abstrakt
Cervicitis er en almindelig seksuelt overført sygdom. I de senere år resulterer misbrug af antibiotika til behandling af cervicitis i fremkomsten af antibiotikaresistente bakterier; alternative strategier er nødvendige for at blive udviklet. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningerne af Feilin Vaginal Gel (FVG), en kinesisk urteformel, på behandlingen af cervicitis. To cervicitis-modeller blev optimeret ved hjælp af BALB/c-mus; en in vitro-model blev etableret i HeLa-celler. I Chlamydia trachomatis-induceret cervicitis-model kunne det høje niveau af bakteriebelastninger, betændelsen i væv og cytokinerne i serum observeres. Ved indgivelse af FVG kunne bakteriebelastningerne i livmoderhalsslim og livmoderhalsvæv hæmmes signifikant i dosisafhængige manerer. Den patologiske skade på livmoderhalsen og vagina såvel som niveauerne af IL-2, IL-17 og MCP-1 i serum kunne mindskes af FVG. FVG reducerede antallet af inklusion induceret af C. trachomatis i HeLa-celler. Derudover kunne den histologiske skade i Escherichia coli og Staphylococcus aureus-induceret cervicitis-model reduceres med FVG. Disse resultater antyder, at FVG er i stand til at behandle cervicitis gennem hæmning af patogener og regulering af værtsimmunresponser. FVG kan bidrage som et alternativt middel til behandling af cervicitis.
1. Introduktion
Cervicitis er en almindelig seksuelt overført sygdom med en inflammatorisk tilstand i livmoderhalsen . Infektionen i livmoderhalsen starter fra nedre kønsorganer (vagina) og udvikler sig derefter til bækkenbetændelsessygdom med stigende infektion i det øvre kønsorgan (livmoder og æggeleder) og peritoneal hulrum . Cervicitis forekom ofte som en asymptomatisk infektion. Unormal cervikal eller vaginal mucopurulent udledning og cervikal ektopi kan være tegn og symptomer på cervicitis hos nogle patienter . Imidlertid kan alvorlig cervicitis føre til yderligere infertilitet og ektopisk graviditet. Cervicitis anses for at være forbundet med overførsel af HIV-infektion og udvikling af cervicale carcinomer .Cervicitis kan induceres af forskellige patogener, såsom Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas, Herpes virus, cytomegalovirus og adenovirus . C. trachomatis-infektion rapporteres at være den hyppigste årsag til cervicitis. Mere end 10% af kvinder med cervicitis diagnosticeres at være inficeret af C. trachomatis og antallet af disse infektioner fortsætter med at stige i løbet af de sidste årtier . C. trachomatis er Gram-negativ obligatorisk intracellulær bakterie. To former for C. trachomatis kan findes i dens udviklingscyklus. Vedhæftning af elementære legemer (EBs) til værtsceller formidler invasionen af C. trachomatis. Inde i værtscellerne danner C. trachomatis de retikulære legemer (RBs) og derefter replikerer RBs inden i den cytoplasmatiske vakuol og danner til sidst inkluderingen .
Chlamydia kan fortsætte i lang tid i livmoderhalsen uden symptom. Infektionen kan forsvinde spontant uden behandling eller kan forårsage cervicitis. Clearance af C. trachomatis kræver responser af Th1 immunitet . Imidlertid kan svarene på adaptiv immunitet have en dobbeltkantet natur og medføre vævsskade. Håndteringen af C. trachomatis-infektion er baseret på behandlingen af patienterne og deres seksuelle partnere med makrolider. Misbrug af antibiotika og falsk-positiv diagnose kan bidrage til fremkomsten af antibiotikaresistente organismer. De antibiotikaresistente bakterier fører derimod til behandlingssvigt . Efter behandling med antibiotika vil 10% -20% af patienterne lide af reinfektion inden for et år, hvilket kan skyldes fraværet af beskyttende immunitet mod Chlamydia . I betragtning af disse forhold er det nødvendigt at udvikle alternative strategier.
traditionel kinesisk medicin (TCM) har en lang historie i behandling af gynækologiske sygdomme . Feilin Vaginal Gel (FVG) er udviklet ud fra en klinisk anvendt Kinesisk medicinformel, der bruges til behandling af mucopurulent cervicitis. FVG består af følgende plantelægemidler: Det er en af de mest almindelige årsager til denne sygdom. I henhold til teorien om TCM: FVG kan bruges til at behandle ophobning af fugt og giftige materialer induceret unormal vaginal udflod, såsom rigelig, fedtet og gullig leukorrhea, kløe og smerter omkring de ydre kønsorganer . Ekstraktion, forberedelse og kvalitetskontrol af FVG var blevet undersøgt. Koncentrationerne af gentiopicrosid og paeoniflorin i FVG blev analyseret til henholdsvis ca .5,90 mg/g og 8,96 mg/g.
i denne undersøgelse testede vi hypotesen om, at FVG kunne behandle cervicitis effektivt. Mus cervicitis modeller blev etableret for at evaluere behandlingen af FVG. I Den C. trachomatis-inficerede musemodel blev bakteriebelastningen, den patologiske skade og niveauerne af MCP-1, IL-2 og IL-17 i serum evalueret. Inklusionerne i HeLa-celler induceret af C. trachomatis blev opregnet in vitro. Desuden blev behandlingen af FVG evalueret gennem den histologiske undersøgelse af livmoderhalsen efter at være inficeret af blandingen af Escherichia coli og Staphylococcus aureus.
2. Materialer og metoder
2.1. Fremstilling af FVG
de seks plantelægemidler blev ekstraheret tre gange med kogende vand og udfældet med alkohol til 70% (v/v) ethanol. Supernatanten blev koncentreret med den roterende fordamper til en relativ densitet på 1,30-1,35 (50 liter C) for at få Feilinekstraktionen (FE, 5,62 g/g). Gelbasen var en blanding af carbopol 941 og hsantan gummi. Ekstraktionen blev blandet med gelbasen for at få FVG. Lægemiddelbelastningen af FVG var 2,5 g/g, 1,25 g/g og 0,625 g/g.
2,2. Bakteriestammer og Væld Celle
Chlamydia trachomatis mus pneumonitis stamme Nigg II (ATCC® VR-123™), Escherichia coli (ATCC® 25922™), og Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™) blev indhentet fra American Type Culture Collection. E. coli og S. aureus blev dyrket i næringsstof bouillon. Human livmoderhalsepitelcellelinie HeLa (ATCC Larsen CCL-2 Larsen) blev købt fra Culture Collection of Chinese Academy of Medical Sciences og dyrket i rpmi 1640 medium indeholdende 10% FBS ved 37 Larsen C i nærværelse af 5% CO2. C. trachomatis N blev formeret i HeLa-celler. Før infektion blev inficerede HeLa-celler (105 celler/mL) afbrudt og centrifugeret. Supernatanten blev opsamlet for at få rensede elementære kroppe (EBs), som kan bruges til at inficere mus og HeLa-celler direkte.
2, 3. Dyreinfektioner og behandling
120 kvindelige BALB/C-mus (18-20 g) blev købt fra Charles River Laboratories China (Beijing, Kina). Dyr blev anbragt i en bsl2 barriere dyr facilitet. Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, var med tilladelse fra Institute of China Academy of Chinese Medical Sciences, Chinese Materia Medica, Ethic Committee. Referencenummeret for etisk godkendelse er 20162019.
livmoderhalsvævet hos BALB / c-mus blev såret med vinklet nål under anæstesi. Mus blev derefter inokuleret med 50 liter C. trachomatis N eller blandingen af E. coli og S. aureus (109 CFU/mL). Musene blev inficeret en gang om dagen og gentaget i tre dage. 24 timer efter den sidste infektion blev FVG givet i musens vagina ved hjælp af pipette (volumenet af FVG blev omhyggeligt kontrolleret) i en dosis på 2, 2 g/kg, 1, 1 g/kg og 0, 55 g/kg i 12 dage. Policresulen suppositorier (PS) blev som en positiv kontrol blandet med gelbase og givet i en dosis på 16,5 mg/kg i 12 dage. Kontrolgruppen og modelgruppen fik et lige stort volumen gelbase. På,, og behandlingsdagen blev det cervikale slim opsamlet med vatpinden. På dag 15 blev mus bedøvet, blodprøver blev taget fra aorta ventralis, og serumet blev adskilt. Mus blev derefter dræbt af cervikal dislokation under anæstesi, og livmoderhalsen og vagina blev fjernet. Skematisk af den eksperimentelle tid blev vist i Figur 1.
2.4. ELISA analyse af C. trachomatis N, IL-2, IL-17 og MCP-1
vatpindene med cervikal slim blev dispergeret med et lige volumen PBS, niveauet af C. trachomatis N i PBS blev analyseret med enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Meilian, Shanghai, Kina) i henhold til fabrikantens anvisninger (tilsæt 50 µL af prøven og 50 µL påvisning af antistof til hver brønd, og der inkuberes ved 37°C i 1 time, vask brøndene, tilsæt 100 µL af HRP-konjugat til hver brønd, og der inkuberes ved 37°C i 0,5 time, vask brøndene, tilsæt 50 µL af kromogent substrat til hver brønd, og inkuberes ved 37°C i 0,5 time, tilsæt 50 µL stopopløsning til hver brønd; læs absorbance værdier for hver brønd på 450 nm). Niveauerne af IL-2, IL-17 og MCP-1in serum blev bestemt af ELISA kit (Meilian, Shanghai, Kina) ifølge producentens anvisninger som beskrevet ovenfor.
2, 5. RT-PCR analyse af C. trachomatis N
Total RNA blev ekstraheret fra livmoderhalsen ved hjælp af Trisol (Invitrogen, Californien, USA); ekspressionen af målgener blev analyseret ved hjælp af et trin SYBR Prime Script RT-PCR Kit II (TaKaRa, Beijing, Kina) med Piko Real 96 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Primerne blev brugt som følger: 16S rRNA fremad primer, 5 ‘- ACC CGT TGG ATT TGA GCG TA-3′; 16S rRNA omvendt primer, 5′ – GTT GAG CCC CGA GAT TTG AC-3′; GAPDH fremad primer, 5′-GCT GAG TAT GTC GTG GAG T-3′; GAPDH omvendt primer, 5′-GTT CAC ACC CAT CAC AAA C-3’. Den relative ekspression af C. trachomatis n gen og musegen blev beregnet efter metoden.
2, 6. Histologisk undersøgelse
musens væv blev fikseret med 10% formaldehyd, derefter indlejret i paraffin og skåret i skiver til hæmatoksylin og eosin farvning. Sektionerne blev visuelt evalueret af Dmlb (Leica Camera AG, Tyskland); to sektioner blev fremstillet ud fra hver prøve. Følgende kriterier blev anvendt til klassificering af de patologiske ændringer.
“-” livmoderhalsen og vagina epitel viser ingen hyperplasi og ingen betændelse og væv er normale.
“+” livmoderhalsen og vagina epitel har mild hyperplasi; bindevæv har mild segmental inflammation.
“++” livmoderhalsen og vagina epitel har hyperplasi; bindevæv blev infiltreret af inflammatoriske celler.
“+++” livmoderhalsen og vagina epitel har signifikant hyperplasi og var infiltration af inflammatoriske celler; bindevæv var omgivet af diffus inflammation og vaskulær overbelastning.
2, 7. Værtscelleinfektion og Inklusionsplette
HeLa-celler blev podet i 6-brøndsplade med en densitet på 2-105-celler/brønd og dyrket i 48 h. derefter blev cellerne inkuberet med C. trachomatis N EBs indeholdt medium. Pladen blev centrifugeret ved 32 liter C i 1 time og kontinuerligt dyrket ved 37 liter C i nærvær af 5% CO2 i 2 timer. mediet af inficerede celler blev erstattet med FE (500, 250 og 125 liter/mL) indeholdt medium og inkuberet i yderligere 48 timer. Derefter blev cellerne vasket med PBS, fikseret med methanol og farvet med Giemsa. Inklusionerne i HeLa-celler blev fanget af IKS71 (Olympus, Tokyo, Japan) og opregnet.
2, 8. Statistisk analyse
statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism v. 6 (GraphPad-program, Californien, USA). Alle data blev normalt fordelt (Kolmogorov-Smirnov test). Inklusionsnummer og histologiske scoringer blev analyseret med Mann-Hvidney u-testen; andre blev analyseret med den uparrede t-test. En værdi af p < 0,05 blev anset for at være signifikant.
3. Resultater
3.1. FVG hæmmer niveauet af C. trachomatis N i cervikal slim
EBs af C. trachomatis spirer og danner RBs efter at have invaderet værtscellerne. RBs begynder at formere sig efter 7-21 dage. Immunoassay er en almindeligt anvendt nonculture metode til at diagnosticere chlamydial infektion . Vi analyserede niveauet af C. trachomatis N i cervikal slim for at evaluere sværhedsgraden af musinfektion.
i det tidlige stadium af C. trachomatis n-infektion blev der ikke observeret nogen signifikant ændring af bakteriebelastningen. 10 dage efter den første infektion, stigningen af C. trachomatis N hos mus kunne testes. På dagen var niveauet af bakteriebelastningen signifikant højere end kontrolgruppen (figur 2(a)). Med den successive behandling af FVG (2,2, 1,1, 0,55 g/kg) kunne niveauet af C. trachomatis N hos mus cervikal slim stærkt hæmmes i dosisafhængige manerer(figur 2(c) og 2 (d)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. FVG hæmmer belastningen af C. trachomatis N i livmoderhalsen
Ved diagnosticering af chlamydial infektion er nukleinsyreamplificeringsteknikken inklusive polymerasekædereaktion (PCR) mere følsom og specifik end immunoassayet . Derfor testede vi yderligere belastningen af C. trachomatis N i musens livmoderhals med RT-PCR-metoden. På dag 15 var ekspressionen af 16S rRNA af C. trachomatis N hos mus signifikant højere end kontrolgruppen (figur 3). Behandling af FVG (2,2, 1,1 g/kg) i 12 dage kunne kraftigt hæmme belastningen af C. trachomatis N i livmoderhalsen (figur 3).
3.3. FVG mindsker C. trachomatis N-induceret Cervicitis og Vaginitis
infektionen af C. trachomatis hos mus er en passende model til undersøgelse af kønsorgansinfektioner. Infektionen inducerer ikke alvorlig kønspatologi i øvre kanal . Patologien af livmoderhalsen og vagina blev analyseret for at karakterisere sværhedsgraden af C. trachomatis n infektion.
som det er vist i figur 4, i kontrolgruppen var epithelcellerne og bindevævet i livmoderhalsen normale, ingen hyperplasi eller betændelse blev observeret. I modelgruppen har livmoderhalsepitellag hyperplasi, og de inflammatoriske celler blev infiltreret i epitelet og bindevævet. Efter behandling af FVG (1,1 g/kg) kunne den patologiske skade på livmoderhalsen reduceres signifikant (figur 4).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
som vist i figur 5 var det vaginale epitel i kontrolgruppen normalt, ingen hyperplasi eller betændelse blev observeret. I modelgruppen har vaginale epitellag hyperplasi, og de inflammatoriske celler blev infiltreret i epitelvævet. Efter behandling af FVG (2,2, 1,1 g/kg) kunne skaden af vagina reduceres signifikant (figur 5).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.4. FVG reducerer Serumcytokinresponserne fra C. trachomatis N-infektion
cytokinerne kan frigives af epitelcellerne og immuncellerne efter C. trachomatis-infektionen, hvoraf de fleste kommer fra Th1-celler. Disse cytokiner bidrager til immunresponserne, men inducerer den patologiske skade . Niveauerne af cytokin i serum blev testet for at understøtte de histologiske undersøgelsesresultater. På dagen blev niveauerne af IL-2, IL-17 og MCP-1 signifikant opreguleret (figur 6). Tre doser FVG kunne effektivt hæmme frigivelsen af IL-17 og MCP-1. Produktionen af IL – 2 kunne nedreguleres af FVG ved lave doser (1, 1 og 0, 55 g/kg).
(a)
(b) (b)
(c) (c)
(a)
(b)
(C)
3, 5. FVG reducerer C. trachomatis N-induceret Inklusionstælling In Vitro
proliferationen af C. trachomatis forekommer i værtscellerne med dannelsen af RBS. 12 timer efter infektion, som indeholder antal RBs . In vitro-inhiberingen af FVG på infektionen af C. trachomatis N blev evalueret med antallet af inklusion. Efter at HeLa-celler blev inkuberet med C. trachomatis N i 48 timer, kunne indeslutninger observeres med Giemsa-pletten. Efter behandling med FVG (FE) blev antallet af inklusion signifikant nedreguleret på en dosisafhængig måde (figur 7).
3.6. FVG reducerer den patologiske skade på livmoderhalsen induceret af E. coli og S. aureus
selvom C. trachomatis rapporteres at være det mest almindelige patogen for cervicitis, anaerober såsom E. coli, S. aureus og Klebsiella pneumoniae kunne isoleres hos cervicitis-patienterne . En rotte cervicitis model inficeret af blandingen af E. coli, S. aureus og N. gonorrhea var blevet etableret i vores tidligere arbejde . I den nuværende forskning blev en musemodel inficeret af blandingen af E. coli og S. aureus optimeret. 14 dage efter den første infektion viste livmoderhalsen sig at være alvorligt inficeret.
i kontrolgruppen var det cervikale epitel normalt, og der blev ikke observeret nogen hyperplasi eller betændelse. I modelgruppen har indre lag af livmoderhalsepitel hyperplasi, og de inflammatoriske celler (neutrofil og eosinofil) blev alvorligt infiltreret i epitelvævet. Efter behandling af FVG (2,2 og 1,1 g/kg) kunne betændelsen i livmoderhalsen hæmmes signifikant (figur 8).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4. Diskussion
diagnosen cervicitis er vanskelig på grund af manglen på det åbenlyse symptom. Hos nogle patienter kunne unormal mucopurulent udflåd og cervikal ektopi observeres . Mange pattedyrsmodeller af cervicitis var blevet etableret i de sidste årtier. Makakker, rotter og mus kunne bruges til at etablere cervicitis-modellen. Både bakterier (C. trachomatis) og kemiske forbindelser (phenol, eddikesyre) kunne bruges til at inducere cervicitis . I denne undersøgelse blev to musemodeller optimeret. Efter infektion med C. trachomatis N blev bakteriebelastningen af C. trachomatis N i livmoderhalsslim kontinuerligt hævet over tid. C. trachomatis n-infektionen kan føre til opregulering af cytokiner i serum og betændelse i væv i vagina og livmoderhalsen. Efter infektion med blandingen af E. coli og S. aureus kunne skaden af livmoderhalsen påvises ved patologisk diagnose.
klinisk var antibiotika det første valg til behandling af cervicitis ifølge forskellige patogener. Men fremkomsten af antibiotikaresistente såsom kinolonresistente C. trachomatis og N. gonorrhea, methicillinresistent S. aureus og vancomycin-resistent E. coli bliver et alvorligt problem over hele verden på grund af misbrug af antibiotika . TCM kan bidrage med alternative strategier til behandling af cervicitis. Virkningerne af FVG på cervicitis blev testet i denne forskning.
FVG er en vaginal gel, hvis gelbase er en blanding af carbopol 941 og ksantan gummi . I de senere år er mange kommercielle vaginale gelpræparater af kinesisk urteformel blevet brugt til behandling af cervicitis . Den vaginale lægemiddelafgivelse er en traditionel slimhindeleveringsvej, som kan bruges til behandling af både lokale og systemiske sygdomme . Traditionelle præparater, såsom suppositorier, geler, tabletter, vaginale film, kunstvanding og pessarer kan bruges som vaginale formuleringer . Som et af de mest anvendte lægemiddelafgivelsessystemer er vaginale geler blevet anvendt til fremstilling af mikrobicider, svangerskabsforebyggende midler, arbejdsinducerende midler og kønshormoner. Sammenligning med andre lægemiddelafgivelsessystemer er den vaginale gel sikrere og har højere biotilgængelighed .
alle de seks plantelægemidler i FVG kan anvendes til behandling af gynækologiske sygdomme i TCM . Det er en af de mest almindelige typer medicin, der bruges til at hjælpe mennesker med at få medicin, der kan hjælpe dem med at få medicin. Den kan bidrage mest til virkningerne af FVG. Iridoider og samlede glucosider af pæon er hovedsageligt isoleret fra hhv. Disse forbindelser viser signifikante antiinflammatoriske virkninger . Alkaloider og limonoider bidrager til den antibakterielle aktivitet af Dictamni bark . De fleste mennesker har en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en tendens til at have en negativ effekt . Alkaloiderne bidrager til den insekticide aktivitet af Stemonae Radiks . Disse bioaktive forbindelser af disse plantelægemidler kan understøtte behandlingen af FVG på cervicitis.
IL-17 produceres af Th17 celler karakteristisk. Klinisk er koncentrationen af IL-17 i kønssekretioner hos C. trachomatis-inficerede patienter signifikant højere end hos uinficerede kvinder . Det høje niveau af IL-17 i muservicitis-modellen var i overensstemmelse med det kliniske resultat. Niveauerne af IL-2 og MCP-1 er forbundet med svarene fra Th1. IL – 2 udskilles fra Th1-celler og stimulerer produktionen af cytokiner. Der er en omvendt sammenhæng mellem niveauet af MCP-1 og Th1-responserne. Inhiberingen af MCP-1 kan øge produktionen af IFN-kur . FVG kunne nedregulere koncentrationerne af IL-2, IL-17 og MCP-1. Disse resultater antydede, at FVG kunne hæmme cervicitis gennem regulering af værtsimmunresponser.
tidligt i C. trachomatis infektionscyklus, type III sekretionssystem gør det muligt for EBs at invadere værtscellerne . Internaliseringen af C. trachomatis efterfølges af udviklingen af RBs og indeslutninger. Inhibitoren af type III sekretionssystem kunne blokere dannelsen af indeslutninger . In vitro-undersøgelsen viste, at FVG kunne hæmme antallet af inklusion i HeLa-celler.
Som konklusion etablerede vi med succes to muservicitis-modeller med infektionen af C. trachomatis N, S. aureus og E. coli. Vi beviste, at FVG signifikant kunne hæmme cervicitis. FVG kunne nedregulere bakteriebelastningen, afbøde den patologiske skade og reducere antallet af inkludering. Virkningerne af FVG var forbundet med inhibering af patogener og regulering af værtsimmunresponser. Denne forskning giver bevis for, at FVG kunne bruges som et nyt alternativt middel, der lindrer problemet med antibiotikaresistent under behandlingen af cervicitis.
datatilgængelighed
de data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen.
interessekonflikter
forfatterne har ingen interessekonflikter relateret til dette arbejde.
forfatterens bidrag
Hin Mao og Ronghua Jao bidrog ligeligt til dette arbejde.
anerkendelser
denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 81773977 og 81774204).
