abstrakt

forskellige teknikker er tilgængelige til isolering af Candida i mundhulen. Sådanne metoder spiller en vigtig rolle i diagnosen og håndteringen af oral candidose. Den voksende betydning af Candida er delvis relateret til fremkomsten af HIV-infektion og den mere udbredte anvendelse af immunsuppressiv kemoterapi. Sammen med Candida albicans har der været en større anerkendelse af betydningen af nonalbicans Candida arter i oral candidosis. Identifikation af infektionsstammer af Candida er vigtig, fordi isolater af Candida-arter adskiller sig meget, både i deres evne til at forårsage infektion og også i deres modtagelighed over for antifungale midler. Således giver denne gennemgang Et overblik over de pålidelige metoder til candidal isolering og identifikation af isolater fra mundhulen.

1. Introduktion

udtrykket Candida stammer fra det latinske ord candid, hvilket betyder hvid. Candida sporer er en commensal, harmløs form af en dimorf svamp, der bliver invasiv og patogen pseudohyphae, når der er en forstyrrelse i florabalancen eller i svækkelse af værten .

oversættelsen af denne endogene commensal til den sygdomsfremkaldende parasit kan være forbundet med andre faktorer end selve organismens patogene egenskaber, hvilket er ret unikt sammenlignet med de fleste andre infektionssygdomme, hvor virulensen af organismerne betragtes som nøglefaktoren i patogenesen. Derfor er Candida-arter strengt opportunistiske. Det kunne siges med, at hverken de overfladiske eller de systemiske former for Candida-infektioner kunne initieres i fravær af underliggende patologi .

Der er mange arter af Candida (tabel 1), men den mest udbredte, der udvindes fra mundhulen, i både kommensal tilstand og i tilfælde af oral candidose, er C. albicans. Det anslås, at denne art tegner sig for over 80% af alle orale gærisolater.

i de senere år har der været en øget interesse for infektioner forårsaget af det opportunistiske patogen Candida. Den voksende betydning af Candida er delvis relateret til fremkomsten af HIV-infektion og den mere udbredte anvendelse af immunsuppressiv kemoterapi . Identifikation af infektionsstammer af Candida er vigtig, fordi isolater af Candida-arter adskiller sig meget, både i deres evne til at forårsage infektion og også i deres modtagelighed over for antifungale midler .

sammen med C. albicans har der været en større anerkendelse af betydningen af de ikke-albicans Candida arter i human sygdom. C. glabrata og C. krusei er arter, der har fået opmærksomhed på grund af deres forbedrede resistens over for visse antifungale midler. C. dubliniensis er en nyligt identificeret patogen art, der først blev beskrevet i 1995, da den blev coisoleret med C. albicans fra tilfælde af oral candidose hos HIV-inficerede individer .

denne gennemgang giver et overblik over de pålidelige metoder til candidal isolering og identifikation af isolater fra mundhulen.

2. Patogene egenskaber af Candida

overgangen af Candida fra en harmløs kommensal til en patogen organisme er kompleks og er relateret til subtile miljøændringer, der fører til ekspression af en række virulensfaktorer (tabel 2). Det er den kombinerede effekt af både vært og candidale faktorer, der i sidste ende bidrager til udviklingen af oral candidose .

uanset typen af candidose er Candida-arternes evne til at fortsætte på slimhindeflader hos raske individer en vigtig faktor, der bidrager til dens virulens. Dette er især vigtigt i mundhulen, hvor organismen skal modstå den mekaniske vaskevirkning af en relativt konstant strøm af spyt mod spiserøret .

ingen enkelt dominerende virulensfaktor for Candida genkendes, selvom der er en række faktorer, der har været impliceret i at fremme infektionsprocessen. Disse inkluderer attributter involveret i adhæsion af Candida til orale overflader (f. eks. relativ celleoverfladehydrofobicitet og tilstedeværelsen af specifikke adhesinmolekyler), evnen til at modstå værtsimmunforsvarsmekanismer (f. eks., udskilt aspartylproteinaser og phospholipaser), der kan fremkalde skade på værtsceller .

3. Oral candidose

Samaranayake foreslog en klassificering, hvor de orale candidoselæsioner blev opdelt i to hovedgrupper: gruppe i eller primære orale candidoser begrænset til læsioner lokaliseret til mundhulen uden involvering af hud eller andre slimhinder; gruppe II eller sekundære orale candidoser, hvor læsionerne er til stede på de orale såvel som ekstraorale steder såsom hud (tabel 3). Gruppe i læsioner består af den klassiske triade—pseudomembranøse, erythematøse og hyperplastiske varianter—og nogle har foreslået yderligere opdeling af sidstnævnte i plaklignende og nodulære typer .

4. Diagnose af Oral candidose

diagnose af oral candidose kan ofte stilles på arten af de kliniske præsentationsfunktioner, selvom mikrobiologiske prøver skal tages, hvis det er muligt for både at identificere og kvantificere enhver Candida, der kan være til stede, og tilvejebringe isolater til antifungal følsomhedstest.

5. Metoder til isolering

tilgængelige teknikker til isolering af Candida i mundhulen inkluderer anvendelse af en udstrygning, en almindelig vatpind , en aftrykskultur , indsamling af hel spyt , den koncentrerede orale skylning og slimhindebiopsi. Hver metode har særlige fordele og ulemper, og valget af prøveudtagningsteknik styres primært af arten af den læsion, der skal undersøges (Tabel 4). Hvor en tilgængelig og defineret læsion er tydelig, foretrækkes ofte en direkte prøveudtagningsmetode, såsom brugen af en vatpind eller et aftryk, da dette vil give information om de organismer, der er til stede ved selve læsionen. I tilfælde, hvor der ikke er nogen åbenlyse læsioner, eller i tilfælde, hvor læsionen er vanskelig at få adgang til, er en indirekte prøve baseret på dyrkning af spytprøver eller en oral skylning mere acceptabel.

kvantitativ estimering af svampebelastning kan udføres ved hjælp af aftryk, koncentreret oral skylning og dyrkning af oral skylning som et middel til at skelne mellem kommensal transport og patogen eksistens af oral Candida, hvor højere belastninger betragtes som sandsynlige i sidstnævnte .

6. Direkte mikroskopi

morfologiske træk ved Candida-arter (tabel 5) skal undersøges for identifikation. En udstrygning er af værdi ved at skelne mellem gær-og hyphalformer, men er mindre følsom end kulturelle metoder . Fremstilling af prøven afslører ikke-pigmenterede septathyfer med karakteristisk dikotom forgrening (i en vinkel på cirka 45 liter) . I KOH-Calcofluor fluorescerende pletmetode svampe egenskaber som hyfer, gærceller og andre svampeelementer vil fluorescere .

en udstrygning taget fra læsionsstedet fastgøres til mikroskopglas og farves derefter enten ved gram-pletten eller ved periodisk syre Schiff (PAS) teknik. Ved hjælp af disse metoder vises candidal hyfer og gær enten Mørkeblå (Gram-plet) eller rød/lilla (PAS) .

i tilfælde af kronisk hyperplastisk candidose er en biopsi af læsionen nødvendig for efterfølgende påvisning af invaderende Candida ved histologisk farvning ved anvendelse af enten PAS eller gomoris methenamin sølvpletter. Demonstration af svampeelementer i væv udføres, da de farves dybt af disse pletter. Tilstedeværelsen af blastosporer og hyfer eller pseudohyphae kan gøre det muligt for histopatologen at identificere svampen som en art af Candida og i betragtning af tilstedeværelsen af andre histopatologiske træk stille en diagnose af kronisk hyperplastisk candidose .

7. Laboratoriekultur

7.1. Vatpind

en vatpind på et læsionssted er en relativt enkel metode til påvisning af vækst og semikvantitativ estimering af Candida kan opnås. Prøveudtagningsmetoden indebærer forsigtigt at gnide en steril vatpind over læsionsvævet og derefter efterfølgende inokulere et primært isolationsmedium, såsom Sabourauds glucoseagar (SDA) .

7, 2. Koncentreret Oral skylning

oral skylleteknik involverer, at patienten holder 10 mL sterilt fosfatbufret saltvand (0,01 M, pH 7,2) i munden i 1 minut. Opløsningen koncentreres derefter (10 gange) ved centrifugering og et kendt volumen, sædvanligvis 50 liter, inokuleres på et agarmedium under anvendelse af et spiralbelægningssystem. Efter 24-48 timers inkubation ved 37 liter C vurderes væksten ved Optælling af kolonier og udtrykkes som candidal kolonidannende enheder pr .mL (cfu mL−1) skylning.

7, 3. Imprint Culture

imprint-metoden anvender en steril skumpude af kendt størrelse (typisk 2,5 cm2), der tidligere er dyppet i et passende flydende medium, såsom Sabourauds bouillon, umiddelbart før brug. Puden placeres derefter på målstedet (slimhinde eller intraoral protese) i 30 sekunder og overføres derefter til en agar til kultur .

8. Kulturmedier

det hyppigst anvendte primære isolationsmedium til Candida er SDA, som, selvom det tillader vækst af Candida, undertrykker væksten af mange arter af orale bakterier på grund af dets lave pH. inkorporering af antibiotika i SDA vil yderligere øge dets selektivitet . Typisk inkuberes SDA aerobt ved 37 liter C i 24-48 timer. Candida udvikler sig som creme, glatte, pastaagtige konvekse kolonier på SDA, og differentiering mellem arter er sjældent mulig . Det anslås, at mere end en Candida-art forekommer i cirka 10% af de orale prøver, og i de senere år er evnen til at opdage nonalbicans-arter blevet stadig vigtigere .

i de senere år er der udviklet andre differentierede medier, der muliggør identifikation af visse Candida-arter baseret på koloniens udseende og farve efter primær kultur. Fordelen ved sådanne medier er, at tilstedeværelsen af flere Candida-arter i en enkelt infektion kan bestemmes, hvilket kan være vigtigt ved valg af efterfølgende behandlingsmuligheder . Eksempler på disse inkluderer Pagano-Levin-agar eller kommercielt tilgængelige kromogene agarer, nemlig CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate eller Candichrom albicans .Pagano-Levin agar skelner mellem Candida-arter baseret på reduktion af triphenyltetrasoliumchlorid. Mediet producerer blegfarvede kolonier af C. albicans, mens kolonier af andre Candida-arter udviser forskellige grader af lyserød farve. Pagano-Levin agar har en lignende følsomhed over for SDA, men er overlegen til påvisning af mere end en art i prøven , chromagar Candida identificerer C. albicans, C. tropicalis og C. krusei baseret på koloniens farve og udseende , mens Albicans ID og Fluroplate har vist sig at være gavnlige for den formodede identifikation af C. albicans . Specificiteten af identifikationen er rapporteret at være 95% for CHROMagar Candida og 98,6% for Albicans ID og Fluroplate agarer . Anvendelsen af CHROMagar Candida som en primær isolationsagar er blevet citeret som en tilgang, der tillader forskelsbehandling af den nyligt beskrevne C. dubliniensis fra C. albicans. På CHROMagar Candida Udvikler C. dubliniensis sig som mørkere grønne kolonier sammenlignet med C. albicans . Imidlertid, forskelsbehandling mellem disse to arter, der bruger CHROMagar, ser ud til at falde ved subkultur og opbevaring af isolater. Manglende C. dubliniensis til at vokse på agar medier ved den forhøjede inkubation temperatur på 45 liter C er for nylig blevet foreslået som en alternativ test for at skelne mellem disse to arter .

9. Identifikation af Candida-arter

identifikation af gær baseret på primære dyrkningsmedier kan bekræftes gennem en række supplerende tests, der traditionelt er baseret på morfologiske (tabel 5) og fysiologiske egenskaber ved isolaterne.

9, 1. Morfologiske kriterier

kimrørstesten er standardlaboratoriemetoden til identifikation af C. albicans. Testen involverer induktion af hyphal udvækst (kimrør), når de er subkultureret i hesteserum ved 37 liter C i 2-4 timer. Cirka 95% af C. albicans isolater producerer kimrør, en ejendom, der også deles af C. stellatoidea og C. dubliniensis .

C. albicans og C. dubliniensis kan også identificeres fra andre arter baseret på deres evne til at producere morfologiske træk kendt som chlamydosporer. Chlamydosporer er refraktile, sfæriske strukturer genereret ved slutningen af hyfer efter kultur af isolater på et ernæringsmæssigt Dårligt medium, såsom majsmelagar. Isolater inokuleres i et krydslukemønster på agaren og overlejres med et sterilt dækglas. Agarer inkuberes i 24-48 timer ved 37 liter C og undersøges derefter mikroskopisk for tilstedeværelse af chlamydospore .

9, 2. Fysiologiske kriterier/biokemisk identifikation

biokemisk identifikation af Candida-arter er stort set baseret på kulhydratudnyttelse. Traditionel test ville have involveret kultur af testisolater på en basal agar, der mangler en kulstofkilde. Kulhydratopløsninger placeres derefter i brønde på den podede agar eller på filterpapirskiver placeret på agaroverfladen. Vækst i nærheden af kulstofkilden ville indikere udnyttelse. Kommercielle systemer er baseret på det samme princip, men testkulhydrater er anbragt i plastbrønde placeret på en teststrimmel. Vækst i hver brønd læses af ændringer i turbiditet eller farveændringer i visse kitsystemer. Numeriske koder opnået fra testresultaterne bruges til at identificere testorganismen baseret på databasesammenligning .

9, 3. Serologi

serologiske tests bruges ofte til at fastslå den kliniske betydning af Candida-artsisolater. Stigende titere af lgG-antistoffer mod C. albicans kan afspejle invasiv candidiasis hos immunkompetente individer. Påvisning af IgA-og IgM-antistoffer er vigtig for at identificere en akut infektion. Immunsupprimerede individer viser ofte variation i antistofproduktion, og i et sådant tilfælde anbefales anvendelse af en antigendetekteringstest. Elisa og radio immuno assay (RIA) til påvisning af candidial antigen, enten cellevæg mannan eller cytoplasmatiske bestanddele er nu tilgængelige i udviklede lande .

serologisk diagnose er ofte forsinket, og testene mangler stadig følsomhed og specificitet. Desuden er antistofproduktion hos immunkompromitterede patienter variabel, hvilket gør diagnosen kompliceret . Dette skyldes det faktum, at svampeantigener og metabolitter ofte ryddes hurtigt fra kredsløbet, og tilstedeværelsen af antistoffer ikke altid indebærer en Candida-infektion, især hos patienter med alvorlig underliggende sygdom eller som tager immunsuppressive lægemidler .

serologiske tests er normalt ikke et diagnostisk værktøj til oral candidose. Sådanne tests kan imidlertid være et prognostisk instrument hos patienter med svær oral candidose, der reagerer dårligt på antimykotisk behandling .

9, 4. Molekylærbaserede identifikationsmetoder

identifikation ved analyse af genetisk variabilitet er en mere stabil tilgang end anvendelse af metoder baseret på fænotypiske kriterier. Til identifikation af Candida baseret på genetisk variation er analyser af elektroforetiske karyotypeforskelle og restriktionsfragmentlængde polymorfier (RFLP ‘ er) ved hjælp af gelelektroforese eller DNA-DNA-hybridisering .

artsspecifikke PCR-tilgange er også blevet anvendt til identifikation af Candida-arter. Flere målgener er rapporteret for Candida-artsdiskrimination, skønt de hyppigst forstærkede er sekvenserne af ribosomalt RNA operon. Identifikation kan opnås baseret på PCR-produktstørrelser opnået efter opløsning af gelelektroforese eller PCR-produktsekvensvariation bestemt enten ved direkte sekventering eller ved anvendelse af restriktionsfragmentanalyse efter skæring af PCR-sekvenser med restriktionsendonukleaser .fluorescens in situ hybridisering med peptidnukleinsyremetode (PNA-fisk) er en ny detektionsteknik, der er målrettet mod stærkt konserverede artsspecifikke sekvenser i den rigelige rRNA af levende C. albicans. Individuelle celler kan detekteres direkte uden behov for amplifikation . Denne teknik opnår en følsomhed på 98,7-100% med en specificitet på 100%, hvilket muliggør forskelsbehandling af C. albicans fra den fænotypisk lignende C. dubliniensis .

Molekylærbaseret teknologi kan også bruges til at identificere stammer af Candida-arter, selvom brugen af teknikker såsom pulseret Feltgelelektroforese (PFGE), tilfældig forstærket polymorf DNA (RAPD) analyse og gentagen sekvensforstærkning PCR (REP) er stort set forbeholdt epidemiologiske undersøgelser i forskning af oral candidose .

10. Konklusion

i de senere år er der lagt større vægt på pålidelig identifikation af Candida-arter fra humane kliniske prøver. En skematisk repræsentation for candidal isolation og identifikation er vist i Figur 1. Da Candida er den residente mikroflora, kræves passende isoleringsmetoder for at fastslå tilstedeværelsen i munden sammen med deres antal. Det er også vigtigt at identificere de inficerende stammer af Candida, fordi isolater af Candida-arter adskiller sig meget, både i deres evne til at forårsage infektion og også i deres modtagelighed for antifungale midler. Forskellige fænotypiske teknikker er tilgængelige til identifikation af isoleret Candida, herunder anvendelse af morfologiske kulturtest, differentielle agarmedier og biokemiske assimilationstest. Disse metoder suppleres med nyere molekylære teknikker, der stort set er forbeholdt epidemiologiske undersøgelser.

Figur 1

skematisk repræsentation af isolering og identifikation af Candida arter fra mundhulen.