Svampevært
filamentøse svampe kan tjene som værter for en mikrobiel carminsyrecellefabrik, da de har kapacitet til at levere en rigelig forsyning af acetyl-CoA og malonyl-CoA byggesten til syntese af polyketide stillads. De tilbyder også den nødvendige cellulære infrastruktur til at rumme er-membranbundet C-glucosyltransferase UGT28. Da A. nidulans besidder en veludviklet genteknologisk værktøjskasse, valgte vi denne art som udgangspunkt for udviklingen af en svampecarminsyrecellefabrik. Som de fleste filamentøse svampe er A. nidulans i stand til at producere en overflod af biosyntetisk forskellige sekundære metabolitter, herunder et betydeligt antal aromatiske polyketider. Chiang et al. har tidligere vist, at deletion af de genklynger, der er ansvarlige for dannelsen af de vigtigste endogene PKS-produkter i A. nidulans11, forbedrede potentialet for A. nidulans som en cellefabrik til heterolog produktion af polyketider. På denne måde øges puljerne af acetyl-CoA og malonyl-CoA byggesten, og de efterfølgende kemiske analyser til dannelse af nye produkter forenkles. Som et første skridt mod en svampecellefabrik til carminsyreproduktion eliminerede vi derfor de biosyntetiske veje for de dominerende aromatiske polyketider, der potentielt kunne forstyrre carminsyreproduktionen og komplicere analysen og nedstrøms oprensning. Specifikt blev genklyngerne til produktion af asperthecin, monodictyphenon og sterigmatocystin elimineret såvel som de gener, der var ansvarlige for dannelse af grøn conidia pigment, VA og yA, blev elimineret i en ikke-homolog endjoining deficient A. nidulans baggrund. Udover den forventede mangel på konidiale pigmenter viste den resulterende stamme, NID2252, ingen synlige effekter på morfologi og fitness (supplerende fil, Fig. 1). Vi brugte derfor NID2252 som referencestamme og som grundlag for opførelsen af en svampecellefabrik til produktion af carminsyre.
Design af en semi-naturlig vej til dannelse af flavokermesinsyre anthron
den største vejspærring til opførelse af en mikrobiel carminsyrecellefabrik var mangel på en naturlig PKS, der syntetiserer flavokermesinsyre anthron, det første formodede mellemprodukt i vejen. For at omgå denne begrænsning forfulgte vi en alternativ biosyntetisk rute til produktion af dette polyketid. Octaketide flavokermesinsyre anthron, med sin C7-C12, C5-C14 og C2-C15 cykliseringsmønster, kunne i teorien dannes i et enkelt trin af en svampe ikke-reducerende type i iterativ PKS, der besidder et passende produktskabelondomæne (Fig. 1 venstre). Imidlertid er der endnu ikke beskrevet sådanne tegn i litteraturen. En alternativ mekanisme til dannelse af flavokermesinsyre-anthronen er via en totrinsreaktion, hvor en PKS syntetiserer en ikke-reduceret lineær octaketide-kæde, som efterfølgende cykliseres i den ønskede struktur af transvirkende cyclaser/aromataser (Fig. 1 højre). Reaktioner af denne type findes i naturen i f.eks. actinorhodin (Act) vej i Streptomyces coelicolor12. I dette tilfælde syntetiseres octaketide-rygraden ved hjælp af et multi-underenhedsbakterietype II PKS-system, KSa, KS Kurt og ACP (act minimal PKS), som reduceres med actKR i position C9 og derefter foldes af aromatase/cyclase, actARO/CYC og cyclase actCYC2, for at give den tricykliske forbindelse 3,8-dihydroksy-1-methylanthrakinon-2-carboksysyre (DMAC)7. DMAC viser den samme fold som flavokermesinsyre anthron, men reduceres ved C9-positionen.
af særlig interesse for den foreliggende undersøgelse er den cyclase og aromatase fra Streptomyces sp. R1128, som katalyserer to sekventielle cykliseringsreaktioner af ikke-reducerede lineære polyketider i folder svarende til flavokermesinsyre en trone13. Specielt er Cyclasen ansvarlig for at lukke den første ring, C7-C12, og Aromatasen til lukning af den anden ring, C5-C14. Den tredje ring, C2-C15, dannes spontant. Tidligere har Jysk og Jysk været co-udtrykt i S. coelicolor med octaketiddannende type II virker minimal PKS, hvilket resulterer i dannelsen af flavokermesinsyre, kendt som 3,6,8-trihydroksy-1-methylanthrakinon-2-carboksyl syre (TMAC) i bakterielitteraturen14. Desværre kan en identisk strategi være vanskelig at implementere i A. nidulans, da Type II minimal PKSs ikke er blevet implementeret med succes i heterologe værter uden for Streptomyces-slægten på trods af flere forsøg15. Og faktisk viste vores forsøg på at rekonstituere act miniPKS i A. nidulans og Saccharomyces cerevisiae ligeledes mislykket (data ikke vist). En alternativ måde at danne det krævede ikke-reducerede octaketide på er at stole på type III PKS, som med succes er udtrykt i gær, f.eks. i forbindelse med flavonoid biosyntese16. Af særlig interesse er Aloe arborescens octaketide-syntase (OKS), som er blevet beskrevet for at producere ikke-reducerede octaketider, der spontant foldes ind i SEK4 og SEK4b i vitro17 (Fig. 2a). I Aspergillus forblev det imidlertid uprøvet, om produkterne af type III PKSs, som er AVS-uafhængige stoffer, der frigiver carboksyl syrer, kan foldes af den type cyclase, der er beskrevet for at virke på ACP-bundne substrater. I den aktuelle undersøgelse satte vi os derfor for at teste kompatibiliteten af plantetype III OK ‘ er med cyclaser/aromataser fra bakterielle type II PKS-systemer med det formål at udvikle en kunstig de novo biosyntetisk vej til dannelse af flavokermesinsyre anthronprecursor til dannelse af carminsyre.
dannelse af det ikke-reducerede octaketide. (a) spontan foldning af ikke-reducerede octaketider. (B) fænotype af Aspergillus nidulans NID2252 referencestamme og stammer, der udtrykker OK ‘ er enten med indfødt eller optimeret kodonbrug. (C) metabolisk profil af A. nidulans NID2252 referencestamme og Ok ‘ er, der udtrykker stammer. Basepunktchromatogram (lysegråt) med angivelse af udvalgte metabolitter: SEK4 (blå), dehydro-SEK4 (Mørkeblå), SEK4b (lilla), dehydro-SEK4b (mørk lilla), mutactin (orange) og flavokermesinsyre (kalk).
produktion af polyketide-prækursorer til carminsyreproduktion i A. nidulans
for at teste OK ‘ernes in vivo-ydeevne i en svampevært indsatte vi OK’ er kontrolleret af A. nidulans gpdA-promotoren som en enkelt kopi til et defineret locus (integrationssted 5, IS5) i A. nidulans genome18. To stammer blev konstrueret, en udtrykker den native OKS-kodningssekvens og en udtrykker en kodonoptimeret version til udtryk i A. nidulans. Efter syv dages inkubation på faste vækstmedier, se afsnittet metoder for detaljer, begge stammer viste en stærk rødbrun farve af myceliet (Fig. 2b). Metabolisk profilering ved HPLC-HRMS af stammerne afslørede ikke spor af et ikke-reduceret octaketid, men snarere den forventede SEK4 og SEK4b sammen med flavokermesinsyre og tre andre rigelige forbindelser med ukendt identitet (Fig. 2c), som ikke var til stede i NID2252 referencestammen. SEK4 og SEK4b blev identificeret på baggrund af grundig HPLC-HRMS/MS-analyse (supplerende fil, Fig. 2) og var i overensstemmelse med tidligere rapporterede værdier19, mens flavokermesinsyre blev sammenlignet med en autentisk reference isoleret fra D. coccus9 (supplerende fil, Fig. 3). Metabolitten eluerer ved 13,0 min. havde en pseudomolekylær ion + på 303.0867, svarende til en molekylformel af C16H14O6, i overensstemmelse med det kendte octaketide shunt-produkt, mutactin, tidligere beskrevet i Streptomyces-baserede eksperimenter med Act-genklyngen7. Denne identifikation blev bekræftet gennem detaljeret analyse af UV-spektret og understøttet af retentionstiden i forhold til SEK4 og SEK4b (supplerende fil, Fig. 4). De to yderligere metabolitter med molekylære formler af C16H12O6 (− m/å 299,0566) indikerede octaketide-produkter, men svarede imidlertid ikke til et fælles shuntprodukt (supplerende fil, Fig. 5). Derfor blev metabolitterne isoleret, og strukturbelysning baseret på 1D-og 2D NMR-eksperimenter identificerede dem som dehydro-SEK4 (også kendt som B26 i bakterielitteraturen) og dehydro-SEK4b20 (supplerende fil, Fig 6-11). Dannelse af de seks nye polyketider, der er observeret i OKS-stammen, kan forklares ved tre forskellige spontane første ringlukningsreaktioner: C7-C12 (SEK4, dehydro-SEK4 og flavokermesinsyre), C10-C15 (SEK4b og dehydro-SEK4b) og C7-C12 efter C9 ketonreduktion (mutactin) (Fig. 2a og supplerende fil, Fig. 12). Af disse muliggør kun den første ringlukningstype (C7-C12) den efterfølgende dannelse af den ønskede flavokermesinsyre anthron via en anden C5-C14 og tredje C2-C15 ringlukning. SEK4 og SEK4b er tidligere rapporteret at dehydrere spontant til dannelse af henholdsvis dehydro-SEK4 og dehydro-SEK4b, mens dannelse af mutactin afhænger af reduktion af polyketidkædens C9-position før foldning21. Dannelsen af flavokermesinsyre, et kendt mellemprodukt i carminsyrevejen (Fig. 1), var uventet, da denne metabolit ikke er rapporteret at dannes spontant fra ikke-reducerede octaketide-kæder. Dette antyder, at A. nidulans naturligt producerer et antal cyclaser/aromataser, der fremmer det ønskede foldemønster. Metabolitprofileringen af de to Ok ‘er, der udtrykker stammer, viste ingen væsentlige forskelle i produktionsniveauer, og vi besluttede at fokusere på stammen, der udtrykker den oprindelige version af OK’ er som grundlag for yderligere udvikling af en svampecellefabrik til carminsyreproduktion.
konstruktion af foldningsvejen for ikke-reducerede octaketider
den promiskuøse foldning af det ikke-reducerede octaketid reducerer udbyttet af ønskelig flavokermesinsyre. Vi forestillede os derfor, at produktionen af flavokermesinsyre kunne øges ved at strømline foldeprocessen i den ønskede retning ved at udtrykke kodonoptimerede versioner af Jui og juj. For at undersøge, om Ju og Ju interfererer med den native metabolisme af A. nidulans, konstruerede vi først stammer, der udtrykker Ju og Ju individuelt og i kombination fra definerede genomiske loci (IS6 og IS7) i A. nidulans NID2252 reference stamme. Metabolisk profilering ved HPLC-HRMS af de tre stammer afslørede ingen påviselige metaboliske forskelle (Fig. 3b). Vi konstruerede derefter en stamme, der co-udtrykker OK ‘ er med Jui, som koder for cyclaserne, der katalyserer dannelsen af C7-C12 første ringlukning (Fig. 3a). Sammenlignet med stammen, der kun udtrykte OK ‘ er, viste denne stamme henholdsvis 2,5 -, 2,2-og 2,1 gange stigninger i flavokermesinsyre -, SEK4-og dehydro-SEK4-niveauer. Disse metaboliske ændringer blev ledsaget af reducerede niveauer af metabolitter indeholdende de uønskede første ringfoldninger (Fig. 3b og tabel 1). En stamme, der co-udtrykker OK ‘ er og Huj, som koder for aromataser, der katalyserer C5-C14 anden ringlukning (Fig. 3A), producerede en 2,7 gange stigning i flavokermesinsyre niveauer. Denne stigning blev ledsaget af en reduktion i niveauerne af metabolitter med en C7-C12 første ringfold (SEK4 og dehydro-SEK4), mens niveauet af metabolitter med den uønskede C10-C15 første ringfold (SEK4b og dehydro-SEK4b) som forventet ikke blev påvirket (Fig. 3b og tabel 1). Endelig viste analysen af stammen, der udtrykte Jui, Ju og Ok ‘er, en 4,1 gange stigning i produktionen af flavokermesinsyre sammenlignet med når OK’ er blev udtrykt alene. Desuden er denne stigning 60% højere end hvad der blev observeret med stammerne, der udtrykker OK ‘ er i kombination med henholdsvis Jui eller Jui (tabel 1). Dette resultat indikerer, at cyclase og aromatase på en additiv måde er i stand til at øge strømmen i den kunstige de novo-vej mod det ønskede produkt, flavokermesinsyre (Fig. 3b).
styring af foldning af octaketide-rygraden. a) biosyntetiske trin fra ikke-reduceret octaketid til flavokermesinsyre anthron. (B) målrettet kemisk analyse af Aspergillus nidulans NID2252 referencestammer (stamme med slettede PKS-klynger) og NID2252, der udtrykker Jui, eller Jui, eller OKS, eller OKS + Jui, eller OKS + Jui og OKS + Jui + Jui. Base peak chromatogram (lysegrå) med angivelse af udvalgte metabolitter: SEK4 (blå), dehydro-SEK4 (Mørkeblå), SEK4b (lilla), dehydro-SEK4b (mørk lilla), mutactin, (orange) og flavokermesinsyre (kalk). (C) Kolonimorfologi af stammer, der formeres i syv dage på minimalt medium.
overraskende og meget opmuntrende, yderligere metabolisk analyse af stammen, der co-udtrykker OKS, Jui og Jhuj afslørede, at den øgede dannelse af flavokermesinsyre blev ledsaget af produktionen af kermesinsyre (Fig. 4). Derfor A. nidulans tilvejebringer den nødvendige monoksygenase til omdannelse af flavokermesinsyre til kermesinsyre, som kan tjene som det endelige mellemprodukt i carminsyrevejen (Fig. 1).
Oksidative trin involveret i dannelsen af kermesinsyre. a) Iltningstrin fra flavokermesinsyre anthron til kermesinsyre. B) målrettet metabolisk analyse til fremstilling af flavokermesinsyre (FK) og kermesinsyre (KA) i NID2252-referencestammen (stamme med slettede PKS-klynger), OK ‘ er, der udtrykker stamme, og OKS + Jui + juj-stammen. Kromatogrammet viser basetoppchromatogrammet (lysegråt) med angivelse af flavokermesinsyre (kalk) og kermesinsyre (blå).
produktion af carminsyre i A. nidulans
det sidste trin i carminsyredannelse involverer C-glucosylering af kermesinsyre (Fig. 5a). Den ansvarlige for dette trin i carmininsyre biosyntetiske vej er tidligere blevet identificeret i D. coccus og karakteriseret ved heterolog ekspression i S. cerevisiae8. Vi indsatte derfor UGT2-kodningsgenet, optimeret til ekspression i A. nidulans, ind i IS4-locus af NID2252-referencestammen og for at fuldføre den semi-naturlige carminsyre biosyntetiske vej i A. nidulans, ind i det samme locus i stammen, der co-udtrykker Jui, Jui og OKS. Ekspression af UGT2 alene i referencestammen påvirkede ikke udseendet af vækstmediumfarven eller den metaboliske profil af A. nidulans sammenlignet med NID2252 referencestammen (Fig. 5b, c). I modsætning hertil gav Co-ekspression af OK ‘ er, Ju, Ju og UGT2 anledning til en rød farve af mediet, hvilket antyder, at der blev dannet et mere vandopløseligt farvestof(er) (Fig. 5b). Målrettet LC-HRMS-analyse af denne stamme bekræftede dannelsen af carminsyre22 (supplerende fil, Fig. 13) sammen med dcII9,23 og en dcII-isomer (supplerende fil, Fig. 14), der viser, at UGT2 var funktionel i A. nidulans og kunne med succes fuldføre den biosyntetiske vej (Fig. 5c). Positiv identifikation af carminsyre og dcII var baseret på lignende retentionstider, UV-spektre, MS og MS/MS fragmenteringsmønstre for rene standarder for de to forbindelser. Tre isomerer af carmininsyre er blevet beskrevet i litteraturen (carmininsyre, DCIV og DCVII) af Stathopoulou et al.23 viser alle tre forskellige retentionstider i LC-MS/MS-baseret analyse. I vores Analyse opdagede vi kun carminsyre og ikke DCIV og DCVII baseret på retentionstid og fragmenteringsmønster af autentisk carminsyrestandard isoleret fra D. coccus (supplerende fil, Fig. 13). Sammen viser vores data fast, at det er muligt at producere carmininsyre i A. nidulans baseret på en semi-naturlig vej.
Glucosyleringstrin til dannelse af carminsyre. a) DACTYLOPIUS coccus glucosyltransferase UGT2 accepterer både kermesinsyre og flavokermesinsyre som substrater, hvilket resulterer i dannelse af henholdsvis carminsyre og dcii. (B) den fænotypiske virkning af at udtrykke UGT2 alene og i kombination med de syntetiske PKS i NID2252 Aspergillus nidulans baggrund, billeder taget efter syv dages inkubation. C) målrettet metabolisk analyse til fremstilling af glucosylerede forbindelser, f.eks. carminsyre (rød) og dcii (orange) overlejret basispunktchromatogram (lysegrå).
