Laboratorienotater til BIO 1003

30.August 1999, John H. Vahlert & Mary Jean Holland

H4> proteiner, der fungerer som katalysatorer

(klik her for: materialer, temaer, ressourcer)

celler har ikke mulighederne for varme og kraftig omrøring for at fremskynde kemiske reaktioner ved at få atomer og molekyler til at støde ind i hinanden oftere og med mere kraft. I stedet fremstiller de proteinkatalysatorer, der giver overflader, hvorpå reaktanter støder på hinanden i den rigtige retning, og de kan endda svække bindinger, der skal brydes. Kun specifikke reaktanter vil passe på deres overflader og afbalancere de lokale overfladeafgifter på det sted, der kaldes det aktive sted. Et bestemt sæt reaktanter kaldes dets substrat(er). Som alle katalysatorer ændres de ikke af den reaktion, de katalyserer; når alle reaktanterne er blevet omdannet til produkter, forbliver de originale molekyler.funktionen afhænger af det miljø, hvor reaktionen forekommer. Sådanne faktorer som temperatur og pH kan i høj grad påvirke et ferments evne til at udføre sit arbejde. Den følgende serie af eksperimenter illustrerer principperne for katalyserede reaktioner i biologiske systemer. Vi vil bruge katekolasen (eller katekoloksidasen), der er almindelig i planter; det er til stede i den friskpressede kartoffelsaft, der er leveret. Substraterne af catecholase er catechol og ilt. Substraterne reagerer med hinanden inden for det aktive sted. Produkterne dannet ved denne reaktion er benkinon og vand; da benkinon har en brun farve, kan du se, at reaktionen har fundet sted. Dette kaldes frugtbrunningsreaktionen. Bensokinon hæmmer væksten af mikroorganismer og forhindrer beskadiget frugt i at rådne. I ubeskadigede celler opbevares catecholase i vesikler og interagerer ikke med catechol.

i nærvær af katakolase:

catechol + LYSTO2 H2O

i alle nedenstående forsøg blandes ingredienserne som angivet, og blandingen omrøres med en hvirvelgenie eller ved at banke på siden af røret nær bunden; inkuber blandinger ved 40 grader C, medmindre andet er angivet.

Hvis du tvivlede på renheden, hvordan kunne du finde ud af, om der er noget andet i kartoffelekstraktet udover catecholase?

I. dannelse og påvisning af Benkinon

dette eksperiment fastlægger standarderne for udseende, når reaktionen har eller ikke har fundet sted. Brug destilleret vand, hvor H2O er angivet.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (kontrol)

hvordan ville du definere begreberne en kontrol og et eksperiment?

II. specificitet

Hydrokinon er strukturelt ligner, men ikke det samme som catechol. I dette eksperiment vil vi se, om det også kan konvertere det til benkinon, eller om det simpelthen er for specifikt i dets design til at interagere med det lignende, men ikke identiske molekyle.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (kontrol)

kan man konvertere hydrokinon til benkinon? Hvordan kom du til denne konklusion?

bemærk: din gruppe vil gøre enten III eller IV—ikke begge dele.
spørg din laboratorieinstruktør, om din gruppe vil udføre III-temperatur eller IV-pH.

III. effekt af temperatur på f.eks. aktivitet

f. eks. er designet til at fungere inden for et bestemt temperaturområde. Du kan lave nogle gæt om resultatet for følgende temperaturer nedenfor. Husk, at de strukturer, der producerer fermentet, er frugt og kartoffel; på Celsius-temperaturskalaen fryser 0 grader, 22 grader er stuetemperatur og 100 grader koger. Jo varmere det er, jo hurtigere molekyler vibrerer og bevæger sig rundt. Når dette sker, siges molekylet at være denatureret. Hvad ville der ske med det aktive sted i dette tilfælde? Ved lave temperaturer bevæger molekylerne sig meget langsomt, og chancen for at de kolliderer og reagerer med hinanden er meget lav. Bemærk, at kartoffelekstraktet er blevet holdt på is. Hvorfor?

skriv ned din hypotese om effekten af temperatur på aktivitet:

Opsæt 6 par reagensglas med 10 dråber kartoffelekstrakt i et sæt og 10 dråber 1% catechol i den anden. Inkuber dem i 5 minutter, et par i hvert af de 5 temperaturmiljøer, der er angivet nedenfor. Bland derefter kartoffelekstraktet og catechol sammen; optag den oprindelige farve, og sæt røret tilbage i de kontrollerede temperaturmiljøer. Optag farven igen efter 5 minutter.

temperatur	Initial farve	farveændring (5 min. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 grader c
100 grader c

understøtter resultaterne din oprindelige hypotese?

hvilke temperaturer denaturerer det, så det ikke kan komme sig.

Hvad er det hvide bundfald, der dannes ved 100 grader C?pH-skalaen måler antallet af hydrogenioner (hver med en +1 ladning) til stede i opløsning. Skalaen i biologiske systemer løber fra 0 (stærkt surt) til 14 (stærkt basisk). 7, det neutrale punkt, er pH i rent vand. Husk, at den foldede struktur af proteinmolekyler i vid udstrækning skyldes hydrogenbinding mellem modsat ladede dele af polypeptidkæden. Andre ioner i opløsning kunne erstatte de matchende dele af kæden og få den til at blive fortrydt. Når dette sker, hvad bliver der af det aktive sted?

skriv ned din hypotese om effekten af pH-området på ph-aktivitet:

Opsæt 7 reagensglas med 40 dråber af en anden bufret pH-opløsning i hver. Tilsæt 10 dråber kartoffelekstrakt til hver og rør. Tilsæt derefter 10 dråber 1% catechol til hver og rør.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

Ved hvilken pH eller interval af pH-værdier fungerer pH-værdien bedst?

hvorfor sætter citronsaft på frisk skåret frugt sin bruning?

V. nødvendigheden af cofaktorer for aktivitet

mange funktioner virker kun, hvis der er en cofaktor forbundet med dem. Catecholase kræver kobber som en cofaktor. PTU er et kemikalie, der har en højere affinitet for kobber end catecholase, og det tager kobberet væk fra stoffet. Du kan se, hvad der sker med funktionen, når dens cofaktor fjernes. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. efter 5 minutter tilsættes 10 dråber 1% catechol.

hvilket rør, A eller B, er kontrollen i dette eksperiment?