Kapillærelektroforese

IG1_02_20smc48-kapillær array

automatiseret DNA-sekventering ved kapillærelektroforese

separation af produkterne fra en radioaktivt mærket eller fluorescerende sekventeringsreaktion er historisk blevet udført i en poly-acrylamidpladegel, for eksempel den type, der anvendes i en 96-bane Abi 377. Ulemper ved denne metode inkluderer nødvendigheden af at forberede en frisk gel til hver sekventeringskørsel, manuel indlæsning af prøver i gelen, relativt lange køretider (8 ~ 10 timer til opløsning af et 1 kb DNA-fragment) og vanskeligheder med automatiseret og/eller manuel sporing af baner.

en alternativ separationsmetode bruger kapillærelektroforese. Der fremstilles en række standard DNA-sekventeringsreaktioner, hver i en brønd af en 8 række 12 kolonne 96-brøndplade. En række ultratynde kapillarrør (0.1 mm indvendig boring, 50 ~ 80 cm længde) er fyldt med en harpiksperleblanding og anbragt i et multikapillært array. Den ene ende af arrayet er monteret i en negativt ladet Katodeplade, så deres ender flugter med hver brønd på prøvepladen. Anvendelse af højspænding får det mærkede DNA i hver prøve godt til at komme ind i den tilsvarende kapillær og migrere selvom det mod det positivt ladede Anodebeholder. På grund af de anvendte høje spændinger kræver elektroforetisk adskillelse kun 1 ~ 3 timer. Som i pladegelelektroforese bevæger de mindre fragmenter sig hurtigere end de større . Endemærkefarverne aktiveres af en laser i detektorvinduet , og fluorescensbølgelængden for hvert fragment læses af et fotometer, når det passerer et fast punkt. I modsætning til slab gel-systemet er laser og fotometer FAST og fast og kan aktivere og læse flere side om side kapillærer samtidigt som separate datastrømme: dette undgår problemet med at spore separate baner i en slab gel. Mobilitetsdata sendes til en computer, og der genereres et kromatogram for hver prøve, der i det væsentlige er identisk med slab gel-systemet.

kapillære sekvensere bruger typisk en robot til automatisk at indlæse en stak prøveplader. Kapillærarrayet skylles med buffer mellem pladerne, så maskinen kan efterlades til at køre uden opsyn i mange kørsler. I de største faciliteter kan PCR-reaktioner også knyttes direkte til sekventeringsplader i robotarbejdsstationer, der betjener snesevis eller hundreder af kapillærsekvensere. Kromatogramdataene placeres på en server og kan hentes af brugere hundreder eller tusinder af miles væk. Stordriftsfordele kan gøre det billigere at outsource DNA-sekventering i stedet for at købe, vedligeholde og bemande en intern maskine.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.