resultater adskiller sig fra tidligere resultater opnået i transgene mus, der overudtrykker CSK2 (14, 15). I disse undersøgelser øgede en 10 til 20 gange overekspression af CSK2 SR Ca – lagerkapacitet for isolerede hjertemyocytter; luminal Ca var imidlertid ikke tilgængelig til frigivelse, hvilket førte til deprimerede globale og lokale Ca-frigivelsessignaler. Disse ændringer i Ca-håndtering blev ledsaget af flere strukturelle, funktionelle og biokemiske ændringer på det cellulære og subcellulære niveau og udvikling af hjertehypertrofi og svigt. På den anden side opretholder denne undersøgelse csk2-proteinniveauer tættere på fysiologiske niveauer under akutte snarere end kroniske tilstande; disse data vil således sandsynligvis mere nøjagtigt afspejle de direkte fysiologiske konsekvenser af ændringer i csk2-proteinniveauer på intracellulær Ca-håndtering. Disse resultater fremhæver de potentielle problemer med at fortolke virkningerne af konstitutiv ekspression af proteiner på højt niveau i transgene dyremodeller og værdien af komplementære undersøgelser i mere akutte omgivelser.

konklusion. Afslutningsvis har vi fundet, at CSK2 er en væsentlig determinant for SR ‘ s evne til at opbevare og frigive Ca i hjertemuskel. CSK2 ser ud til at fungere som et reservoir for Ca, der er let tilgængeligt for CICR, og også som en aktiv Ca-buffer, der modulerer lokal luminal Ca-afhængig lukning af RYR ‘ er. Samtidig stabiliserer CSK2 cicr-mekanismen ved at bremse den funktionelle genopladning af SR Ca-butikker. Unormal repriming opførsel af ca-frigivelseskanaler kunne redegøre for eller bidrage til ventrikulære arytmier forbundet med mutationer i csk2-genet.