abstrakt
eksisterende kemotaksiassays genererer ikke stabile kemotaktiske gradienter og måler således—over tid—funktionelt kun uspecifik tilfældig bevægelse (kemokinesis). Til sammenligning har mikrofluidteknologi kapacitet til at generere et tæt kontrolleret mikromiljø, der kan opretholdes stabilt i længere perioder og derfor kan tilpasses til analyse af kemotaksi. Vi beskriver her en ny mikrofluidisk enhed til følsom analyse af cellulær migration og viser dens anvendelse til evaluering af kemotaksen af glatte muskelceller i en kemokingradient.
1. Introduktion
rettet cellemigration spiller en kritisk rolle i inflammatoriske lidelser, vaskulær sygdom, sårheling og tumormetastase . En række in vitro-tilgange er blevet udviklet til at kvantificere cellemigration, herunder lukning af monolagssår (“scratch assay”) og Boyden-kammeret . Imidlertid er disse nuværende metoder relativt ufølsomme. Desuden kan sådanne tilgange faktisk kun måle kemokinesis, det vil sige øget tilfældig bevægelse snarere end kemotaksrettet cellemigration.
faktisk er brugen af scratch assay og Boyden chamber transvells begrænset af deres metodologiske design.
til ridseanalysen foretages et defineret” sår ” (ridse) i et sammenflydende cellemonolag; celler ved kanterne af defekten udfylder derefter gradvis tomrummet, og tiden til gendannet sammenløb kvantificeres. Hurtigere reparation af ridsen er blevet fortolket for at afspejle forbedret “kemotakse” på grund af cellemanipulation eller arten af opløselige midler tilsat til mediet. Mens eksperimentet er konceptuelt ligetil og teknisk let at udføre, bades cellerne i en ensartet koncentration af middel, og der er ingen kemoattraktantkoncentrationsgradient under hele eksperimentet; bevægelsen, der udfylder hullet, repræsenterer derfor kun en “tilfældig gåtur.”Således er” migrationen ” i et ridseassay stort set en funktion af kun øget kemokinesis. Som typisk udført-især over flere timer med en langvarig analyse-inkluderer lukningen af et rids “sår” sandsynligvis også en væsentlig komponent i celleproliferation.
den anden mest almindelige metode til måling af “kemotakse” involverer brugen af Boyden-kammertransveller. Forskellige koncentrationer af specifikke kemokiner placeres i enhedens nedre rum, mens cellerne, der skal evalueres, inkuberes i den øverste indsats; en mikroporøs membran adskiller de to kamre og danner en understøtning for cellevækst og en delvis barriere for migration. Celler, der tælles ved membranens nedre flade, eller som akkumuleres i det nedre kammer, vurderes typisk ved et enkelt fast slutpunkt. Denne analyse har fordelen ved en tilsyneladende rettet migration, det vil sige fra øvre til nedre kammer, men er stadig problematisk. For det første er der ingen “gradient” af kemokiner fra top til bund, men snarere kun en enkelt trinfunktion fra lave til høje koncentrationer. For det andet er der ingen måde at opretholde kemokinforskellen fra top til bundkamre . Oprindeligt er kemokinkoncentrationen i det nedre rum større, men inden for få minutter til timer udlignes koncentrationerne på grund af diffusion, på hvilket tidspunkt specifik kemotakse ophører. I stedet afspejler langsigtede målinger mere sandsynligt et væsentligt element i kemokinesis. Når celler falder gennem membranen og ind i det nedre kammer, er der desuden ingen mulighed for omvendt migration. Endelig er Boyden-kammeret også begrænset, fordi celletælling kræver afslutning af eksperimentet; et tidsforløb kræver derfor flere enheder.Mikrofluidteknologi kan overvinde disse begrænsninger ved at generere en langsigtet stabil og kontrollerbar gradient af opløselige faktorer, der kontinuerligt kan overvåges over tid . Ved hjælp af celler, der er blevet behandlet for at blokere proliferation, tillader en sådan anordning en ægte løbende vurdering af kemotakse versus kemokinesis. Figur 1 viser en sådan anordning, hvor kilde-og vaskekoncentrationerne opretholdes ved at skabe tilsvarende brønde, hvis volumener er store i forhold til den diffusive strømning gennem forbindelseshydrogelkanalen . Ved steady state dannes en lineær koncentrationsgradient mellem disse to brønde. Selvom interstitiel strømning gennem hydrogelområdet kan forstyrre gradienten, hvis de hydrostatiske tryk i de to brønde ikke er ens, elimineres trykgradienter ved at forbinde kilde-og vaskebrøndene med yderligere kanaler og reservoirer, der tjener som lavmodstandsveje til væskestrøm og trykækvilibrering. Gradienter kan således opretholdes i flere dage og bruges til at studere cellemigration på en følsom og specifik måde med en række celletyper . Det arbejde, der præsenteres her, beskriver brugen af sådanne anordninger til at vurdere kemotakse for primære kulturer af glatte muskelceller og sammenligne det med ridse-og Boyden-kammerteknikker for følsomhed.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) de nedre 3 brønde er celle-og/eller Kildebrønde til kemokiner, og de øverste 3 brønde tjener som reservoirer til at opretholde ækvivalente Tryk i de nedre brønde. Afhængigt af eksperimentelt design kan sidebrøndene eller den centrale brønd tjene som Kildebrønde; celler i en central brønd kan migrere mod forskellige kemokinstimuli på begge sider, eller forskellige cellepopulationer i sidebrøndene kan migrere mod en central kemokinstimulus. (b, c) koncentrationsgradienter vises skematisk efter tilsætning af en fluorescerende farvestofindikator med lav molekylvægt til kildebrønden og kildebeholderen ved enten 2 timer (b) eller 72 timer (C). (D) grafisk visning af koncentrationsgradienter fra 0 time til 72 timer efter tilsætning af fluorescerende farvestof til kildebrønden og reservoiret.
2. Materialer og metoder
2.1. Primære glatte muskelceller (SMC) Kultur
Aortas blev høstet fra 8 uger gamle C57/B6-mus (Charles River, Vilmington, MA) med steril dissekerende saks. Adhærent fedt blev fjernet, og aortas blev inkuberet i 20 minutter ved 37 liter C i dulbeccos modificerede Ørnemedium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) indeholdende 1% penicillin/streptomycin, 2% føtal bovint serum og 5 mg/mL collagenase type II (Invitrogen). Aortas blev skyllet i koldt DMEM, og adventitia blev omhyggeligt dissekeret væk; de blev derefter skåret i små stykker og inkuberet i 30 minutter ved 37 liter C i DMEM indeholdende 1 mg/mL collagenase type i (Invitrogen) og 0,125 mg/mL elastase type III (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Efter gentagen pipettering for at dissociere vævet blev den resulterende celleblanding suspenderet i frisk “SMC-medium” (DMEM med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin; 2% ikke-essentielle aminosyrer, 1% L-glutamin; alle reagenser fra Invitrogen) og dyrket ved 37 kg C i en 5% CO2-inkubator på plader belagt med 1 mg/mL fibronectin i 30 minutter. Når cellekulturen er etableret (typisk efter den første passage), dyrkes SMC på ubelagte plastkolber (Corning Incorporated, Corning, NY).
SMC blev brugt fra Passage 2 til 7 og var 99.5% ren som vurderet ved strømningscytometri efter farvning for glat muskelkrus-actin. Til farvning høstes celler og fikseres med 1% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) i phosphatbufret saltvand (PBS). FITC-konjugeret antismoothmuskel-Kurt-actin-antistof (Sigma-Aldrich) ved 1: 100 fortynding i 10 gange BD perm/vaskebuffer (Bd Pharmingen, San Jose, Californien) blev påført i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler vaskes to gange med 1% føtal bovint serum i PBS og en gang med 1% føtal bovint serum i PBS indeholdende 1% formaldehyd og analyseres straks ved strømningscytometri (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC-konjugeret mus IgG1 isotype (BD Pharmingen) anvendes som en isotype kontrol. Celler til kemotaktiske analyser blev høstet, da de havde opnået sammenløb.
2, 2. Mitomycin-C-Behandling
celler blev trypsiniseret (0,25% trypsin-EDTA; Invitrogen) i 2 minutter ved 37 liter C, vasket med SMC-medium og derefter inkuberet som en enkeltcellesuspension i 40 liter / mL mitomycin-C (MMC; Sigma-Aldrich) i SMC-medium i 30 minutter ved 37 liter C. Efter yderligere to vaske i PBS blev celler vurderet for levedygtighed, proliferation eller migreringskapacitet. Til sårheling (scratch) – analysen blev MMC-behandling udført efter SMC-plettering, og når cellerne var 100% sammenflydende; celler blev inkuberet i 40 liter/mL MMC i SMC-medium i 30 minutter ved 37 liter C og derefter vasket to gange i PBS før analyse.
2, 3. SMC-Proliferationsinhiberingsassay
efter MMC-behandling eller kontrolinkubation i SMC-medium blev SMC dyrket i 6-brøndsplader (Corning Incorporated). Celler blev genvundet efter 1 time, 24 timer eller 48 timer ved trypsinisering, og celletal og levedygtighed blev vurderet ved at tælle ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblåt udelukkelse.
2, 4. Sårheling / Scratch Assay
SMC blev dyrket i 12-brøndsplader (Corning Incorporated) indtil sammenflydende og derefter behandlet med MMC. Efter vask blev der tilsat frisk SMC-medium, og cellemonolaget blev ridset på en reproducerbar måde ved anvendelse af en steril 200 liter pipettespids. Forskellige koncentrationer af blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF; R &D-systemer, Minneapolis, MN) i SMC-medier blev tilføjet til hver brønd. Afstanden mellem kanterne på ridsefejlen blev målt og gennemsnitligt fra fem separate punkter ved 3, 6 og 9 h, eller indtil sårdefekten var lukket.
2, 5. Boyden-Kammertransvulassay
100 liter SMC–suspensioner ved 1,0–1,5 liter 105 celler/mL (1,0-1,5 liter 104 totale celler) blev indlæst i de øverste tværvulsindsatser (costar, Corning Incorporated) og 600 liter SMC-medier indeholdende forskellige koncentrationer af PDGF blev anbragt i det nedre rum. Efter 6 timer, 12 timer eller 24 timer inkubation blev transvellemembranen farvet med Hoechst 33342 (Invitrogen) i henhold til producentens anbefaling, og transmigrerede celler på underfladen blev talt med et fluorescensmikroskop ved hjælp af Metamorph-Mikroskopiautomatiserings-og Billedanalyseprogram (BioCompare, South San Francisco, CA). Ingen celler blev nogensinde identificeret i mediet i det nedre kammer. I eksperimenter for at vurdere, om cellemigration repræsenterede kemotakse eller tilfældig kemokinesis i fravær af en koncentrationsgradient, blodpladeafledt vækstfaktor-BB (PDGF) blev tilsat til det nedre kammer, kun topindsatsbrønd eller begge dele topindsats og nedre kammer.
2, 6. Mikrofluidanordningsanalyse
mikrofluidanordningerne (Figur 1(A)-1 (c)) fremstilles som beskrevet andetsteds . Som vist i Figur 1, litra D), er gradienter af tilsatte reagenser stabile i mindst 72 timer. Afhængig af den eksperimentelle protokol placeres celler, der skal evalueres, i den centrale brønd, og forskellige kemotaktiske gradienter udvikles fra de to sidebrønde. Alternativt kan migrationen af to forskellige populationer af celler evalueres fra sidebrøndene og oplever identiske koncentrationsgradienter genereret af reagenser placeret i den centrale brønd. Cellekoncentrationer var altid 4-5 liter 105 / mL, og 40 liter af cellesuspensionerne (1,6–2,0 liter 103 celler) blev indlæst i testbrønde.
celler blev inkuberet i enhederne til forskellige tidspunkter og derefter farvet med Hoechst 33342 (Invitrogen). Placeringen af hver celle blev bestemt ved hjælp af fluorescensmikroskopi (Nikon Eclipse TE2000-u; Nikon Instruments, Inc. Den migrerede afstand blev vurderet ved hjælp af Matlab-programmet (Matlab, Natick, MA). “Total migration” defineres som summen af afstande migreret af alle celler ud over en indledende startplacering; dette migrationsindeks bruges til statistisk analyse (figur 2).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
vurdering af cellemigration i mikrofluidiske enheder. Celler blev belagt i den centrale nedre brønd af en mikrofluid indretning, med 50 ng/mL PDGF i SMC-medium placeret i den venstre nedre brønd og SMC-medium alene placeret i den højre nedre brønd, efterfulgt af inkubation ved 37 liter C i 48 timer. (a, b) Fasekontrastbillede af cellekemotakse fra den centrale kanal i retning af 50 ng/mL PDGF i den venstre kanal; billederne er delt langs kanalen mellem vasken og kildebrøndene, så kanalens fulde længde kan vises med en forstørrelse, der er tilstrækkelig til at tillade cellulær opløsning. (c, d) Fasekontrastbillede af cellekemokinesis fra den centrale kanal kun i retning af SMC-medium. (e, f) fluorescensbillede med lav effekt af venstre (e) eller højre; (f) kanal ved 48 h efter farvning med Hoechst 33342. (g) fluorescensbillede med høj effekt af venstre kanal i panel (e); den sorte firkant uden celler nær højre side af billedet (stjerne) er en strukturel stolpe, der markerer startpunktet for migrationen. h) eksempel på migrationsanalysen. En lodret rød linje angiver startpunktet; afstanden fra startpunktet til midten af hver cellekerne måles, og summen af alle disse individuelle målinger bliver den samlede migrationsafstand ved hjælp af Matlab.
kollagen type i (Invitrogen) bruges til at fylde kanalen mellem centrale og sidebrønde og er det substrat, gennem hvilket celler migrerer. Både 1 mg/mL og 2 mg/mL kollagen kan anvendes. Selvom 1 mg/mL kollagen resulterer i noget højere uspecifik baggrundscellekemokinesis og gelbelastning er teknisk vanskeligere end med 2 mg/mL kollagen, tillader den lavere kollagenkoncentration større migration af primære kulturer af SMC, og analysefølsomheden er bedre. Medmindre andet er angivet, var koncentrationen af kollagen i migrationskanalerne 1 mg/mL for alle forsøg.
2, 7. Statistisk analyse
statistiske sammenligninger blev foretaget ved hjælp af studerendes test eller envejs ANOVA. Betydningen blev defineret på niveauet.
3. Resultater og diskussion
som vist i figur 3(a) blokeres celleproliferation ved MMC-behandling. Der er ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed mellem MMC-behandlet SMC (%) og ubehandlet SMC (%) i op til 48 timer efter behandling. Således repræsenterer celleakkumulering i de forskellige migrationsanalyser ægte cellebevægelse uden nogen komponent i celleproliferation. Dette er vigtigt, fordi uden MMC-behandling, migrationsindekser fra langvarige inkubationer kan forveksles med sammenfaldende cellulær proliferation.
(a)
(b) (b)
(c) (C)
(d)
(a) (a)
(b)
(C)
(d)
i ridseanalyser (figur 3(b)) med primære SMC-kulturer migrerede celler tilfældigt (kemokinesis) for at udfylde defekterne ved sammenlignelige hastigheder uanset pdgf-koncentration, inklusive i fravær af noget kemotaktisk middel. Uden MMC-behandling har sårdefekter en tendens til at lukke lidt tidligere, hvilket antyder et element af celleproliferation.
figur 3 (c) viser migrationsresultaterne for SMC ved hjælp af Boyden-kammertransmissionsanalysen. Det tidlige (12 timer) tidspunkt viser lille, men signifikant øget migration som respons på 10-50 ng/mL PDGF versus ingen kemokin i bundbrønden. Der var imidlertid ingen skelnelig forskel i migration over et 10 gange koncentrationsområde af PDGF, hvilket antyder, at analysen er relativt ufølsom, i det mindste for primære SMC-kulturer. Desuden er der efter 24 timer ingen forskelle mellem nogen af koncentrationerne af kemokiner (Inklusive medium kontrol), der antyder, at migration på dette tidspunkt er uspecifik, når cytokinkoncentrationerne er begyndt at ækvilibrere mellem de øverste og nederste brønde.
for formelt at demonstrere, at migration over membranen i den øverste brønd ikke nødvendigvis skyldes rettet kemotakse, blev PDGF føjet til den øverste brønd, med eller uden PDGF i det nederste rum. Selv i fravær af en kemokingradient førte PDGF i det øverste kammer til markant øget transmigration (figur 3(d)); dette kan kun tilskrives øget kemokinese.
transveleksperimenterne antyder således, at selvom indledende pdgf-koncentrationsforskelle kan inducere en vis grad af øget cellemigration mod højere koncentrationer i de nedre brønde, fører efterfølgende PDGF-diffusion til tilfældig kemokinesis.
til sammenligning viser dosisresponseksperimenter ved anvendelse af mikrofluidindretningerne (figur 4) signifikant kemotakse ved koncentrationer så lave som 2.5 ng/mL PDGF(figur 4 (B)) og viser en dosisafhængig stigning i kemotaksi med en top på ca.25-50 ng/mL(figur 4 (A)). Interessant nok fører højere koncentrationer af PDGF (f.eks. 100 ng/mL) til mindre migration i overensstemmelse med en højdosis kemotaksiestop (18). Bemærk, at migrationsindekset uden forudgående MMC-behandling er større(figur 4 (A)), hvilket fremhæver det ikke-obligatoriske bidrag fra spredning til “tilsyneladende” kemotakse, der forekommer med længere analysetider. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or “gold standard” Boyden chamber approaches.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Microfluidic device assay. (a) dosisresponskurver med og uden forudgående MMC-behandling. MMC-behandlet og ikke-behandlet SMC blev anbragt i sidecellebrønde med forskellige koncentrationer af PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL og 100 ng/mL) til stede i de centrale Kildebrønde. Migration blev målt efter Hoechst 33342 farvning og fluorescensmikroskopi efter 48 timer ved hjælp af Matlab-programmet til beregning af total migration. Kontroller (kun SMC-medium) og hver koncentration af PDGF blev evalueret i tre eksemplarer. Signifikante forskelle kan ses fra 5 ng/mL til 100 ng / mL PDGF sammenlignet med kontrollen (). B) Kemokinesis versus kemotakse i mikrofluidiske anordninger. MMC-behandlet SMC med eller uden 2,5 ng/mL PDGF blev belagt i den centrale cellebrønd; 2,5 ng/mL eller 50 ng/mL PDGF blev tilsat til sidekildebrøndene. Uden pdgf til stede i den centrale cellebrønd viser analysen signifikant større total migration efter 48 timer med 50 ng/mL i kildebrønden (“0-50”) versus 2,5 ng/mL i kildebrønden (“0-2, 5”). Tilstedeværelsen af 2,5 ng / mL PDGF i den centrale cellebrønd fører til signifikant større total migration, når der er en koncentrationsgradient (“2,5–50”; ) kan henføres til en lokal kemokinese effekt. I fravær af en gradient (“2,5–2,5”) er der en kemokinesisassocieret migration, som er signifikant mindre end den migration, der ses, når en gradient er til stede (“0-2, 5”;). (C) tidsforsøg udført som panel (b).
ikke kun kan den mikrofluidiske enhed bruges til måling af kemotakse, men den kan også specifikt skelne bidragene fra kemokinesis og kemotakse til migration (figur 4(b)). Således i fravær af en kemokingradient (f.eks. 2.5 ng/mL PDGF i både center-og sidebrønde) afspejler migrationsindekset kemokinesis. Til sammenligning, uden pdgf i midterbrønden og 2,5 ng/mL i sidebrønden, afspejler migrationsindekset rettet kemotakse. Den mikrofluidiske enhed kan også vurdere kemotakse i nærvær af eksisterende kemokinesis, som når centerbrønden indeholder 2,5 ng/mL PDGF og sidebrønden indeholder 50 ng/mL. Der er en lille, men statistisk større migration, når stimulus er en kemotaktisk gradient snarere end simpel kemokinese.
da kemokingradienten er etableret inden for 2 timer (17) og er stabil i flere dage, kan celler kontinuerligt migrere op i koncentrationsgradienten over tid (figur 4(c)). Til sammenligning har andre klassiske metoder enten ingen koncentrationsgradient (ridseanalyse) eller har kun en forbigående kemokingradient, så kemokinese—snarere end rettet kemotakse—i stigende grad bidrager.
den mikrofluidiske enhed, der er rapporteret i dette arbejde, er overlegen i en række henseender sammenlignet med andre In vitro-tilgange, der tidligere blev brugt til at studere kemotaksi. Især Boyden-kammeret-der involverer en kemokingradient over en porøs membran-har været et standard kemotaktisk assay siden 1950 ‘ erne. denne enhed har imidlertid betydelige begrænsninger i, at gradienter hverken er stabile eller lineære, med et indledende skarpt koncentrationstrin op, der gradvist forværres over tid. For nylig blev mikroelektromekaniske systemer (MEMS) teknologier udviklet, der bruger mikrofluidiske biochips til at efterligne in vivo-forhold; i disse enheder udsættes celler kontinuerligt for forskydningskræfter under kontrolleret strømning. Imidlertid udgør den kontinuerlige strømning af disse enheder en udfordring for vedligeholdelsen af stabile kemokingradienter. Selvom hydrogeler mellem kilde-og vaskekanalen kan skabe lineære koncentrationsgradienter , kan subtile variationer i brøndene og kanalerne skabe trykgradienter, der forstyrrer gradienterne gennem interstitiel strømning ; desuden har den kontinuerlige strøm af enhederne en tendens til at fortynde eventuelle kemoattraktanter, der udskilles af cellekilder. I den nye mikrofluidiske enhed, der er beskrevet tidligere og valideret til glat muskelcellemigration i dette papir, store volumenkilde-og vaskebrønde opretholder stabile kemokingradienter i forbindelseshydrogelen; enhver interstitiel strømning elimineres ved at forbinde kilde-og vaskebrøndene med yderligere kanaler og reservoirer, der tjener som et modstandskondensatorkredsløb. Koncentrationsgradienterne er således stabile og lineære i flere dage. Det nuværende arbejde har yderligere forfinet applikationen, inkorporering af mitomycin-C-behandling for at reducere ethvert forvirrende bidrag fra proliferation og demonstrere, hvordan kemotakse og kemokinesis kan vurderes i den samme eksperimentelle opsætning.
interessekonflikt
forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
anerkendelser
dette arbejde blev støttet af et tilskud fra BVH-Bri Fund til at opretholde forskningsekspertise-Bridge Research Grant. Chen Jang blev støttet af China Scholarship Council i 18 måneder. Ovid C. Amati og Richard T. Lee blev delvist støttet af NSF Science and Technology Center CBET-0939511.
