abstrakt
der er udviklet en direkte og meget specifik kemiluminescerende immunosorbentassay (CL-ELISA) metode til overvågning af chloramphenicol (CAP) i kosmetik. Anti-chloramphenicol antistof (mAb) vedtaget i dette arbejde til direkte immunoassay kunne binde til CAP specifikt med ubetydelig krydsreaktivitet (CR) (mindre end 0,01%) med de fleste CAP-analoger, herunder strukturelt relateret thiamphenicol (TAP) og florfenicol (FF). Detektionsgrænsen (LOD) målt ved IC10 var 0,0021 ng mL−1. Detekteringsområdet (IC20-IC80) varierede fra 0,00979 til 0,12026 ng mL−1. I spikede kosmetikprøver varierede den gennemsnitlige genfinding fra 82,7% til 99,6% med intradag-og interdagsvariation mindre end henholdsvis 9,8 og 8,2%. Desuden kunne metoden ved hjælp af HRP-mærket anti-CAP mAb behandles i hurtig direkte immunoreaktionstilstand. Denne Cl-ELISA-metode kunne anvendes til specifik, hurtig, semikvantitativ og kvantitativ påvisning af CAP i kosmetik, hvilket letter den nøjagtige kvalitetskontrol af CAP-kontaminering.
1. Introduktion
Chloramphenicol (CAP) er medlem af amphenicol familie af antibakterielle midler, og de blev produceret af streptokokker (struktur vist i Figur 1) . Chloramphenicol udføres normalt som et bredspektret antibiotikum med effektiv antimikrobiel aktivitet. Det kan normalt være imod en spredt række Gram-positive og Gram-negative bakterier, herunder de anaerobe organismer . På grund af den høje aktivitet anvendes chloramphenicol i vid udstrækning i husdyr -, akvakultur-og kosmetikindustrien til forebyggelse og behandling af bakteriel infektion. I nylige publikationer blev chloramphenicol rapporteret at blive brugt til behandling af epifolliculitis, acne og anden hudtilstand. Chloramphenicol blev også bredt vedtaget i kosmetik som et antiseptisk middel til at hæmme væksten af mikroorganismer .
kemiske strukturer af CAP, TAP og FF.
nylige undersøgelser viste imidlertid, at amphenicol-antibiotika udviste potentielle bivirkninger for menneskers sundhed . Derfor er anvendelsen af chloramphenicol forbudt i mange lande, herunder EU-medlemmer, USA og Kina . Selvom der er officielle regler for disse antibiotika, tilsættes chloramphenicol stadig ulovligt til kosmetik på grund af dets lave omkostninger og fremragende antibakterielle virkning. For at sikre sikkerheden af kosmetik og holde den menneskelige sundhed, er det emergent at udvikle følsomme, pålidelige og tilgængelige metoder til chloramphenicol påvisning på sporing niveauer i kosmetik prøver.
der blev rapporteret adskillige analysemetoder til CAP og relateret antibiotikadetektion, såsom højtydende væskekromatografi (HPLC) , gaskromatografi (GC) og væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) . Imidlertid kræver disse metoder hovedsageligt dyre instrumenter, komplicerede forbehandlingsprocedurer og veluddannede medarbejdere, og de var ikke egnede til hurtig screening af et stort antal prøver. Immunoassays hovedsageligt baseret på antistof-antigen-specifik genkendelse blev vedtaget til høj kapacitet og hurtig screening af målanalytter. Chemiluminescerende substrat med høj følsomhed kunne anvendes i en direkte chemiluminescerende immunosorbent assay (CL-ELISA) platform. Sammenlignet med konventionelle kolorimetriske protokoller kunne følsomheden af immunoassays forbedres med mindst 2~3 gange med kemiluminescerende som substrat.
tidligere litteraturer om immunoassay detektion af CAP kan ikke skelne CAP fra dets analoger af amphenicol-familien (Figur 1), herunder thiamphenicol (TAP) og florfenicol (FF) på grund af de høje brede specifikke antistoffer . I disse undersøgelser er det vanskeligt at afgøre, om forureningsdækslet, dets analoger eller summen af dem, når et positivt resultat. I denne forskning anvendte vi et højspecifikt monoklonalt antistof (mAb), som kan binde til CAP-specificitet og ubetydelige CR-værdier for de fleste testede analoger. På baggrund af denne meget mAb blev der udviklet en meget specifik og direkte Cl-ELISA-metode til bestemmelse af spormængder af CAP i kosmetik. Denne udviklede protokol behøver ikke kompleks indirekte konjugationsreaktion med HRP-mærket sekundært antistof. Med kemiluminescerende substrat kunne følsomheden forbedres signifikant (skematisk diagram vist i figur 2). Ved anvendelse af HRP-mærket anti-CAP mAb blev analysen udført i hurtig direkte immunoreaktionstilstand uden komplekse immunoreaktionsprocedurer. Denne Cl-ELISA-metode kan anvendes til specifik, hurtig, semikvantitativ og kvantitativ påvisning af CAP i kosmetik, og dette arbejde vil bidrage til kvalitetskontrol og regulering af CAP.
skematisk af CL-ELISA-metoden.
2. Materialer og metoder
2.1. Kemikalier og reagenser
chloramphenicol (CAP), ciprofloksacin (CIP), florfenicol, (FF), penicillin (PEN), ractopamin (RAC), salbutamol (SAL), sulfadiamin (SUL) og thiamphenicol (TAP) standarder blev købt fra Sigma Aldrich (99% renhed, St. Louis, MO, USA). CAP-konjugeret antigen og HRP-mærket CAP-antistof blev opnået fra Co. (Beijing, Kina). SuperSignal chemiluminescence substratopløsning blev købt fra Thermo Fisher (USA). Milli-K syntese system blev opnået fra Millipore (Bedford, MA, USA) til vandrensning. Andre reagenser (analytisk kvalitet) blev købt fra Beijing Reagent Corp. (Beijing, Kina).
2, 2. Udstyr og instrumentering
Costar hvid uigennemsigtig 96-brønd polystyren microtiter plader (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) blev brugt i dette arbejde. M5 mikropladelæser blev opnået fra molekylære enheder (CA, USA). MIKRO 22R centrifuge blev opnået fra Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Tyskland).
2, 3. Buffere og opløsninger
til dette udviklede Cl-ELISA-assay blev forskellige buffere og opløsninger forberedt til immunoassay.
phosphatbuffer saltvand (PBS, 0,01 M, pH 7,4): 8,0 g NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4 og 0,2 g KCl blev opløst i 1 L deioniseret vand.
blokerende buffer (pH 7,4): 0,5% kasein i 0,01 M PBS.
Coatingbuffer (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3 og 2,93 g NaHCO3 blev opløst i 1 L deioniseret vand.fortyndingsbuffer (pH 7,4): 5% føtalt bovint serum i 0,01 M PBS.
vaskebuffer (PBST): 0,01% mellem-20 i 0,01 M PBS.
2, 4. Konkurrencedygtig kemiluminescerende ELISA (CL-ELISA) procedure
Costar hvid uigennemsigtig 96-brønd polystyren mikrotiterplader blev vedtaget til immunoassayreaktion. 100 liter CAP-konjugeret antigen blev opløst i coatingbuffer ved en slutkoncentration ved 0,00042 ng mL−1, som blev tilsat og inkuberet ved 4 liter C i 20 timer til coating. Efter vask med vaskebuffer i tre gange blev blokeringsbuffer (150 liter pr. brønd) tilsat til hver brønd og inkuberet for at optage overskydende aktive steder ved 37 liter C i 1,5 timer.de overtrukne plader blev opbevaret ved 4 liter C før brug.
til CAP-analyse blev de belagte mikrotiterplader forkonditioneret ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter blev 30 liter behandlede prøver eller CAP-standard og 70 liter HRP-mærket anti−CAP-antistof (2,46 ng mL-1) fortyndet med fortyndingsbuffer tilsat til hver brønd efter tur. Pladerne blev inkuberet ved 37 liter C til 30 min til direkte konkurrencereaktion. Efter vask af pladen med vaskebuffer i fem gange blev SuperSignal chemiluminescenssubstrat-opløsning (100 liter/brønd) tilsat, og kemiluminescensintensiteten af hver brønd blev målt med en Spektramaks M5 mikropladelæser.
2, 5. Standardkurve
ti forskellige koncentrationsniveauer blev testet til evaluering af kalibreringskurver. Den højeste koncentration var ved 1000 ng mL-1, og de følgende koncentrationer blev serielt fortyndet med en tredjedel af den foregående. Hver koncentration blev kørt i tre gange i henhold til CL-ELISA-protokollen.
B / B0 er defineret for kemiluminescensforholdet mellem resultaterne. Her, B står for kemiluminescensintensiteten af forskellig CAP-standardkoncentration, og B0 står for kemiluminescensintensitet uden CAP-standard i hver test.
Standardkurver blev evalueret ved at plotte B/B0 ved forskellig CAP-standardkoncentration og tilpasse dataene til følgende fire-parameter logistisk ligning ved hjælp af Origin (version 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA):i denne ligning står A for den øvre asymptot (kemiluminescensforhold B/B0 uden CAP-standard). B er kurvens hældning ved bøjningspunktet. C, der repræsenterer 50% af den maksimale absorbans, er K-værdien ved bøjningspunktet. Og D er den lavere asymptote (baggrundssignal).
2, 6. Prøveforberedelse til Cl-ELISA-analyse
Kosmetikprøver (2,00 g liter 0,02 g) blev vejet nøjagtigt og overført til 50 mL polypropylencentrifugerør. Derefter blev 20 mL PBS tilsat og hvirvlet i 30 s og derefter ultra-sonikering i 3 minutter til ekstraktion af hætten. Hver prøve blev centrifugeret ved 12000 g i 10 minutter ved 4 kg C, og supernatanten blev opsamlet og filtreret gennem en 0,22 liter membran. Tredive mikroliter alikvoter af supernatanten af hver prøve blev tilsat til en belagt 96-brøndsplade til analyse i henhold til den udviklede Cl-ELISA-procedure.
2, 7. Nøjagtighed og præcision
negative primer lotion kosmetikprøver blev tidligere bekræftet af UPLC-MS/MS analyser. Derefter blev hver prøve spiked med CAP standard ved tre forskellige koncentrationer på 5, 20 og 100 ng L−1. Analysen blev behandlet i henhold til den udviklede Cl-ELISA-protokol med fem replikater hver (n = 5). Koncentrationerne af prøver blev beregnet i henhold til kalibreringskurven, og nøjagtigheden og præcisionen blev evalueret på grundlag af inddrivelser af alle prøverne.
3. Resultater og diskussion
3.1. Analysespecificitet
metodens specificitet blev vurderet ved at evaluere omfanget af krydsreaktivitet (CR) med strukturelt beslægtede forbindelser af CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL og TAP. CR-værdierne blev evalueret med følgende ligning:I denne ligning er IC50 den halve maksimale hæmmende koncentration af et stof. Specificitetsresultaterne af anti-CAP mAb blev vist i tabel 1. Fra resultaterne blev der opnået ubetydelige CR-værdier (mindre end 0,01%) for alle de analoger, der blev undersøgt i denne forskning, herunder den mest strukturrelaterede TAP og FF. Det kan konkluderes, at denne udviklede Cl-ELISA-analyse kunne anvendes til specifik CAP-detektion.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Optimering af Cl-ELISA-proceduren
forholdet mellem antigen og antistof i et konkurrencedygtigt reaktionssystem påvirker immunoreaktionen væsentligt. I denne Cl-ELISA-protokol blev forholdet mellem antigen og antistof evalueret og optimeret. Antigen til antistofforhold af 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30: 70 blev undersøgt. Resultaterne blev optimeret i henhold til IC50 og Rlumaks (maksimale relative lysenheder) og vist i tabel 2. IC50-værdien steg signifikant med stigende antistofforhold. Når forholdet mellem antigen og antistof var 70:30, blev det mest følsomme resultat med den laveste IC50-værdi opnået. Derudover førte en høj andel af antistof til en høj rlumaksværdi. For de testede antigen-antistofforhold var alle RLU-værdier imidlertid egnede til påvisning af CAP. På grund af den høje følsomhed af kemiluminescerende substrat var der ingen tilsyneladende forskel på Rlumaks værdi. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.
|
|||||||||||||||||||||||||||
3.3. Følsomhed
IC50, LOD (målt ved IC10) og detekteringsområdet (IC20−IC80) blev opnået fra sigmoidal kalibreringskurve for at evaluere følsomheden af den foreslåede Cl-ELISA-protokol (figur 3). I denne undersøgelse var LOD 0,0021 ng mL−1, mens IC50-værdien var 0,016 ng mL-1 for CAP. Detekteringsområdet for denne metode var 0,00979 – 0,12026 ng mL−1. Sammenlignet med etablerede immunoassays udviste denne metode højere følsomhed og lavere LOD for CAP .
standardkurve for CAP genereret fra CL-ELISA under de optimerede forhold.
3.4. Nøjagtighed og præcision
for nøjagtighed og præcisionsundersøgelse blev inddrivelser af CAP i befæstede prøver først beregnet. Og nøjagtigheden og præcisionen blev evalueret med fem replikater hver på tre valideringsdage. På tre befæstede niveauer på 5, 20 og 100 ng L−1 varierede gennemsnitlige inddrivelser for CAP i spiked primer lotion kosmetikprøver fra 82,7% til 99,6%. Intradag-og interdagsvariationen var henholdsvis mindre end 9,8% og 8,2% (resultaterne blev vist i tabel 3).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Konklusioner
i denne forskning blev der udviklet en ny og meget følsom Cl-ELISA-metode til påvisning af CAP i kosmetik. MAb anvendt i analysen udviste høj specificitet til CAP med ubetydelige CR-værdier til dets analoger, især for de fleste strukturrelaterede TAP og FF. På grundlag af denne meget mAb kunne den foreslåede Cl-ELISA-metode anvendes til påvisning af CAP specifikt i stedet for blandinger af CAP og andre analoger. Dette er den første rapport fra en CL-ELISA til bestemmelse af CAP i kosmetik. Metoden LOD var 0,0021 ng mL-1, IC50 var 0,016 ng mL−1, og detekteringsområdet var 0,00979−0,12026 ng mL−1. I spikede kosmetikprøver varierede den gennemsnitlige genfinding fra 82,7% til 99,6%, hvor intradag-og interdagsvariationen var mindre end henholdsvis 9,8% og 8,2%. Analysen giver fordelene ved høj specificitet, enkelhed, hurtige analysetider og omkostningseffektivitet. Med hensyn til dens følsomhed og specificitet er den udviklede Cl-ELISA-metode bedre end de fleste rapporterede immunoassays til CAP-detektion. Det kan konkluderes, at denne udviklede Cl-ELISA-metode kunne anvendes til specifik, hurtig, semikvantitativ og kvantitativ påvisning af CAP i kosmetik.
datatilgængelighed
de data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter anmodning.
interessekonflikter
forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter vedrørende offentliggørelsen af dette papir.
anerkendelser
vi vil gerne takke LetPub (www.letpub.com) for at yde sproglig bistand under udarbejdelsen af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Kinas nationale r&D-Nøgleprogram (nr. 2017yfe0110800), Kinas nationale naturvidenskabelige fond (nr. 31871718) og EU ‘ s Horisont 2020-forsknings-og Innovationsaktion (nr. 727864-EU-Kina-Safe).
