resultater og diskussion

HANCs stammer fra Hovedepidermien og kræver lb-genfunktion. Tidligere undersøgelser (5, 11, 17, 19) har beskrevet rollen af lb-gener i cellens skæbnespecifikationsprocesser. I Drosophila, gevinst og tab af funktionseksperimenter har afsløret, at lb-gener specificerer identiteten af en delmængde af hjerte-og muskelceller, og at denne funktion er resultatet af den meget begrænsede, afstamningsspecifik mesodermal ekspression af lb. Derudover præcis analyse af lbe (Fig. 1) og LBL (data ikke vist) ekspressionsmønster ved begyndelsen af hjertefusion afslørede en trekantet klynge af lb-positive celler beliggende lige foran spidsen af hjertet (Fig. 1 a, pilespids). For at producere en mere præcis beskrivelse af placeringen af disse celler med respekt for de hjerteassocierede lymfekirtler og ringkirtler, dobbeltmærkede vi embryoner til lb og specifikke kirtelmarkører (Fig. 1 B og C). Lymfekirtelforløberne afsløret med anti-slange antistof flankerer hver side af hjertespidsen (Fig. 1B) men overlap ikke med det område, der er mærket af lb. Tilsvarende viser den dobbelte farvning af L(2)1857 forstærkerfældelinie, som specifikt udtrykker Lacs i ringkirtlens embryonale primordier (15), at lb-positive celler er placeret umiddelbart foran ringkirtlen (Fig. 1C).

for at bestemme oprindelsen af hjerteassocierede lb-positive celler fulgte vi lb-ekspressionen i den forreste del af embryonerne fra det tidlige stadium og fremefter. På de embryonale stadier, der går forud for hjertefusion, var vi ude af stand til at opdage lb-udtryk forbundet med den forreste del af to hjerteprimordier. Dette fund antydede, at de lb-positive celler ikke oprindeligt er specificeret i hjerteområdet og kan repræsentere celler af forskellig oprindelse, der bliver forbundet med hjertecellerne i senere stadier. Faktisk, i slutningen af fase 11, en gruppe af lb-positive celler i dorsalhovedepidermis (Fig. 2A) kan detekteres. Disse celler begynder at invaginere lidt senere og danner den førende del af foldet epidermis (Fig. 2B). Placeringen og tidspunktet for denne invagination ligner en foldning af hovedepidermier, hvilket giver anledning til den bageste del af rygposen kaldet frontalsækken (20). For at kontrollere, om LB-ekspressive celler svarer til spidsen af frontal sac, brugte vi escargot-Lacs linje N516, der udtrykker lacs i dorsal posedannende celler (20). Dobbelt farvning af trin 14 (Fig. 2b) og trin 16 (Fig. 2C) n516-embryoner, der bruger anti-Lbe-og anti-Larus-galactosidase-antistoffer, viser tydeligt, at lb og esg er coudtrykt i spidsen af invaginerende frontal sac. Et dorsalbillede af det embryonale hovedområde (Fig. 2D) bekræfter, at disse celler viser det samme trekantede arrangement som de hjerteassocierede lb-positive celler vist tidligere (sammenlign Fig. 2D og 1).

samlet set indikerer disse data, at de lb-ekspressive celler, der ligger umiddelbart foran hjertet, stammer fra hovedets epidermis og migrerer mod hjertespidsen under frontal Sac invagination. Denne observation rejser et yderligere spørgsmål vedrørende LB-genernes rolle i specifikationen af denne gruppe af celler. Vi har tidligere vist, at lb-gener spiller en vigtig rolle i specifikationen af en delmængde af hjerte-og muskulære forstadier (11, 19). Funktionel analyse af musens lb ortholog lbks1-gen (21, 22) har også afsløret dets implikation i kontrollen af specifikation og rettet migration af appendikulære muskelprecursorer. Desuden indikerer de seneste data, at lbh1 hos mus specificerer en subpopulation af hjerte neurale crestceller, der er nødvendige for normal hjerteudvikling (23).

for at teste, om Drosophila lb er påkrævet til specifikation af hjerteassocierede celler, har vi analyseret dannelse af rygposer i embryoner mangelfuld for begge lb-gener (se materialer og metoder). Ved hjælp af esg RNA-sonden som markør demonstrerede vi, at i lbdef-embryoner er esg-ekspressionen i den distale del af frontalsækken, der bærer de hjerteassocierede celler, fraværende (sammenlign Fig. 2 E og G med F og H). Derudover, som det fremgår af de dorsolaterale visninger af fase 14-embryoner (Fig. 2 G og H), er afstanden mellem blommesækken og de mest distale esg-positive celler signifikant forstørret i LB-mangelfulde embryoner. Dette fund, understøttet af Nomarski optics observation, der afslører, at den bageste del af frontalsækken har ændret morfologi (data ikke vist), indikerede, at Hanc ‘ erne ikke er specificeret eller ikke migrerer korrekt i lbdef-embryoner. Fordi den analyserede mangel også dækker tilstødende bap-og C15-gener, testede vi frontal sac-dannelse i bap-mutante embryoner og Arm-GAL4>UAS-RNAiC15-embryoner. I både bap208-og RNAiC15-embryoner var den esg-farvede frontalsæk af normal form (data ikke vist), hvilket udelukkede indflydelsen af bap-og C15-gener på differentiering eller migration af hjerteassocierede celler. Disse data antyder kraftigt, at det unormale mønster af distale esg-positive frontale sac-celler i lbdef-embryoner skyldes tabet af lb-funktion.

mesodermale og Nonmesodermale komponenter involveret i mønsteret af Hjerteudstrømningsområdet. Vores immunfarvende eksperimenter viste, at de hjerteforankrende lb-positive celler ligger meget tæt på de lb-udtrykte kardioblaster (Fig. 1). Fordi de mest forreste cardioblaster udtrykker tin (5), dobbeltmærkede vi embryoner med anti-Tin og anti-LBE antistoffer for at visualisere de respektive positioner af hjertespidsen og den mest distale del af frontalsækken. Overraskende overlapper disse to strukturer med ca.tre cellelængder, når de observeres fra rygsiden (Fig. 3A). Desuden er det laterale konfokale billede af det forreste hjerteområde (Fig. 3B) viser tydeligt, at spidsen af frontalsækken, der består af ikke-mesodermale lb-ekspressive celler, er direkte fastgjort til hjertet. Mere præcist observerede vi, at den forreste del af aorta (delvis overlapper de hjerteassocierede lb-celler) bøjer ventralt og danner et morfologisk særskilt område svarende til hjerteudstrømningsområdet. Denne morfologi antyder, at der kan være en yderligere cellulær komponent, der favoriserer ventral bøjning af hjertet. Vi besluttede at kigge efter tilstedeværelsen af en ventralt placeret muskel fastgjort til spidsen af aorta. Det laterale billede af embryoet, dobbeltfarvet for myosin tung kæde (Myo) og Lbe (Fig. 3C), viser tydeligt, at hjerteudstrømningen faktisk er knyttet til en hovedmuskel, som vi foreslår at kalde COM. Mere præcis analyse af de konfokale sektioner afslørede, at hjertets primordium faktisk er forbundet med to tæt liggende Com ‘ er, der strækker sig fra spiserøret og fastgøres til hver side af hjerteudstrømningsområdet (åbne pilespidser i Fig. 3D). Overraskende nok er disse embryonale hovedmuskler ikke blevet beskrevet tidligere til vores viden. Manglen på offentliggjort dokumentation for COMs skyldes sandsynligvis, at morfologien og oprindelsen af somatiske hovedmuskler i Drosophila-embryoet ikke er systematisk analyseret. Ved hjælp af den eneste tilgængelige beskrivelse af voksenhovedmuskulatur udført af Miller (24) kunne vi ikke identificere voksne hovedmuskler, der kunne svare til de embryonale Com ‘ er, der præsenteres her.

interessant nok afslørede Myo / Lbe dobbeltfarvning også, at de ikke-mesodermale HANCs er bundet til begge hjerteceller (Fig. 3E) og COMs (Fig. 3D). Fordi HANCs udtrykker lb og forbinder selektivt med det mest forreste lb-positive par hjerteceller (Fig. 3e og 4 D–F), spekulerer vi i, at etablering af denne kontakt kan involvere homofile celleinteraktioner. Test af celleadhæsionsmolekyler involveret i intercellulær signalering mellem homotypiske celler (25, 26) vil hjælpe med at definere mekanismer, der ligger til grund for etablering af forbindelse mellem lb-ekspressive HANCs og hjerteceller.

for at visualisere det rumlige arrangement af spidsen af aorta, COMs og lb-ekspressive HANCs brugte vi computerassisteret 3D-analyse og rekonstruktion af konfokale scanninger. Denne tilgang bekræftede fuldt ud vores observationer, der afslørede, at ud over HANCs er hjerteudstrømningsområdet tæt knyttet til et par COMs (Fig. 3F). Disse muskler overlapper spidsen af hjertet fra begge sider og bidrager til dens ventrale bøjning.

for at forstå, hvordan kontakten mellem hjerte, COMs og HANCs er etableret under udvikling, overvågede vi disse strukturer i tidlige og sene fase 14 embryoner (Fig. 3 G og H). Vores data indikerer, at både de lb-positive hjerteceller og lb-ekspressive Hanc ‘er tiltrækker forlængende Com’ er.

kontakten mellem COMs og HANCs ser ud til at gå lidt forud for COMS fastgørelse til spidsen af aorta og ses i begyndelsen af trin 14 (Fig. 3G). På det tidspunkt strækker COM ‘ s fillopodia sig i retning af lb-positive hjerteceller (Fig. 3G) og bliver definitivt bundet til disse celler i det sene trin 14 ved begyndelsen af hjertefusion (Fig. 3H). Fordi com ‘erne kommer i kontakt med hjerteceller og Hanc’ er, før Hanc ‘erne bliver knyttet til hjertet, spekulerer vi i, at Com’ er ud over at bøje spidsen af hjertet letter dets kontakt med hanc ‘ er. Etableringen af kontakt mellem somatiske muskler og deres epidermale fastgørelsessteder (seneceller) er blevet grundigt undersøgt (27), hvilket afslører nøglerollen for fingertranskriptionsfaktorstriben (28) og et RNA-bindende protein hvordan (29). Vi har brugt begge disse markører til at teste, om HANCs og hjerteceller, som COMs vedhæfter displayegenskaber for senelignende celler. Dobbelt mærkning udført på VT-embryoner med anti-Lbe/anti-Stripe og på hvordan-Lacs-embryoner med anti-Lbe / anti-Lacs-antistoffer afslørede, at HANCs og de com-kontaktende hjerteceller ikke udtrykker senecellemarkører (data ikke vist). Dette fund indikerer, at lb-positive celler tiltrækker Com ‘ er ved hjælp af en anden mekanisme end den, der anvendes af seneceller. De mest interessante kandidater til styring af COMs er den udskillede proteinspalte, der besidder de multiple proteinbindende motiver og dets receptorer Robo og Robo2 (30). Slit og Robo opstod for nylig som pivotale komponenter, der kontrollerer tiltrækning og frastødningsprocesser under morfogenese af somatiske muskler (31), hvilket antyder, at de også kan være impliceret i com-tiltrækning.

de mest forreste lb-ekspressive hjerteceller spiller en Central rolle i mønsteret af Hjerteudstrømningsområdet. Observationen om, at både COMs og HANCs valgte at knytte sig til de mest forreste lb-positive hjerteceller, fik os til at teste, om dereguleringen af lb-ekspression i hjertet kan påvirke mønsteret i hjerteudstrømningsområdet. For at udføre denne test brugte vi det Gal4 / UAS-målrettede ekspressionssystem (16). To forskellige gal4 effektor linjer, 24B-GAL4 og Tin-GAL4, blev anvendt (Fig. 4 A og C). 24B-GAL4-linjen tillader målrettet ekspression i alle hjerte-og muskelceller (Fig. 4A) med et ensartet og højt ekspressionsniveau i de mest forreste hjerteceller (pil i Fig. 4A). Tin-GAL4-linjen (venligt leveret af R. Bodmer) inducerer UAS transgenekspression selektivt i fire cardioblaster i hver hemisegment (disse inkluderer de lb-positive celler), men induktionsniveauet i de mest forreste hjerteceller er lavere (pil i Fig. 4C) end 24B-GAL4 linje. For at udvide hjerte-lb-ekspression er begge GAL4-effektorlinjer blevet krydset med UAS-lbe-linjen. Den ektopiske lb-hjerteudtryk drevet af Tin-GAL4-linjen var svagere end den endogene lb-ekspression i hjertet, og der er ikke observeret nogen åbenlyse gain-of-function-inducerede ændringer i mønsteret i hjerteudstrømningsområdet (data ikke vist). I modsætning hertil viste 24B-GAL4>UAS-LBE-embryoner markant udvidelse af lb-ekspression i hjertet (Fig. 4G), hvilket fører til unormal kontakt af COMs med spidsen af hjertet. Mest præcist fandt vi, at Com ‘ er fastgøres direkte til de mest forreste hjerteceller, der danner hjerteudstrømningen (asterisk i Fig. 4G) og ikke til det andet par hjerteceller som i vægt (Fig. 4D). Den ændrede forbindelse af COMs skyldes sandsynligvis de ektopiske attraktive signaler genereret af det forstørrede hjerteudtryk af lb. Som følge heraf var den ventrale bøjning af den forreste del af hjertet mere udtalt (sammenlign Fig. 4 D og G). Vi har også bemærket en ændret morfologi af COMs (åben pilespids i Fig. 4 D og G), som kan skyldes den 24B-GAL4-drevne ektopiske muskulære ekspression af lb. Kontakten mellem hancs og hjerteceller blev ikke påvirket af de eksperimentelle misekspressionsbetingelser. For at teste, om hjerte-lb-ekspression er påkrævet for tiltrækning af COM ‘ er, udnyttede vi den tidligere beskrevne negative regulatoriske indflydelse af even-sprunget (eve), der er i stand til specifikt at undertrykke lb i hjerteceller (5). Igen blev 24B-GAL4-og Tin-GAL4-effektorlinjerne brugt til at drive eve-udtryk i hjertet. Vi fandt ud af, at begge disse chauffører krydsede UAS-eve-linjen (Tin-GAL4 med lavere penetrans) fører til undertrykkelse af lb-aktivitet i hjertet (Fig. 4 H og I). På trods af fejlspecifikationsdefekter dannes hjerteprimordier normalt i UAS-eve-forstærkning af funktionsembryoner (ref. 5 og Fig. 4B), der giver os mulighed for at overvåge COMs og HANCs i en sammenhæng, hvor hjerteudtryk af lb er udtømt. Vores data viser, at i sådanne lb-udtømte embryoner (se fraværet af hjerte-lb-ekspression i Fig. 4 H og I) COMs fastgøres ikke til spidsen af hjertet. Vi observerede, at COMs udvidet anteriorly og knyttet til invaginerende HANCs (Fig. 4 H og I), som ikke længere er i stand til at forankre spidsen af hjertet korrekt. Den vigtigste com-gren, der normalt fastgøres til hjerteudstrømningsområdet (sammenlign Fig. 4 E og F med H og I) var fraværende eller fusioneret med hanc-fastgørende gren. Således mener vi, at den unormale form af COM og et fuldstændigt tab af dets kontakt med spidsen af hjertet er forårsaget af hjerte-lb-udtømning. Denne antagelse understøttes af det faktum, at de samme fænotyper blev observeret i embryoner med ektopisk hjerte (Tin-GAL4-drevet) og hjerte plus muskuløs (24B-GAL4-drevet) ekspression af eve (sammenlign Fig. 4 H og I). Den ændrede Kontakt og placering af COM ‘ er optrådte i sent stadium 14 embryoner, når myosin tung kæde endnu ikke kan påvises i cardioblaster (Fig. 4 E og H). Analysen af fase 15-embryoner afslørede desuden, at tabet af hjerte-lb-ekspression ledsages af nedreguleringen af kurr3-tubulin (sammenlign Fig. 4 F og I) i hjerteudstrømningsområdet, hvilket indikerer, at lb-ekspression i hjertet har en vigtig indflydelse på den endelige hjertemorfogenese. Disse data supplerer nylige rapporter, der beskriver morfogenetiske roller for et COUP-TF-receptor-familiemedlem, Seven-up, udtrykt i det bageste par cardioblaster i hvert segment og kræves til dannelse af ostia i mavesegmenterne A5–A7 (32, 33). I denne sammenhæng stiger demonstrationen af LB ‘ s rolle i mønsteret af hjerteudstrømningsområdet en mulighed for, at lb i mavesegmenter spiller en lignende rolle i etablering af kontakt mellem hjerteceller og hjerteforankrende lønmuskler. Denne hypotese skal stadig undersøges.

desuden er de præsenterede fænotyper (Fig. 4) antyder, at lb-udtrykket eksperimentelt udtømt i hjertet påvirker emission eller modtagelse af attraktive signaler fra hjerteceller og som følge heraf fører til forstyrrelse af kontakten med COMs. Det samme eller lignende muskelattraktant vil sandsynligvis blive produceret eller modtaget af lb-positive HANCs, hvilket antyder, at lb regulerer ekspression af gener involveret i celle–cellekontakt. Interessant nok blev lb-genet i mus lb-homolog fundet nødvendigt for rettet migration af en delmængde af muskelprecursorer (21, 22), hvilket indikerer, at de konserverede cellebevægelsesmekanismer kan eksistere, der styres af lb-gener.

samlet set gennem analyse af embryoner, hvor hjerte-lb-ekspression blev udvidet eller eksperimentelt udtømt, har vi demonstreret, at lb er påkrævet for korrekt fastgørelse af HANCs og COMs og som følge heraf for korrekt mønster af hjerteudstrømningsområdet. Dette fund giver indsigt i funktionel betydning af anterior–posterior diversificering af hjerteprecursorer inden for hvert segment af Drosophila-hjertet.

kan HANCs repræsentere en Drosophila Prototype af neurale crestceller? Hvirveldyr hjerte morfogenese involverer to forskellige celletyper, det mesodermale hjerte primordia og en subpopulation af neurale kamceller, der migrerer fra hovedregionen. I denne artikel har vi vist, at i Drosophila bidrager en gruppe ikke-mesodermale celler, der stammer fra hovedets epidermis (som vi har navngivet HANCs) til den endelige morfogenese af hjertet. Som i hvirveldyrs neurale kamceller gennemgår HANCs rettede bevægelser, kommer i kontakt med hjerteceller og deltager i mønsteret i hjerteudstrømningsområdet. Vi har demonstreret, at homeoboksgenerne lb, der vides at være involveret i diversificering af hjerteprecursorer (5, 11), udtrykkes i HANCs og er nødvendige for deres specifikation. Tilsvarende blev ortholog af lb, lbh1-genet, for nylig fundet at være påkrævet til specifikation af en delmængde af hjerte neurale crestceller i mus (23), hvilket indikerer, at lb/Lbh1-gener spiller en konserveret rolle i specifikationen af ikke-mesodermale komponenter i hjertet. I denne opfattelse kan HANCs faktisk sammenlignes med hvirveldyrs neurale kamceller. Imidlertid indikerer vores data også, at HANCs viser mindst to funktioner, der kun er specifikke for Drosophila: (i) de bevæger sig som en del af foldet hoved ectoderm og ikke som delaminerede neurale kamceller; og (ii) de danner et funktionelt kompleks med COMs, som ikke har nogen homologe strukturer hos hvirveldyr. Dermed, yderligere analyser er nødvendige for at belyse den nøjagtige rolle HANCs og deres potentielle neurale crest cellelignende funktioner.