anvendelse af ATP-analoger af konstruerede CDK ‘er
vi genererede mutante’ Shokat ‘ CDK ‘ er indeholdende aminosyreudvekslinger ved en konserveret voluminøs Rest i deres ATP-bindingslommer. I tilfælde af CDK2 og CDK3 var dette en phenylalanin til alaninudveksling i position 80, betegnet CDK2 (F80A). Vi syntetiserede også 12 ATP-analoger for at bestemme, om de konstruerede CDK ‘ er kan bruge disse analoger til phosphorylere rekombinant retinoblastom (Rb) protein in vitro og fandt ud af, at de anvendte N6-(2-phenylethyl)-ATP (PE-ATP) mest effektivt (figur 1a og data ikke vist). Selvom både vildtype og cyclin E-CDK2 (F80A) brugte normal ATP til phosphorylere glutathion-S-transferase (GST)-Rb-protein, var det kun F80A-kinasen, der kunne bruge PE-ATP. Lignende resultater blev opnået med cyclin E-CDK3, men i dette tilfælde kunne f80a-mutanten ikke længere bruge normal ATP, skønt det strukturelle grundlag for denne observation er uklart (figur 1a). Disse undersøgelser bekræftede, at vildtype-og konstruerede kinaser udviser de ønskede ATP-specificiteter.
karakterisering af de konstruerede CDK ‘ er. (a) Cyclin E-CDK2/3-komplekser eller deres f80a-konstruerede modstykker (angivet med stjerner) blev immunopræcipiteret fra transficerede U2OS-cellelysater via HA-tag på CDK-underenheden og underkastet in vitro-kinaseanalyser med 10 liter af enten normal ATP-eller PE-ATP-Analog. Phosphorylering af GST-Rb blev overvåget ved immunoblotting med et phosphospecifikt anti-pS780-Rb antistof (Ny England Biolabs). Vildtypekinaser kan ikke bruge PE-ATP. (B) Tyndlagskromatografi-analyse afslører hydrolyse af ATP i cellelysat og overførsel til acceptornukleotider (venstre). Positionerne for det frie fosfat og ATP er angivet. I modsætning hertil hydrolyseres ikke ATP-Kurt-s i cellelysater (højre). (c) Kinaseanalyser blev udført under anvendelse af vildtype-og cyclin A-CDK2 (F80A)-komplekser oprenset fra E. coli og GST-Rb i nærvær af 200 liter ATP, ATP-kar-s og PE-ATP-kar-s ved stuetemperatur i 2 timer. Kinasereaktioner blev analyseret ved SDS gelelektroforese og visualiseret ved coomassie-farvning. Omfanget af GST-Rb-phosphoryleringen blev overvåget af elektromobilitetsforskydningen af GST-Rb.
mens de mutante CDK ‘ er effektivt anvendte PE-ATP til phosphorylering af Rb in vitro, mislykkedes lignende eksperimenter, der anvendte radioaktivt mærket PE-ATP i cellelysater, fordi det mærkede phosphat blev spaltet fra PE-ATP ved en ATPase-aktivitet i lysaterne (data ikke vist). Vi skiftede derfor til thiophosphatformen af ATP-analogen (PE-ATP-Kurt-s), som ikke blev hydrolyseret af lysater (figur 1b). Selvom kinaser ofte bruger ATP-Kurt-s mindre effektivt end normalt ATP, har thiophosphorylering flere fordele i denne sammenhæng. For det første er thiophosphater mere stabile og resistente over for phosphataser . For det andet, da der ikke er nogen allerede eksisterende thiophosphoryleringshændelser i cellerne, giver thiophosphatmærkning unikke markører for proteiner phosphoryleret af den mutante kinase. Endelig har thiophosphatgruppen lignende kemiske egenskaber som sulfhydrylgruppen og er modtagelig for kemiske modifikationer. Vi udtrykte og oprensede opløselige vildtype-og cyclin a-CDK2 (F80A)-komplekser fra bakterier og udførte et lignende RB-kinase-assay for at teste deres evne til at bruge PE-ATP-karrus-S. Som vist i figur 1C, selv om begge kinaser kan bruge ATP eller ATP-Kurt-s til phosphorylere GST-Rb-protein (som angivet ved dets elektromobilitetsskift), kan kun f80a-mutanten bruge PE-ATP-Kurt-S. Vi brugte således PE-ATP-Kurt-s til alle vores efterfølgende undersøgelser.
enkelttrinsrensning af thiophosphorylerede peptider
anvendelsen af konstruerede CDK ‘ er og ATP-analoger letter meget specifik substratphosphorylering: den næste udfordring er, hvordan man identificerer dem inden for et komplekst lysat. Vi forsøgte at udnytte thiophosphatmærkerne til kovalent at fange og berige thiophosphorylerede peptider efter phosphorylering og fordøjelse af lysaterne. Et centralt problem var imidlertid at kemisk skelne mellem thiophosphopeptider og cysteinholdige peptider. Selvom en kemoselektiv metode til berigelse af thiophosphopeptider er blevet beskrevet, gør den overvældende overflod af cysteinrester i en kompleks proteinblanding denne tilgang vanskelig . Vi brugte en simpel indfangnings – og frigivelsesmetode til selektivt at isolere thiophosphorylerede peptider i trypsiniserede cellelysater (figur 2a). Proteiner inden i lysatet blev phosphoryleret in vitro med cyclin A-CDK2 (F80A) og PE-ATP-Kurt-S. proteinblandingen blev efterfølgende fordøjet , og de resulterende peptider blev blandet med Thiopropyl-Sepharose 6b, en aktiveret disulfidharpiks, der fanger både cysteinholdige peptider og thiophosphopeptider gennem en disulfidbyttereaktion. Fordi traditionel dithiothreitol (DTT) eluering frigiver begge typer bundne peptider, anvendte vi de kvalitative forskelle mellem harpiksbundne thiophosphatpeptider og cysteinholdige peptider ved henholdsvis phosphorthiolatsulfidbindingen og alkyldisulfidbindingen. Ved høje pH-værdier hydrolyseres phosphorthiolatsulfidbindingen, og alkyldisulfidet forbliver intakt . Behandling af harpiksen med en stærk base (såsom natriumhydroksid) frigiver specifikt thiophosphopeptider (og omdanner dem også til normale phosphopeptider), men ikke de cysteinholdige peptider ved hydrolysering af phosphorthiolatsulfidbindingen (figur 2b). Fordi peptider bundet via cystein ikke elueres i det sidste trin, kan vi ikke genvinde cysteinholdige thiophosphopeptider. Desuden resulterer elueringen i tab af thiophosphatsignaturen ved at omdanne thiophosphopeptidet til et phosphopeptid. Vores metode til isolering af thiophosphopeptid adskiller sig beskedent fra metoden til isolering af et al. ved at vi fanger thiophosphopeptiderne ved hjælp af disulfidbytningskemi (disulfidharpiks) i stedet for alkylering (iodacetamidharpiks), og vi eluerer dem selektivt med basehydrolyse snarere end iltning.
enkelttrinsrensning af thiophosphopeptider. a) generel ordning for thiophosphospeptidisolering. Proteiner blev mærket med cyclin a-CDK2 (F80A) og PE-ATP-karrus-s og udsat for tryptisk fordøjelse. De resulterende peptider blev blandet med disulfidperler, som fanger både thiophosphopeptider og cysteinholdige peptider. Perlerne blev derefter behandlet med basisk opløsning for selektivt at frigive kun phosphopeptiderne. B) den kemi, der ligger til grund for thiophosphopeptidselektiviteten. Både thiophosphat-og cysteindele indeholder reaktive thiolgrupper, der kan fanges kovalent af disulfidperler. Ved høje pH-værdier hydrolyseres phosphorthiolatsulfidforbindelserne (nær den øverste pil) for at tillade frigivelse af de perlebundne peptider, mens alkyldisulfidforbindelserne (nær den nederste pil) er stabile, og peptider tilbageholdes således på perlerne. Bemærk, at under hydrolysen af phosphorthiolatsulfidbindingen omdannes thiophosphat til normalt phosphat.
for at teste gennemførligheden af denne tilgang phosphorylerede vi GST-Rb med cyclin a-CDK2 (F80A) og PE-ATP-kurs og anvendte vores rensningsprocedure på en trypsin-fordøjelse af reaktionsblandingen. De isolerede peptider blev analyseret ved elektrospray tandem massespektrometri (ESI-MS/MS) under anvendelse af et ionfældemassespektrometer. Peptider blev identificeret ved at matche tandemmassespektre til en human proteinsekvensdatabase (med GST-Rb-sekvens tilføjet) ved hjælp af SEKVESTPROGRAM . GST-Rb-substratet indeholder fem cysteiner såvel som syv SP/TP-steder, som er steder, der foretrækkes til CDK-phosphorylering . Vi genvandt flere phosphopeptider, der kun indeholdt og alle de forventede phosphoryleringssteder (tabel 1). Desuden genvandt vi ingen cysteinholdige peptider og meget få ikke-specifikke peptider. Dette gav et principbevis for vores store analyser.
identifikation af humane cyclin A-CDK2-substrater i cellelysater
vores mål var at identificere potentiel cyclin a-cdk2 substrater i en proteom-bred skala. For at reducere prøvekompleksiteten fraktionerede vi hele cellelysatet af HEK293-celler i 11 fraktioner ved anvendelse af ionbytningskromatografi og ammoniumsulfatudfældning (yderligere datafil 1). Vi udførte derefter in vitro kinaseanalyser på hver fraktion. Som en positiv kontrol tilføjede vi også en lille mængde GST-Rb til hver reaktion. Efter fordøjelse af reaktionsblandingen med trypsin anvendte vi vores oprensningsprotokol for at isolere thiophosphopeptiderne fra peptidblandingerne. De genvundne peptider blev underkastet væskekromatografi-MS / MS-analyse og databasesøgning. Vi genvandt varierende antal peptider og mindst et RB phosphopeptid fra hver af lysatfraktionerne (yderligere datafil 2).CDKs phosphorylatproteiner på en prolin-rettet måde på enten serin eller threonin, og adskillige undersøgelser understøtter ideen om, at motivet S/T-P-R/K repræsenterer CDK-konsensusmotivet. Fra phosphopeptiderne identificerede vi i alt 203 proteiner: 180 kandidater blev phosphoryleret inden for SP-eller TP-motiver (prolin-rettet; yderligere datafil 3). Disse kandidatsubstrater repræsenterer en bred vifte af biologiske processer, herunder cellecykluskontrol, DNA-og RNA-metabolisme, translation og cellulære strukturer (figur 3). I alt 96 ud af 222 (43%) af de prolinstyrede steder var i overensstemmelse med den kendte CDK-konsensus (med en positivt ladet Rest i +3-positionen). Interessant nok indeholdt omkring 24% af de prolinstyrede steder (53/222) en positivt ladet Rest i enten +4 eller +5 positionerne, hvilket antyder, at dette motiv også kan favoriseres af CDK2. Ja, Blethroad et al. bemærkede også, at et betydeligt antal cyclin B-CDK1-substrater indeholder ikke-konsensussteder. 50% af de tilsvarende proteiner bar mindst et k/Rksl-eller K / Rksl-motiv (hvor en stor hydrofob rest og en hvilken som helst aminosyre) distalt til phosphoryleringsstederne, og næsten alle af dem bar mindst et minimalt rksl-motiv (yderligere datafil 3). Dette er i overensstemmelse med den veletablerede ide om, at disse motiver fremmer cyclin a-CDK2 binding til substrater . Ud over at vælge fosforyleringer med CDK-konsensusmotiver identificerede vi 28 proteiner, der tidligere er blevet impliceret som CDK-substrater (markeret med fed skrift i yderligere datafil 3) . Således er næsten 15% af vores kandidater tidligere fundet som CDK-mål, hvilket yderligere understøtter ideen om, at vores metoder blev fanget og beriget til CDK2-substrater. Endelig er 43% af de phosphoryleringer, vi fandt, tidligere blevet identificeret i store in vivo phosphoproteomanalyser, hvilket indikerer, at disse phosphoryleringer ikke er begrænset til vores lysatbetingelser .
klassificering af proteiner efter funktionel kategori. Tal angiver identificerede proteiner i hver kategori.
både vores undersøgelser og dem, der er rapporteret af Blett et al. brugte lignende phosphopeptidisoleringsordninger og relaterede cyclin-CDK ‘ er, og vi forventede, at der kunne være betydelig overlapning i substraterne afsløret af begge undersøgelser. Faktisk fandt vi næsten 50% (30/68) af cyclin B-CDK1-substraterne i vores liste over cyclin A-CDK2-kandidater; disse metoder er således robuste og reproducerbare (yderligere datafil 4). Der er dog også væsentlige forskelle mellem de to lister, og disse skyldes sandsynligvis mange faktorer, herunder proceduremæssige forskelle, forskellige celletyper, ufuldstændig peptididentifikation ved MS og substratspecificitet tildelt af cyclin-og/eller kinase-underenhederne. Nogle af disse forskelle kan også afspejle de forskellige biologiske funktioner af cyclin a-CDK2 og cyclin B-CDK1. For eksempel fandt vi ni proteiner involveret i proteinoversættelse og/eller ribosomfunktion, men ingen af disse proteiner blev fundet med cyclin B-CDK1 på trods af deres relativt høje overflod.
selvom vi identificerede et antal kendte CDK2-substrater, identificerede vi ikke nogle tidligere beskrevne CDK2-substrater. Nogle af de faktorer, der er anført ovenfor, kan også redegøre for manglen på at finde kendte CDK2-substrater i vores analyser. Derudover ville substrater, der allerede er phosphoryleret af endogene CDK ‘ er, ikke have været thiophosphoryleret in vitro. Det er også muligt, at nogle proteiner ikke blev opløst under lysatpræparatet og/eller sonikeringstrinnet og udelukket fra vores analyser. Endelig er det muligt, at store proteinkomplekser kan være blevet forstyrret af fraktioneringsprocedurerne før kinasereaktionen, og at proteiner, der kun phosphoryleres af CDK2 i sammenhæng med disse komplekser, muligvis ikke opdages ved vores metoder.
Vi gendannede også fire phosphopeptider svarende til cyclin A og CDK2 og 27 yderligere phosphopeptider med ikke-prolinstyrede steder (yderligere datafil 5). Vi mistænkte, at disse phosphopeptider skyldtes auto-phosphorylering af cyclin A-CDK2 og baggrundsfosforylering af andre kinaser, og andre har rapporteret lignende baggrundsfosforylering . For at teste disse muligheder udførte vi en kontrolkinasereaktion ved hjælp af cyclin A-CDK2 (F80A) og PE-ATP-Kurt-s uden cellelysat tilsat og genvundet tre af de fire cyclin a-CDK2-peptider (yderligere datafil 5). Desuden, når vi udførte en lignende ‘kinase-only’ reaktion i nærvær af kurr-32P-ATP, observerede vi 32P inkorporering i begge disse proteiner på en dosisafhængig måde (yderligere datafil 6). Disse eksperimenter bekræftede, at der var Baggrund auto-phosphorylering af cyclin A-CDK2 i de originale analyser.
Vi udførte også kontrolkinasereaktioner ved hjælp af lysatfraktionerne, GST-Rb ‘spike-in’ og PE-ATP-Kurt-s uden tilsætning af cyclin a-CDK2. Disse’ no-kinase ‘ kontrolreaktioner phosphorylerede 7 af de 27 ikke-prolinstyrede phosphopeptider på vores liste (yderligere datafil 5), hvilket antyder, at de fleste, hvis ikke alle, af disse phosphopeptider skyldtes baggrundsfosforylering af kinaser, der er i stand til at bruge ATP-analogen i begrænset omfang. For eksempel indeholder de fleste af disse peptider sure reststyrede phosphoryleringssteder, der er kasein kinase 2-motiver. Kasein kinase 2 er unik, fordi den kan udnytte GTP såvel som ATP; således kan det aktive sted rumme de voluminøse ATP-analoger, såsom PE-ATP . Det er vigtigt, at vi ikke genvandt nogen Rb-phosphopeptider fra disse kontroleksperimenter, hvilket indikerer, at der ikke var nogen ikke-specifik CDK-aktivitet i vores analyser. Vi genvandt også 44 umodificerede peptider, hvoraf 12 indeholdt cysteinrester. Størstedelen af disse peptider stammer fra flere lysatfraktioner (yderligere datafil 2). Vi formoder, at disse skyldtes lavt niveau ikke-specifik binding af peptider til harpiksen på trods af strenge vaskebetingelser, og i tilfælde af de cysteinholdige peptider, fra en lille mængde hydrolyse af alkyldisulfidbindingen under elueringstrinnet. Sammenfattende var vores metoder meget selektive, og vores undersøgelser identificerede en overraskende stor gruppe kandidatcyclin A-CDK2-substrater, hvoraf de fleste ikke tidligere er blevet identificeret som CDK-mål.
validering af kandidatsubstrater som cyclin a-CDK2-mål
vi anvendte flere strategier til at validere nogle af de nye kandidater på vores liste som cyclin a-CDK2-substrater. Fordi vores proteinidentifikationer var baseret på peptidsekvenser, begyndte vi med at bekræfte, at cyclin a-CDK2 phosphorylerede tre fulde længde og indfødte kandidater, der blev immunopræcipiteret via epitop tags fra transficerede 293 celler (EF2, TRF2 og RAP1). Fordi disse proteiner ikke var til stede på cyclin B-CDK1-listen , bestemte vi, om de også phosphoryleres af cyclin B-CDK1. Hver CDK2-kandidat blev phosphoryleret af både cyclin A-CDK2 og cyclin B-CDK1, skønt EF2 blev phosphoryleret i mindre grad end enten TRF2 eller RAP1 (figur 4a). Vi udtrykte også TRF2, RAP1 og ribosomalproteinet RL12 som GST-fusioner og rensede dem fra Escherichia coli. Da vi brugte cyclin a-CDK2 til phosphorylere TRF2 og RAP1 in vitro, var proteinerne stærkt phosphorylerede, og MS-analyser afslørede, at disse phosphoryleringer forekom på de samme steder, som vi oprindeligt identificerede (figur 4b). Vi brugte også cyclin A-CDK2 og cyclin B-CDK1 til at phosphorylere GST-RL12 og fandt ud af, at begge CDK ‘ er også phosphorylerede RL12 in vitro (figur 4c). Disse undersøgelser bekræfter således, at peptiderne identificeret i vores skærm repræsenterer proteiner, der kan phosphoryleres af cyclin a-CDK2, i det mindste in vitro. Selvom vi fandt kvalitative forskelle i cyclin A-CDK2 og cyclin B-CDK1 ‘s evne til at phosphorylere specifikke proteiner, blev kandidaterne i hvert tilfælde phosphoryleret af begge CDK’ er. Fordi det anvendte præparat indeholdt et overskud af fri CDK2 (F80A), overvejede vi muligheden for, at nogle substratphosphoryleringer kunne skyldes associering af endogene cycliner med CDK2 (F80A), der enten var monomer, eller som kan have dissocieret fra cyclin A under analysebetingelserne. Vi fandt ud af, at mængden af cyclin B-CDK2 (F80A) aktivitet i disse ekstrakter var ubetydelig sammenlignet med cyclin A-CDK2 (F80A), og vi kunne ikke registrere nogen cyclin E-CDK2 (F80A) aktivitet (yderligere datafil 7). Ikke desto mindre kan vi ikke udelukke muligheden for, at nogle peptider kan være phosphoryleret af CDK2 (F80A) i kompleks med en endogen cyclin, og specificiteten af ethvert kandidatsubstrat for cyclin a versus andre cykliner, der aktiverer CDK2, skal valideres som beskrevet nedenfor.
in vitro validering af selektive kandidat CDK2-substrater. (a) HEK293-celler blev transient transficeret med vektorer, der udtrykte FLAG-mærket EF2, TRF2 og RAP1. Anti-FLAG antistofimmunopræcipitater blev in vitro phosphoryleret med cyclin A-CDK2 eller cyclin B-CDK1 i nærvær af kurr-32P-ATP (øverste venstre panel). I parallelle reaktioner blev histon H1 phosphoryleret som en kontrol for at normalisere aktiviteterne i cyclin a-CDK2 og cyclin B-CDK1 (højre panel). ‘C ‘betegner’ kun kinase ‘ – reaktioner uden transficerede substrater (venstre panel) og ‘ingen kinase’ – reaktion (højre panel). Proteinprøver blev adskilt af SDS-side, og gelerne blev overført til PVDF-membraner. Fosfosignaler blev visualiseret ved autoradiografi. Membranen blev efterfølgende undersøgt med anti-FLAG antistof (Sigma-Aldrich) for at bekræfte identiteten af phosphosignalbærebåndet (nederste venstre paneler). Stjernen repræsenterer et ikke-specifikt bånd fra det kommercielle cyclin B-CDK2-præparat. (B) Kinasereaktion blev udført under anvendelse af Kurt-32P-ATP og GST-TRF2, GST-RAP1, GST-Rb (positiv kontrol) og GST (negativ kontrol) som substrater i nærvær eller fravær af vildtype cyclin a-CDK2-kinase. Reaktioner blev visualiseret af SDS side efterfulgt af coomassie farvning og autoradiografi (venstre panel). En lignende kinaseanalyse blev udført under anvendelse af vildtype cyclin a / CDK2 og ATP-kurs-s og efterfølgende underkastet et phosphopeptidisoleringsskema. MS-analyse bekræftede, at TRF2 og RAP1 hver især blev phosphoryleret på de nøjagtige steder, vi identificerede fra skærmen med et ekstra sted til RAP1 (højre panel). (C) Kinaseanalyse blev udført under anvendelse af Kurt-32P-ATP, cyclin A-CDK2 eller cyclin B-CDK1 med stigende mængder oprenset GST-RL12. Prøver blev adskilt af SDS-side, og gelen blev farvet med Coomassie (nederste panel) efterfulgt af autoradiografi (øverste panel). ‘C ‘betegner’ kun kinase ‘ – reaktioner uden transficerede substrater.
validering af RL12 som et in vivoCDK2-substrat
ovenstående undersøgelser validerede flere nye kandidater identificeret på vores skærm som CDK2-substrater in vitro. For at bestemme, om et nyt substrat også phosphoryleres af CDK2 in vivo, udførte vi en mere omfattende analyse af det ribosomale protein RL12. Vi blandede først immunopræcipitater af epitop-mærket cyclin A-CDK2 og RL12 udtrykt i humane celler i nærvær af Kurt-32P-ATP og fandt, at cyclin a-CDK2 phosphoryleret RL12 in vitro (figur 5a). Fosforyleringen blev stort set afskaffet i en mutant RL12, hvor den identificerede phosphoserin S38 blev erstattet med en alanin, og den blev gendannet, da S38 blev erstattet med en threonin (figur 5b). Vi brugte derefter phosphopeptidkortlægning til at identificere peptidet indeholdende S38 og bekræftede, at det var direkte phosphoryleret af CDK2 in vitro (figur 5c). For at teste, om RL12 også phosphoryleres in vivo på en CDK2-afhængig måde på det samme sted, mærkede vi metabolisk celler med 32P-orthophosphat og immunopræcipiteret vildtype eller RL12-s38a fra celler, der overudtrykker enten cyclin E-CDK2, katalytisk inaktiv cyclin E-CDK2 eller CDK-hæmmeren p21 (for at hæmme endogene CDK ‘ er) . Fordi vi ikke kan studere endogen rl12-phosphorylering på grund af manglen på et egnet anti-RL12 – antistof, undersøgte disse undersøgelser phosphoryleringen af ektopisk RL12 in vivo (disse transfektionsbetingelser førte til en ca.fem til ti gange overekspression af RL12 mRNA (yderligere datafil 8). Vi fandt, at vildtype RL12, men ikke RL12-S38A, blev phosphoryleret in vivo (figur 5d). Denne phosphorylering blev forbedret i celler, der overudtrykker cyclin E-CDK2, men ikke inaktiv cyclin E-CDK2, og blev formindsket i celler, der overudtrykker p21 CDK-hæmmeren (som hæmmer endogene cyclin-CDK ‘ er; Figur 5d). Endelig brugte vi phosphopeptidkortlægning og phosphoaminosyreanalyser af rl12-protein immunopræcipiteret fra de mærkede celler og bekræftede, at rl12-phosphorylering af cyclin E-CDK2 in vivo også forekom på S38 (figur 5e). Rl12 S38 phosphorylering in vivo er også rapporteret i phosphoproteomstudier .
phosphorylering af RL12 in vitro og in vivo. (a) HA-mærket RL12 eller vektorkontrol (‘vec’) blev transient transficeret til U2OS-celler og immunopræcipiteret under anvendelse af 12ca5-antistof. Cyclin a-CDK2-komplekser blev også transient udtrykt separat i U2OS-celler og immunopræcipiteret under anvendelse af et antistof mod cyclin A. Kinaseanalyser blev udført under anvendelse af rl12 (eller kontrol) immunopræcipitat med eller uden cyclin a-CDK2-immunopræcipitat i nærvær af kurr-32P-ATP. B) lignende analyser blev udført under anvendelse af cyclin a-CDK2-og rl12-immunopræcipitater indeholdende vildtype og de angivne rl12-phosphositmutanter. Stjernen betegner antistoffets lette kæde. C) Phosphopeptidkortlægning og phosphoaminosyreanalyse af den radioaktivt mærkede vildtype (venstre panel) og s38t-mutant (højre panel) i RL12. (D) vildtype RL12, RL12-S38A eller vektorkontrol blev forbigående Co-transficeret med cyclin E-CDK2, katalytisk inaktiv (dn) cyclin E-CDK2 eller p21. Alle celler blev udsat for 32P orthophosphatmærkning. RL12 blev immunopræcipiteret fra cellelysater og visualiseret af SDS side efterfulgt af autoradiografi. e) Phosphopeptidkortlægningsanalyse blev også udført på den radiomærkede RL12 vist i litra d). Den nederste pil viser et andet og mindre phosphoryleringssted detekteret in vivo.
selvom vi har valideret hver af de nye kandidater, som vi hidtil har testet ved at vise, at proteinerne i fuld længde phosphoryleres af CDK2, vil nogle kandidater på vores liste sandsynligvis vise sig ikke at være fysiologisk relevante cyclin A-CDK2-substrater. For eksempel blev kinasereaktionerne udført i lysater, og in vivo subcellulær rumdeling kan begrænse adgangen til CDK2 til nogle kandidater. Desuden er det muligt, at andre cellulære kinaser enten er overflødige med eller vigtigere end CDK2 med hensyn til individuelle substrater in vivo. Det er således kritisk, at kandidater vurderes nøje i en så fysiologisk sammenhæng som muligt. Til dette formål bruger vi i igangværende undersøgelser en genmålretningsmetode til at mutere en delmængde af disse phosphoryleringssteder i de endogene gener for at studere deres fysiologiske betydning.
