når det kommer til opløseliggørelse og denaturering af proteiner inden isoelektrisk fokusering og 2-D gelelektroforese, vælger de fleste forskere urinstof. Dette er ikke overraskende, da dette milde kaotrope middel fuldstændigt kan forstyrre interaktionerne mellem proteinmolekyler og øge effektiviteten af proteaseaktivitet i proteinfordøjelse, mens det effektivt forhindrer proteiner i at aggregere og/eller udfælde. Derudover anvendes urinstof også til renaturering af proteiner fra tidligere denaturerede prøver.

På trods af sin popularitet som et effektivt proteindenatureringsmiddel kommer brug af urinstofopløsning til fordøjelse af proteiner med en særlig udfordring – det øger risikoen for carbamylering. Hvorfor skulle dette vedrøre dig? Her er nogle grunde til, at carbamylering kan være skadelig for dit eksperiment, og hvorfor det bør undgås for enhver pris.

1. bortset fra at blokere de N-terminale ender af proteinmolekyler interfererer carbamylering med proteinkarakterisering og gør dem utilgængelige til videre brug.det angriber aggressivt sidekæderne af arginin og lysinrester og gør proteinet uegnet til fordøjelse.det hæmmer fordøjelsen af proteiner og påvirker identifikationen og kvantificeringen af proteiner negativt i MS-analysen.
2. det forvirrer resultaterne opnået fra peptider med uventede retentionstider og øger prøvekompleksiteten.
3. det reducerer ioniseringseffektiviteten og påvirker signalintensiteten af detekterede toppe negativt.
4. det inducerer en ændring i det isoelektriske punkt af proteiner og fører til artefaktuelle resultater.
5. det kan påvirke resultaterne af in vivo carbamyleringsundersøgelser.

Hvad forårsager Carbamylering?

per definition henviser carbamylering til den post-translationelle modifikation, der ændrer proteins strukturelle og funktionelle egenskaber. Dette skyldes den ikke-ensymatiske reaktion mellem isocyansyre og de frie aminogrupper.

i vandige opløsninger findes urinstof i ligevægt med ammoniumcyanat. Det er vigtigt at bemærke, at (1) urinstof i opløsning dissocierer spontant producerende cyanat-og ammoniumioner, (2) det nedbrydes til isocyansyre (CNOH), den form, der aktivt reagerer med proteinaminogrupper og inducerer carbamylering, og (3) den hastighed, hvormed urinstof dissocieres, og omfanget af carbamylering afhænger af temperatur, pH og inkubationstid.

forebyggelse af Carbamylering: nogle nyttige Tips til at overveje

intet kan ændre det faktum, at urinstof i nærvær af varme og proteiner altid vil føre til carbamylering. Du kan bruge den højeste kvalitet urinstof til rådighed og stadig risikere carbamylering.

heldigvis er der flere måder at beskytte peptider mod carbamylering. Her er nogle effektive strategier, der kan bruges til at nå dette mål.

• Brug altid frisklavede urinstofbaserede reagenser, når du udfører proteomiske procedurer. Brug tør urea-baserede forblandede og brugsklare buffere af høj kvalitet fra troværdige kilder, og vær meget forsigtig med at forberede dine prøver. Bemærk: Opbevar fast materiale ved stuetemperatur, og hold håndteringen på et minimum.
• Fjern urinstof fra proteinprøven før fordøjelsen ved at anvende dialyse og/eller hurtig omvendt fasekromatografi eller ved hjælp af spin-søjler.
• hold prøven ved en relativt lav temperatur for at reducere den hastighed, hvormed urinstof nedbrydes. Undgå opvarmning af urinstofholdige buffere over 37oC for at reducere risikoen for carbamylering.
• deioniserer urinstofopløsningen ved hjælp af en ionbytterharpiks for at reducere cyanatkoncentrationen.
• Forsur urinstofopløsning (100 mM HCI) for at hindre dannelsen af isocyansyre.
• brug reagenser såsom ethanolamin, ethylendiamin, methylamin og Tris-HCl for at minimere protein/peptidcarbamylering. Disse reagenser hjælper ved at fjerne cyanatmolekyler og derved gøre dem utilgængelige for peptider.

ganske vist har disse strategier deres egne ulemper (dvs. fældning af let denaturerede proteiner og kan være uegnet til adskillige fordøjelsesteknikker), men da fordøjelser udføres ved forhøjede temperaturer over en lang periode, har du intet andet valg end at fjerne urinstof fra fordøjelsesblandingen. Ellers risikerer du altid carbamylering. Det er en risiko, du ikke ønsker at tage.