aldh1 ekspression i embryonale og voksne mus pancreas. (A–C) immunofluorescerende mærkning for ALDH1-protein (grøn) i kombination med E-cadherin (rød) for at markere epitelstrukturer i E12.5 (a), E14.5 (B og B’) og voksen musepancreas (C). Billede i (B’) repræsenterer højere forstørrelsesvisning af området angivet med boks i (B). Bemærk begrænsning af aldh1-ekspression til spidser af epitelgrene (angivet med stjerner i B’) og ikke mere-centrale grenstammer (angivet med stjerne). I Voksen pancreas (C) er aldh1-ekspression begrænset til en delmængde af E-cadherin-positive centroacinarceller. D og E) immunhistokemisk påvisning af ALDH1-protein (brun) i undergrupper af centroacinar (pile) og terminale kanalceller (pilespids). (Skala barer: 50 liter.for yderligere at karakterisere aldh1-ekspression og ALDH1-aktivitet i voksne terminale kanal/centroacinarceller brugte vi præparater af perifere acinar-duktale enheder, der var frisk isoleret fra kollagenase-fordøjet mus eksokrin pancreas (22). Det er vigtigt, at disse isolerede perifere acinar-duktale enheder er markant udtømt af store kanaler og endokrine elementer. Sammenlignet med total pancreas udviste perifere acinar-duktale enheder en >400 gange depletion i insulintranskripter, som vurderet ved RT-PCR (Fig. S2A). Når FACS-analyse blev udført på perifere acinar-duktale enheder høstet fra transgene Ins1:dsred-mus, der udtrykte rødt fluorescerende protein i kur-celler, var kun 3 ud af 10.000 celler (0,03%) fra dette præparat positive for DsRed.

yderligere tredimensionel karakterisering af ALDH1-proteinekspression blev opnået ved anvendelse af helmonteret fluorescerende mærkning af isolerede perifere acinar-duktale enheder. ALDH1-protein blev lokaliseret i kombination med E-cadherin som en markør for epitelceller og med enten FITC-konjugeret dolichos biflorus agglutinin (DBA) eller FITC-konjugeret peanutagglutinin (PNA), markører af henholdsvis duktale og acinære celler. Flerkanalsbilleddannelse bekræftede en overvejende centroacinar / terminal duktal placering af ALDH1-ekspressive epitelceller i Voksen pancreas (Fig. S3). ALDH1-ekspressive celler blev oftest indsat mellem terminalt duktalt epitel og mere perifere acinarceller. Derudover blev ENKELTEPITEL ALDH1-ekspressive celler også observeret umiddelbart ved siden af terminal duktalt epitel (Fig. S3 A og B). Både DBA-positive og DBA-negative ALDH1-positive celler blev identificeret, mens ALDH1-positive PNA-positive celler kun sjældent blev identificeret.

isolering af ALDH1-ekspressive Centroacinære og terminale duktale celler.

i håb om at isolere ALDH1-ekspressive celler fra voksen musepancreas udnyttede vi et fluorogent substrat kendt som “Aldefluor” (StemCell Technologies), som tidligere er blevet brugt i FACS-baseret isolering af hæmatopoietiske, neurale og brystepitelstamceller (17-19). Før vi forsøgte FACS – baseret isolering af ALDH1-ekspressive pancreasepitelceller, anvendte vi først dette reagens til at visualisere levende ALDH1-ekspressive celler i perifere acinar-duktale enheder (Fig. 2). Som vist i Fig. 2 E og F bekræftede disse undersøgelser den centroacinar / terminale duktale placering af Aldefluorpositive celler med lav overflod i Voksen musepancreas. Aldefluor-positive centroacinar / terminale duktale celler blev let skelnet fra tilstødende acinarceller på grund af deres lille størrelse og mangel på cymogengranulat. Yderligere eksempler på levende cellebilleddannelse ved anvendelse af Aldefluorreagensen er tilvejebragt i Fig. S4. Disse fund antydede, at anti-ALDH1 immunofluorescens og Aldefluorbaseret cytofluorescens mærkede en lignende centroacinar/terminal duktal population og antydede yderligere, at disse celler med succes kunne isoleres af FACS.

Vi fulgte derefter FACS-baseret karakterisering og sortering af enkeltceller dissocieret fra perifere acinar-duktale enheder. Som et indledende middel til at etablere specifik gating af ALDH1-ekspressive celler anvendte vi en farmakologisk hæmmer af ALDH1-aktivitet (DEAB). Som vist i Fig. 2 A–D, tillod denne strategi isolering af en cellepopulation med lav overflod karakteriseret ved høje niveauer af DEAB-følsom ALDH1-aktivitet, omfattende 0,9% liter 0.2% af alle sorterede celler i Voksen musepancreas. Ved anvendelse af et E-cadherin-antistof til samtidig identifikation af epitelceller viste Aldefluor (+) E-cadherin (+) celler sig at repræsentere 0,5% liter 0,13% af alle sorterede celler i Voksen musepancreas (Fig. 2D).

brug af kvantitativ RT-PCR til at sammenligne Aldefluor-positive, E-cadherin-positive (A+E+), Aldefluor-negative, E-cadherin-positive (A−E+), Aldefluor-positive, E-cadherin-negative (A+E−) og Aldefluor-negative, E-cadherin-negative (A−E−) populationer isoleret fra voksne mus pancreas, fandt vi, at A+E+ populationen var signifikant beriget til transkripter, der koder for aldh1a1 og aldh1a7 og udtømt for udskrifter for to andre aldh1-isoformer, aldh1a2 og Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 blev ikke påvist i nogen af prøverne. Sammenlignet med A−E+-populationen blev A+E+-celler beskedent udtømt af udskrifter for Pdks1 (P 0,09), Amylase (P 0,001) og Cytokeratin-19 (P 0,01) (markører udtrykt i differentierede henholdsvis Kursceller, acinarceller og kanalceller). I modsætning hertil blev A+E+ – celler karakteriseret ved ekspression på højt niveau af Ptf1a, på trods af at de var udtømt af både Amylase-transkripter og amylase-protein (Fig. 3G og Fig. S5). Derudover blev disse celler beriget til transkripter, der koder for Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Soks9, Hey1 og Hey2, markører, der tidligere var forbundet med progenitorpopulationer i bugspytkirtlen og andre væv. Ved hjælp af immunofluorescerende mærkning på cytospinpræps af FACS-sorterede celler bekræftede vi markant berigelse for aldh1 og Soks9 protein og udtømning af amylase i A+E+ celler (Fig. S5). Derudover udførte vi også FACS-analyse for at bestemme den hyppighed, hvormed Aldefluor (+) celler også var positive for stamcellemarkører, såsom CD133 og Sca-1-protein, og observerede, at over 90% af Aldefluor ( + ) – cellerne desuden coudtrykt begge disse stamcellemarkører. I modsætning hertil var kun 0,11% af Aldefluor (+) celler også positive for den vaskulære endotelmarkør PECAM, mens 0,08% var positive for den hæmatopoietiske markør CD45. Når FACS-analyse blev udført på perifere acinar-duktale enheder høstet fra transgene Ins1-dsred-mus, der udtrykte rødt fluorescerende protein i relus-celler, blev alle Aldefluor (+) celler fundet at være negative for dsred.

Pancreatosfæreanalyse af endokrin og eksokrin Stamfaderfunktion.

som en indledende skærm for stamfaderlignende aktivitet analyserede vi Aldefluor (+) og Aldefluor (-) celler for evnen til at danne pancreatosfærer (Fig. 3), svarende til neurosfære-analysen, der ofte bruges til at identificere neurale forfædre (23). I disse analyser var A+ E + centroacinar / terminale duktale celler unikt i stand til at danne kugler i suspensionskultur. A+ E + celler viste en kugleformende effektivitet >100 gange deres A−E+ modstykker (Fig. 3 A og B og tabel S1). Med lavere effektivitet var enkelt A+ E + celler endda i stand til at danne kugler, når de blev belagt med klonal densitet (en celle pr.brønd) i 96-brøndsplader (tabel S1). Ingen af de E-cadherin-negative populationer udviste betydelig sfæreformende kapacitet. Når dyrket over en 5 – til 7-dages periode, pancreatosfærer afledt af A+E+ celler udviste stærk ekspression af E-cadherin (Fig. 3C), der bekræfter deres epitelidentitet, og individuelle celler inden for kuglerne begyndte at akkumulere betydelige mængder af enten amylase eller insulin og insulin C-peptid (Fig. 3 D og E). Efter 5 dage udviste 50% af pancreatosfærerne ekspression af amylase, mens omkring 30% udviste immunoreaktivitet over for insulin C-peptid. Individuelle kugler var generelt positive for enten insulin eller amylase, men ikke begge dele. Små undergrupper af celler inden for kuglerne opretholdt aldh1-ekspression i kulturperioden og demonstrerede også nuklear ekspression af Soks9-protein (Fig. 3 F og G), hvilket tyder på mulig vedligeholdelse af en selvfornyende stamfaderpool. Denne tilsyneladende kapacitet til selvfornyelse blev yderligere understøttet af det faktum, at pancreatosfærer genereret af Aldefluor (+) centroacinar/terminale duktale celler kunne udsættes for seriel dissociation og opretholde deres kugleformende kapacitet over mindst tre sekventielle passager med 7-dages intervaller. Derudover var celler inden for sfærer stærkt proliferative, som vurderet ved inkorporering natten over af EdU tilføjet i enten begyndelsen eller slutningen af kulturperioden (Fig. 3H).

baseret på de forskellige stamcellekapaciteter, der vises af A+E+ celler, undersøgte vi yderligere sorterede cellepopulationer til ekspression af Ngn3, en markør for endokrine stamceller (Fig. S2B). I overensstemmelse med tidligere undersøgelser (7) var vi ikke i stand til at påvise signifikant ekspression af Ngn3 i hverken total voksen pancreas eller nogen af de frisk sorterede cellepopulationer. Når først A+E+ – cellerne blev anbragt i kultur, begyndte de imidlertid at generere påviselig ekspression af Ngn3 umiddelbart forud for begyndelsen af insulinekspression, hvilket yderligere bekræftede den endokrine stamfaderkapacitet af ALDH1-udtrykkende centroacinar og terminale duktale epitelceller.

Pancreatosfærer afledt af Aldefluor (+) terminale duktale / Centroacinære celler viser Glukoseresponsiv insulinsekretion.

påvisningen af celler, der udtrykker insulin og insulin C-peptid i dyrkede pancreatosfærer, førte til vurdering af, om disse celler var i stand til glucoseresponsiv insulinsekretion, et kendetegn ved funktionelle larr-celler. Som en positiv kontrol brugte vi Ins-1-celler (klon 832/13) en udødeliggjort priscellelinje, der almindeligvis anvendes til undersøgelser af insulinsekretion som reaktion på fysiologiske koncentrationer af glucose. Efter inkubation natten over af enten pancreatosfærer eller ins-1 celler i 0, 5, og 11 mM glukose, både kulturmediesupernatanter og cellelysater blev høstet og analyseret for udskilt og cellulært insulin C-peptid ved hjælp af en ELISA-baseret analyse. Pancreatosfærer afledt af Aldefluor ( + ) centroacinar/terminale duktale celler udskilt C-peptid på en glukoseafhængig måde med glukosefølsomhed svarende til den, der vises af Ins-1-celler (Fig. 3I).

Aldefluor (+) voksne terminale duktale / Centroacinære celler kan bidrage til embryonale endokrine og eksokrine Slægter.

som en endnu strengere test for pancreasprogenitoraktivitet mikroinjicerede vi isolerede Aldefluor (+) og Aldefluor (–) celler i mikrodissekterede dorsale bugspytkirtelknopper isoleret fra E12.5 musembryoner og analyseret for en evne til produktivt at bidrage til udviklingen af endokrine og eksokrine slægter (Fig. 4). Denne fremgangsmåde blev for nylig brugt til at dokumentere stamcelleaktivitet for ngn3-ekspressive celler, der opstod efter ligering af bugspytkirtelkanalen (7). For at spore afstamningen af voksenafledte donorceller og skelne dem fra deres embryoafledte modstykker isolerede vi Aldefluor (+) og Aldefluor (-) celler fra bugspytkirtlen hos mus, der bærer en allestedsnærværende udtrykt pCAG:mCherry transgen, som skematisk afbildet i Fig. 4A (pCAG:mCherry mus blev venligt leveret af Michael Ulfgang, Johns Hopkins University). Sammenlignet med Aldefluor (–) celler bar Aldefluor (+) celler et dramatisk forbedret potentiale til at bidrage til nye endokrine slægter inden for de modne dorsale knopper, som demonstreret ved coekspression af mCherry med begge C-peptid (Fig. 4 B–E) eller glukagon (Fig. 4 F-I). Ved hjælp af overlejret E-cadherin − mærkning for at tillade tælling af individuelle mcherry-positive celler vurderede vi kvantitativt evnen hos voksne Aldefluor (+) og Aldefluor ( – ) celler til at komme ind i embryonale slægter. Syv dage efter mikroinjektion af Aldefluor (+) celler i E12.5 dorsale knopper, ekspression af glukagon blev observeret i 11,7% af resterende mcherry-positive celler, med insulin C-peptidekspression observeret i yderligere 11,6% (Fig. 5N). I modsætning hertil udtrykte 2,4% af de resterende Mcherry-positive Aldefluor (−) celler glukagon, og kun 0,2% udtrykte insulin C-peptid. Interessant nok viste aldefluor ( + ) og Aldefluor ( – ) populationer tilsvarende evner til at indgå i ikke – endokrine epitellinjer, hvilket måske afspejler det faktum, at det meste af Aldefluor ( – ) populationen bestod af allerede differentierede acinarceller. Lignende frekvenser af E-cadherin, amylase og PNA – positivitet blev observeret i resterende mcherry-positive celler afledt af enten aldefluor (+) eller Aldefluor ( – ) populationer (Fig. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

for at evaluere in vivo-opførsel af ALDH1-ekspressive centroacinar-og terminale kanalceller vurderede vi mønstre af ALDH1-ekspression i indstillingen af kronisk inflammation og regenerativ metaplasi induceret ved sekventiel administration af lavdosis caerulein. Som tidligere rapporteret (15) inducerede behandling af voksne mus med tre injektioner af caerulein (50 kg/kg) om ugen i 3 på hinanden følgende uger en tilstand af kronisk pankreatitis efterfulgt af næsten fuldstændig regenerering og reparation. Denne proces er kendetegnet ved inflammatoriske infiltrater, stromal ekspansion og dannelsen af regenerative metaplastiske rørformede komplekser, som inkluderer type-1 rørformede komplekser, der tidligere er vist at være acinære celleafledte, og type-2 rørformede komplekser (TC2), der tidligere er vist at være nonacinære afledte og formodentlig stammer fra prolifererende terminale kanalceller (15). I modsætning til den relativt lave overflod af ALDH1-udtrykkende terminalkanal og centroacinarceller observeret i normal voksen pancreas (Fig. 5 A og B), ALDH1-udtrykkende terminalkanal (Fig. 5 C og D) og centroacinar (Fig. 5 E og F) celler blev markant ekspanderet i indstillingen af caerulein-induceret kronisk pankreatitis. Bemærk, type-2 rørformede komplekser bestod overvejende af ALDH1-ekspressive celler (Fig. 5h), hvorimod type-1 rørformede komplekser ikke viste tegn på aldh1-ekspression (Fig. 5G).