human celleoverflademarkørscreening

hESC-og hPSC-RPE-celler blev dissocieret i enkeltceller ved hjælp af TrypLE i 5-10 minutter. Optiske vesikler blev dissocieret i enkeltceller ved hjælp af TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) i 10 minutter efterfulgt af fysisk dissociation gennem en 20 G nål. For at muliggøre samtidig analyse af disse forskellige befolkningsgrupper i den samme prøve, embryonale menneskelige stamceller, hPSC-RPE-celler, og optisk vesikel-celler blev mærket med CellTrace™ CFSE (0.25 µM) i 7 min ved 37 °C eller CellTrace™ Violet (5 µM) i 20 minutter ved 37 °C efter fabrikantens protokol (Thermo Fisher Scientific). Derefter blev de tre celletyper farvet ved hjælp af BD-Lyoplate-Skærmpanelerne (BD Biosciences) efter producentens protokol. Stregkodningen af celler gjorde det muligt let at skelne mellem de tre grupper af celler og minimere prøvevariabilitet under screeningen. Prøver blev analyseret på 96-brøndsplader på en lsrfortessa udstyret med 405, 640, 488, 355 og 561 nm lasere (Bd Biosciences) eller en Cytofleks udstyret med 405, 638, 488 og 561 nm lasere (Beckman Coulter). Ikke-levedygtige celler blev udelukket fra analysen ved anvendelse af 7-AAD (7-aminoactinomycin D) nukleinsyrefarve (BD Biosciences). Analysen af dataene blev udført ved hjælp af programmet V. 10 (Tree Star). Celleoverflademarkørskærmen blev udført en gang for 3D optiske vesikler og en gang for hPSC-RPE dag 60.

cellekultur

hESC-linjer HS980 og HS983 blev tidligere afledt og dyrket under kseno-fri og definerede betingelser30 (svensk etisk vurderingsmyndighed: 2011/745:31/3). Donorer gav deres informerede samtykke til afledning og efterfølgende brug af hESC-linjerne. HESC-linjen blev opnået fra HICELL og blev tilpasset til feederfri kultur på hrLN – 521 (10 liter/mL, Biolamina). Celler blev opretholdt ved klonal formering på hrln-521-coatede plader i NutriStem hPSC-medium (Biological Industries) i en 5% CO2/5% O2-inkubator og passeres f.eksymatisk i forholdet 1:10 hver 5-6 dage.

hiPSC-linjer CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I og CTRL-14-II blev venligt leveret af Karolinska Institutet iPSC Core facility (svensk etisk vurderingsmyndighed: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Donorer gav deres informerede samtykke til afledning og efterfølgende brug af hiPSC-linjerne. Celler blev opretholdt ved klonal formering på hrln-521-belagte plader (Biolamina) i NutriStem hPSC-medium (Biological Industries) i en 5% CO2/5% O2-inkubator og passeres f.eksymatisk ved 1:10-forhold hver 5-6 dage.

til passage blev sammenflydende kulturer vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) uden Ca2+ og Mg2+ og inkuberet i 5 minutter ved 37 liter C, 5% CO2/5% O2 med TrypLE Select. Derefter blev cellerne opsamlet i frisk forvarmet NutriStem hPSC-medium ved forsigtig pipettering for at opnå en enkeltcellesuspension. Celler blev centrifugeret ved 300 liter g i 4 minutter, pelleten blev resuspenderet i frisk forvarmet NutriStem hPSC-medium og celler belagt på en frisk hrln-521-belagt skål. To dage efter passage blev mediet erstattet med frisk forvarmet NutriStem hPSC-medium og ændret dagligt.

hPSC-RPE monolagsdifferentiering

en trinvis protokol, der beskriver differentieringsprotokollen, findes ved Protokoludveksling36. hESC eller hiPSC blev belagt med en celletæthed på 2,4 liter 104 celler/cm2 på lamininbelagte fade (20 liter/mL) ved anvendelse af NutriStem hPSC-medium. Rho-kinaseinhibitor (Y-27632, Millipore) i en koncentration på 10 liter blev tilsat i løbet af de første 24 timer, mens cellerne blev holdt ved 37 liter C, 5% CO2/5% O2. Efter 24 timer blev hPSC-medium erstattet med differentieringsmedium NutriStem hPSC uden basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og transformerende vækstfaktor-Karri (TGF Karri) (biologiske industrier) og celler blev placeret ved 37 karrist C, 5% CO2/21% O2. Fra dag 6 efter plettering blev 100 ng/mL Activin A (R&D-systemer) føjet til medierne. Celler blev fodret tre gange om ugen og holdt i 30 dage. Monolag blev derefter trypsiniseret ved hjælp af TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) i 10 minutter ved 37 liter C, 5% CO2. Ved forsigtig pipettering blev cellerne opsamlet i frisk, forvarmet NutriStem hPSC-medium uden bFGF og TGF-kur ved forsigtig pipettering for at opnå en enkeltcellesuspension. Cellerne blev centrifugeret ved 300 liter g i 4 minutter, pelleten blev resuspenderet, passeret gennem en cellesil (kar 40 liter, Bd Biosciences), og celler blev podet på lamininbelagte retter (hrLN-111 og hrLN-521 ved 20 mg/mL) ved forskellige celletætheder i området fra 1,4 liter 106 til 1,4 liter 104 celler/cm2. Replerede celler blev fodret tre gange om ugen i løbet af de efterfølgende 30 dage med NutriStem hPSC-medium uden bFGF og TGF-kur. For hPSC-RPE in vitro-differentiering i 3D-suspension EBs fulgte vi vores tidligere offentliggjorte protokol10. Kort sagt blev pluripotente stamceller dyrket til sammenløb på rhLN – 521 og manuelt skrabet for at producere EBs ved hjælp af en 1000 liter pipettespids. EBs blev derefter dyrket i suspension i lave fastgørelsesplader (Corning) med en densitet på 5-7 liter 104 celler/cm2. Differentiering blev udført i specialfremstillet NutriStem hESC-medium, hvor bFGF og TGF kur er blevet elimineret med medieskift to gange om ugen. Ti mikromoler af Rho-kinasehæmmer (Y-27632, Millipore) blev kun tilsat suspensionskulturerne i løbet af de første 24 timer. efter 5 ugers differentiering blev pigmenterede områder mekanisk skåret ud af EBs ved hjælp af en skalpel. Celler blev derefter dissocieret ved hjælp af TrypLE Select, efterfulgt af skylning gennem en 20 G nål og sprøjte. Celler blev podet gennem en cellesil (Karr 40 Karr, Bd Biosciences) på Ln-belagte retter ved en celletæthed på 0.6-1.2 liter 104 celler/cm2 og fodres to gange om ugen med samme differentieringsmedium nævnt ovenfor. Lyse feltbilleder blev erhvervet med et Nikon Eclipse TE2000-s mikroskop, og et Canon SH 170 is kamera blev brugt til at fange pigmentering fra toppen af brøndene.

kvantitativ realtids PCR

Total RNA blev isoleret ved hjælp af Rneasy Plus Mini Kit og behandlet med Rnasefri DNase. Komplementært DNA (cDNA) blev syntetiseret under anvendelse af 1 liter Total RNA i 20 liter-reaktionsblanding, indeholdende tilfældige sekskamere og Superscript III revers transkriptase (Gibco, Invitrogen) ifølge producentens anvisninger.

Strømningscytometri

Cellesortering blev udført på hPSC-RPE-kulturer efter 21 eller 30 dages differentiering. Celler blev inkuberet med de nævnte konjugerede antistoffer på is i 30 minutter. FMO-kontroller blev inkluderet for hver betingelse for at identificere og gate-negative og-positive celler. Farvede celler blev derefter sorteret ved hjælp af en BD FACS Aria Fusion Cell Sorter (BD Biosciences) ved hjælp af FACSDiva Sofrace v8.0.1.

lige efter sortering blev 70.000 celler fortyndet i 100 liter på 2% FBS og 1 mM EDTA (Sigma) cytospinnet i 5 minutter ved 400 r.P.M. på glasrutschebaner. Slides blev efterladt til tørring natten over ved stuetemperatur efterfulgt af fiksering med 4% methanolfrit formaldehyd ved stuetemperatur i 10 minutter og immunofluorescensfarvning.

immunofluorescens

histologi og vævsimmunfarvning

umiddelbart efter eutanasi ved intravenøs injektion af 100 mg / kg pentobarbital (Allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), øjnene blev enukleeret og bleb-injektionsområdet markeret med grønt Vævsmærkningsfarvestof (TMD) (Histolab-produkter). En intravitreal injektion af 100-fikseringsopløsning (FS) bestående af 4% bufret formaldehyd (Solvenco AB) blev udført før fiksering i FS i 24-48 timer og indlejring i paraffin. Fire mikrometer serielle sektioner blev produceret gennem det TMD-mærkede område, og hver fjerde sektion blev farvet med hæmatoksylin–eosin.til immunfarvning blev objektglassene deparaffineret, dehydreret i sorterede alkoholer og skyllet med Ddh2o og Tris-bufret saltvand (TBS, pH 7,6). Antigenudtagning blev opnået i 10 mM citratbuffer (trinatriumcitrat dihydrat, Sigma-Aldrich, pH 6,0) med 1:2000 mellem-20 (Sigma-Aldrich) ved 96 liter C i 30 minutter efterfulgt af 30 min afkøling ved stuetemperatur. Slides blev vasket med TBS og blokeret i 30 minutter med 10% normalt æsel serum (Abcam) fortyndet i TBS indeholdende 5% (vægt/v) IgG og proteasefrit bovint serumalbumin (Jackson Immunoresearch) i et befugtet kammer. Primære antistoffer fortyndet i blokerende buffer blev inkuberet natten over ved 4 liter C: humant nukleart mitotisk apparatprotein (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Crus bioteknologi sc-432) og CD56/NCAM1 (1:100, Santa Crus bioteknologi sc-7326, klon ) (supplerende Data 2). Sekundære antistoffer (æsel anti-kanin IgG (H + L) Aleksa Fluor 555 A31572 og æsel anti-mus IgG (H + L) Aleksa Fluor 647 A31571, begge fra Thermo Fisher Scientific) (supplerende Data 2) fortyndet 1:200 i blokerende buffer blev inkuberet 1 time ved stuetemperatur. Sektioner blev monteret med vektorvectashield med DAPI ((4′,6-diamidino-2-phenylindol)) monteringsmedium (Vektorlaboratorier) under en 24 L.50 mm2 dækglas.

til immunhistokemi blev dias deparaffiniseret efterfulgt af antigenudtagning (er2-opløsning, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) og farvning (IHC-protokol F) for CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Crus Biotechnology sc-432) og CD56 / NCAM1 (1:100, Santa Cros Biotechnology sc-7326, klon ) antistoffer (supplerende Data 2) på Bond-instrumentet (Leica Biosystems).billeder blev taget med Olympus IKS81 fluorescens inverteret mikroskop eller Lsm710-NLO punkt scanning konfokalt mikroskop. Analyse af billederne efter købet blev udført ved hjælp af ImageJ-programmet.

Fagocytoseanalyse

Fluoresceinisothiocyanat-mærket bovin POSs blev isoleret og venligt givet af Dr. E. F. Nandrot fra Institut de la Vision, Paris37. hPSC-RPE-celler blev dyrket på transvellemembran (0,33 cm2, Corning) belagt med hrLN-521 20 liter/mL i 1 måned efter såning. Celler blev inkuberet ved 37 liter C eller 4 liter C i 16 timer med 2,42 liter 106 optøet POS/Trans-brønd fortyndet i henholdsvis DMEM (Dulbecco ‘s modified Eagle’ s medium) eller CO2-uafhængige medier (begge fra Thermo Fisher Scientific). Efter inkubation blev cellerne slukket med Trypan Blue-opløsning 0.2% (Gibco, Invitrogen) i 10 minutter ved stuetemperatur, fikseret med 4% methanolfrit formaldehyd (Polysciences) ved stuetemperatur i 10 minutter og permeabiliseret med 0,3% Triton 100 i D-PBS i 15 minutter. Rhodamin phalloidinfarvning (1: 1000, 20 min ved stuetemperatur, Biotinum 00027) (supplerende Data 2) blev brugt til at visualisere cellegrænserne. Kerner blev farvet med Hoechst 33342 (1: 1000, 20 min ved stuetemperatur, Invitrogen).

billeder blev erhvervet med et konfokalt mikroskop. Efter erhvervelse analyse af billederne blev udført ved hjælp af Imaris (Bitplane) og POS kvantificeringer blev udført med CellProfiler 2.1.1 programmel. Anvendte moduler: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, Measureobjectstørrelserform, SaveImages og Eksporttospreadsheet. Objekter blev identificeret ved en typisk diameter på 10-40 billedenheder ved hjælp af to klasser, Global, Otsu, vægtet varians tærskelmetode med 0,01 og 1,0 nedre og øvre grænser og 2,1 korrektionsfaktor med klumpede objekter kendetegnet ved intensitet.

immunosorbentassay

hPSC-RPE-celler blev dyrket på Transvellemembraner (0,33 cm2, Millipore) belagt med forskellige substrater. Supernatanter fra både hPSC-RPE apikale og basale sider (hvilket betyder henholdsvis øvre og nedre rum i transrummet) blev opsamlet 60 timer efter, at mediet blev ændret. PEDF-sekretionsniveauer blev målt i triplicater for hver tilstand med kommercielt tilgængelige humane PEDF ELISA-sæt (BioVendor RD191114200R) blev anvendt i overensstemmelse med producentens anvisninger efter 60 dages kultur. Den optiske massefylde Sreadings blev målt ved hjælp af Spektramaks 250 Mikropladelæser (molekylære enheder). Resultaterne præsenteres som middelkurs sem.

TEER-målinger

Transepitelial elektrisk modstand RPE-celler belagt på Tværbrønde (0,33 cm2, Millipore) blev målt ved hjælp af Millicell Electrical Resistance system volt-ohm meter (Millicell ERS-2, Millipore) i henhold til producentens anvisninger. Tres-dages kulturer blev ækvilibreret uden for inkubatoren ved stuetemperatur i 15-20 minutter før eksperimentet. Målinger blev udført i uændrede kulturmedier i tre eksemplarer for hver tilstand ved tre forskellige positioner af hver brønd. Gennemsnit blev brugt til yderligere analyse. Baggrundsmodstanden blev bestemt ud fra en tom kulturindsats i det samme medie belagt med det tilsvarende substrat, men uden celler, og trukket fra den respektive eksperimenttilstand. Målinger rapporteres som modstand i ohm gange arealet i kvadratcentimeter (liter cm2). Resultaterne præsenteres som middelkurs sem.

Scanningselektronmikroskopi

hPSC-RPE-celler blev dyrket på translationsindsatser belagt med LN521 (20 liter / mL) i 60 dage. De blev fikseret ved nedsænkning i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4. Membranen blev skåret ud og vasket i Millik vand før trinvis ethanol dehydrering og kritisk-punkt-tørring ved hjælp af kulsyre (Leica EM CPD 030). Indsatser blev monteret på prøvestubber ved hjælp af kulstofklæbende faner og sputter belagt med et tyndt lag platin (Kvorum 150T ES). Scanningselektronmikroskopi billeder blev erhvervet ved hjælp af et Ultra 55 feltemissionsscanningselektronmikroskop (Seiss, Oberkochen, Tyskland) ved 3 kV og SE2 detektoren.

transmissionselektronmikroskopi

hPSC-RPE-celler blev dyrket på translationsindsatser belagt med LN521 (20 liter / mL) i 60 dage. De blev fikseret ved nedsænkning i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4. Transvellemembranen blev skåret ud og i tynde strimler, skyllet i 0,1 M phosphatbuffer, efterfulgt af postfiksering i 2% osmiumtetroksid i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4, ved 4 liter C i 2 timer. Membranstrimlerne blev udsat for trinvis ethanoludtørring og til sidst fladt indlejret i LH-112. Ultratynde sektioner (~50-60 nm) blev fremstillet under anvendelse af en Leica EM UC7 og kontrasteret med uranylacetat efterfulgt af blycitrat. Transmissionselektronmikroskopi billeddannelse blev udført på et Hitachi HT7700 transmissionselektronmikroskop (Hitachi High-Technologies), der blev betjent ved 80 kV, og digitale billeder blev erhvervet ved hjælp af et Veleta CCD-kamera (Olympus Soft Imaging Solutions).

encellet RNA-sekventering bioinformatisk analyse

Tres-dages hPSC-RPE-celler blev dissocieret ved hjælp af TrypLE Select og passeret gennem en cellesil (Karr 40 Karr, Bd Biosciences). De blev resuspenderet i en koncentration på 1000 celler/prisl i 0,04% BSA i PBS. Celler blev transporteret ved 4 C til det eukaryote Enkeltcellegenomikanlæg (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Sverige), hvor et 3′ cDNA-bibliotek blev forberedt til enkeltcellet RNA-sekventering med 10 gange genomikplatformen (10 gange genomik) ved hjælp af Novasek 6000-programmet. Cell Ranger 2.1.1 (10 gange Genomics) pipeline blev brugt til at konvertere Illumina base opkald filer til hurtig format, justere sekventering læser til hg19 transkriptom ved hjælp af STAR aligner38, og generere funktion-stregkode matricer. Cell Ranger kvalitetskontrolfiltrerede celler (718, 810, 931 og 1129 celleholdige dråber blev fanget til CD140b+GD2 -, CD140b+CD184−, replikerede henholdsvis 1:20 og hESC− prøver) blev analyseret i R version 3.5.1 (R Core Team)39 ved hjælp af Seurat suite version 2.3.440, 41. Som en yderligere kvalitet-kontrol måle, RPE-celler med unikt udtryk gener (≥2000 til ≤5000), UMIs (≥10.000 ≤30,000) og den procentvise andel af UMI tilknytning til MT gener (≥0.025 til ≤0,10 usd) blev valgt. På samme måde, embryonale menneskelige stamceller med unikt udtryk gener (≥2000 til ≤8000), UMIs (≥10.000 ≤80,000), og andelen af UMI tilknytning til MT gener (≥0.025 til ≤0,10 usd). Dette filtreringstrin resulterede i det endelige datasæt på henholdsvis 616, 725, 779 og 905 celler til CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replikerede henholdsvis 1:20 og hESC-prøver. Før dimensionalitetsreduktion ved hovedkomponentanalyse (PC) blev cellecellevariation i genekspression drevet af Umi ‘ er, mitokondrie genekspression og cellecyklusstadier regresseret ud under data skaleringsproces42. Variable gener inden for RPE-prøver blev valgt ud fra deres normaliserede gennemsnitlige ekspression og dispersion (ekspressionsskæring = 0,0125-5 og bunddispersionsskæring = 0,5). Til PC-udvælgelse blev resultaterne af PCHeatmap, jackstrem, PC-standardafvigelser og Clustree-analyse vurderet43. De første 15 pc ‘ er blev brugt til tsne projection44 og clustering analyse (opløsning = 0.1, forvirring = 40).

celleklynger blev analyseret ved to tilgange. Topdifferentielle gener blev først identificeret for hver klynge ved hjælp af rank-sum test. Sekundær, signaturgenekspression (modulscore) blev beregnet for udifferentieret hESC og flere celletyper til stede i human nethinden. Celler, der udtrykker mesoderm-markører, blev manuelt opdelt i en separat klynge ved hjælp af interaktive plotningsfunktioner i Seurat. Data uploades i ARRAYEKSPRESS (EMBL-EBI)—se detaljer nedenfor.

Dyr

efter godkendelse fra det nordlige Stockholm Animal eksperimentelle etiske udvalg (DNR N25 / 14) blev der anvendt 10 hvide albinokaniner (leveret af Lidk Primpings rabbit farm, Lidk Promping, Sverige) i alderen 5 måneder, der vejer 3,5 til 4,0 kg i denne undersøgelse. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med erklæringen om anvendelse af dyr i oftalmisk og Synsforskning.

Subretinal transplantation

hPSC-RPE monolag blev vasket med PBS, inkuberet med TrypLE og dissocieret til encellet suspension. Celler blev talt i et Neubauer-hæmocytometerkammer under anvendelse af 0,4% Trypanblåt (Thermo Fisher Scientific Corp.), centrifugeret ved 300 liter g i 4 minutter, og cellepelleten blev resuspenderet i friskfiltersteriliseret PBS til en endelig koncentration på 1000 celler/liter. Cellesuspensionen blev derefter aseptisk aciteret i 600 liter-enheder og holdt på is indtil operationen.dyr blev sat under generel anæstesi ved intramuskulær administration af 35 mg/kg ketamin (Ketaminol, 100 mg/mL, Intervet) og 5 mg/kg vet (rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), og pupillerne blev udvidet med en blanding af 0,75% cyclopentolat/2,5% phenylephrin (APL). Mikrokirurgi blev udført på begge øjne ved hjælp af en 2-port 25 G transvitreal pars plana teknik (Alcon Accurus, Alcon Nordic) som beskrevet tidligere45. Cellesuspensionen blev trukket ind i en 1 mL sprøjte forbundet med et forlængerrør og en 38 g polytip-kanyle (medone Surgical Inc). Uden forudgående vitrektomi blev kanylen indsat gennem den øvre temporale trocar. Efter korrekt spidspositionering, konstateret ved en fokal retinal flare, blev 50 liter cellesuspension (svarende til 50.000 celler) injiceret langsomt subretinalt ~6 mm under den nedre kant af synsnervehovedet og dannede en ensartet bleb, der var tydeligt synlig under driftsmikroskopet. Der blev sørget for at holde spidsen inde i bleb under injektionen for at minimere tilbagesvaling. Efter fjernelse af instrumentet blev der påført let tryk på de selvforseglende suturløse sclerotomier. To mikrogram (100 liter) intravitreal triamcinolon (Triescence, Alcon Nordic) blev administreret 1 uge før operationen, og der blev ikke givet postoperative antibiotika.

statistik og reproducerbarhed

til statistiske analyser, tovejsanalyse af varians og post hoc multiple sammenligninger ved hjælp af Tukeys testkorrektion blev udført for at vurdere in vitro forskelle i de forskellige densiteter vurderet og sortering versus replikerede betingelser i TEER-og PEDF-sekretionsassays.

alle kvantificeringer blev udført ublindet. Statistiske parametre inklusive definitioner og nøjagtig værdi af n (f.eks. samlet antal eksperimenter, replikationer osv.), afvigelser, p-værdier og typerne af de statistiske tests rapporteres i figurerne, de tilsvarende figurlegender og i dette afsnit. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Prism 7 (GraphPad-program, version 7.0 c). I alle tilfælde, statistisk analyse blev udført på data fra mindst tre biologisk uafhængige eksperimentelle replikater. Sammenligninger mellem grupper blev planlagt før statistisk test, og måleffektstørrelser var ikke forudbestemt. Fejllinjer, der vises på grafer, repræsenterer middelværdien af mindst tre uafhængige eksperimenter. Alle viste mikrografer er repræsentative billeder af tre uafhængige eksperimenter, medmindre andet er angivet (f.eks. 1c).

Rapporteringsoversigt

yderligere oplysninger om forskningsdesign findes i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.