forbindelser

ALDH1A1-hæmmere er for nylig blevet beskrevet30. LDHA-hæmmere blev tidligere beskrevet i Rai et al.29. IDH1-hæmmere blev tidligere beskrevet i Urban et al. og Davis et al.24,36. Andre forbindelser anvendt i undersøgelsen var Metotreksat (Medchem Ekspres, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MEDCHEM Ekspres HY-18690), Isofagomin (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) og LY2857785 (MEDCHEM Ekspres, HY12293). Forbindelser i mekanismen forhør plade (MIPE) blev testet i 11-point (intraplate, 1:3 fortyndingsfaktor). Kinasehæmmeropsamlingen indeholdende 977 kinasehæmmere blev testet i 7-punkts doser (interplate, 1:5 fortyndingsfaktor). I alle tilfælde blev DMSO brugt som køretøj.

kloning

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Åbne læserammer (Orf ‘ er) af generne af interesse blev klonet ind i acceptorryggbenene ved hjælp af BamHI/EcoRI (N-terminal) eller NheI/BamHI (C-terminal) steder ved PCR-amplifikation af det kodende område med Infusionskompatible oligonukleotider, defineret detaljeret i supplerende tabel S1. Idh1 -, LDHA -, DHFR -, GC-og ALDH1A1-konstruktioner blev fremstillet ved GeneArt-gensyntese (ThermoFisher) i pcDNA3.1 (+). Til Portkloning (kun idh2-konstruktioner) blev en destinationsvektor indeholdende 86B-mærket oprettet ved at erstatte V5-mærket i pcDNA3.2-v5/dest. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes “LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

cellekultur

HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22rv1, MDA-MB-468 og HT-29 celler blev opnået fra ATCC (henholdsvis CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 og HTB-38). HuCC-T1 og CC-LP-1 var en venlig gave af Dr. N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). HEK293T-celler blev dyrket i DMEM (4,5 g/L glucose) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 E/mL penicillin og 50 liter/mL streptomycin. Ln18 -, HT-29 -, CC-LP-1-og HeLa-celler blev dyrket i ovennævnte medium uden natriumpyruvat. Ov-90 celler blev dyrket i en 1:1 blanding af MCDB 105 medium (Cell Applications Inc.) og m199 medium (HyClone, GE) suppleret med 15% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin (Life Technologies) og en endelig koncentration på 1,85 g/L natriumbicarbonat (HyClone, GE). 22rv1 -, HuCC-T1-og MDA-MB-468-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 6 mM L-glutamin, 100 enheder/mL penicillin, 100 lengg/mL streptomycin. Alle celler blev dyrket ved 37 kg C i en befugtet inkubator opretholdt ved 5% CO2 og testet negativ for mycoplasma ved hjælp af et MycoAlert-detektionssæt.

produktion og oprensning af rekombinant protein og peptid

11S og 86B proteiner blev produceret af GenScript. For rekombinant 11S fragment blev den kodende DNA-sekvens fusioneret til en 6 gange hans tag for at lette nedstrøms oprensning, og sekvensen blev subkloneret til en E. coli-ekspressionsvektor. BL21-stjerne (DE3) celler blev transformeret med rekombinante plasmider, og en enkelt koloni blev inokuleret i LB-medium indeholdende IPTG til induktion af proteinekspression. SDS-side og vestlige blot analyse blev brugt til at overvåge udtrykket og vælge optimal høst timing. Celler blev høstet ved centrifugering, og pellets blev lyseret ved sonikering. Efter hans-tag-rensning blev fraktioner steriliseret gennem et 0,22 liter filter. Proteiner blev analyseret af SDS-PAGE og vestlig blot ved hjælp af standardprotokoller og en mus-anti-His mAb (GenScript, Cat.No.A00186). koncentrationen af oprenset protein blev bestemt ved anvendelse af et Bradford-proteinassay med BSA som standard. Protein blev opbevaret i 1 gange PBS, 10% glycerol, pH 7,4, og renheden var ca. 90%, som estimeret ved densitometrisk analyse af Coomassie blåfarvet SDS-PAGE gel under reducerende betingelser. Det 15 aminosyre 86B peptid blev opbevaret i ultrapure dH2O og var 99,9% rent af HPLC.

lav gennemstrømning (96-brønds PCR-plader eller strimler) CETSA komplementeringsassay

celler blev transficeret i 6-brøndskåle ved hjælp af en omvendt transfektionsprocedure, hvor 1,25 ml komplekser (6,25 liter Lipofectamin 2000 og 3 liter DNA pr.brønd) blev kombineret med 1,25 ml HEK293T cellesuspension (1 liter 106 / mL, 1,25 liter 106 celler i alt). Til CDK9 blev der anvendt 2 liter DNA pr. Efter 24 timer (48 timer for CDK9) blev celler høstet ved trypsinisering og resuspenderet ved 1 liter 106 celler/mL (medmindre andet er angivet) i CETSA-buffer indeholdende DPB ‘ er (med CaCl2 og MgCl2) plus 1 g/L glucose, 1 gang Proteasehæmmercocktail (ThermoFisher) og 0,5% DMSO (DMSO blev ikke tilsat til forsøg, der modtog efterfølgende forbindelse og vehikelbehandling). Til temperaturområdeforsøg (uden forbindelse eller enkeltdosis) blev prøver alikteret til PCR-strimler ved 30 liter pr. Forbindelse blev tilsat, og celler blev inkuberet ved 37 liter C til 1 h. prøver blev derefter opvarmet til 3.5 min under anvendelse af en forvarmet termisk cycler, der fik lov til at ækvilibrere til stuetemperatur, og 6 liter på 6% NP40 blev tilsat til hver brønd. Til frysetøningseksperimenter blev rør anbragt i en aluminium PCR-blok på et tøris/ethanolbad i 3 minutter efterfulgt af inkubering ved 37 liter C i 3 minutter, hvirvel i 3 sek og gentagelse af disse trin tre yderligere gange. 11s (GenScript) og furimasinsubstrat (fra Nano-Glo Luciferase Assay System, Promega) blev tilsat ved endelige koncentrationer på 100 nM og 0.5 gange, og prøver blev analyseret for luminescensintensitet ved hjælp af en CCD-imager med høj kapacitet (Perkin Elmer) udstyret med klare filtre.

384-brønd CETSA-assay

celler blev transficeret i T75-kolber ved hjælp af en omvendt transfektionsprocedure, hvor 9 mL komplekser (45 lip-Lipofectamin 2000 og 22,5-DNA) blev kombineret med 10 mL HEK293T-cellesuspension (1-106-celler / mL, 10 millioner celler i alt). Efter 24 timer blev cellerne høstet ved trypsinisering, resuspenderet ved 1 liter 106 celler/ml som beskrevet ovenfor og dispenseret (15 liter celler / brønd) i 384-brønds PCR-plader (Roche) under anvendelse af en Multidrop Combi (ThermoFisher). Forbindelser (63 nL) eller DMSO-køretøjskontrol (63 nL) blev efterfølgende fastgjort ved hjælp af et stiftværktøj (GNF) og inkuberet i 1 time ved 37 liter C. plader blev forseglet og opvarmet ved den angivne temperatur i 3,5 min og afkølet til 25 liter C ved hjælp af AB-maskine (Roche) ved hjælp af rampehastighed på 1,5 liter C/sek til opvarmningsfase og maksimal rampehastighed for kølefasen. Tre liter på 6% NP40 blev tilsat pr. brønd og inkuberet i 30 minutter for at tillade cellelyse efterfulgt af tilsætning af 11S og furimasinsubstrat (ved endelige koncentrationer på henholdsvis 100 nM og 0,5 gange). Prøver blev analyseret for luminescensintensitet ved hjælp af en Visningslæser.

1.536-brønd CETSA-assay

celler blev transficeret og høstet som ovenfor (384-brøndprotokol). Celler blev dispenseret (5 liter celle / brønd) i 1.536-brønd hvide plader (Aurora, cyklisk olefinpolymer, kat# IUG041000A) under anvendelse af en Multidrop Combi. Forbindelser (23 nL) blev efterfølgende fastgjort ved hjælp af et stiftværktøj og inkuberet i 1 time ved 37 liter C. pladerne blev opvarmet ved den angivne temperatur og tid ved hjælp af en varmeblok (se nedenfor) og afkølet til 25 liter C. en liter på 6% NP40 blev tilsat pr.brønd, og pladerne blev inkuberet i 30 minutter for at tillade cellelyse efterfulgt af tilsætning af 3 liter 11 (slutkoncentration 100 nM) og furimasinsubstrat. Plader blev centrifugeret og analyseret for luminescensintensitet ved hjælp af en Visningslæser. For LDHA og CDK9 skærme, en endelig koncentration på 0,5 gange og 0.25 gange furimasin blev anvendt henholdsvis. Normaliseringskontroller inkluderer DMSO og GSK2837808A-behandlede prøver eller uopvarmede prøver til henholdsvis LDHA og CDK9. CDK9-modskærmen blev udført som ovenfor med følgende forskelle: 5 liter af ikke-overførte HEK293T-celler (1 liter 106/mL i CETSA-buffer) blev dispenseret i 1.536-brøndsplader efterfulgt af sammensat tilsætning, 37 liter C-inkubations -, opvarmnings-og lysisetrin som ovenfor. Derefter blev 500 pM (endelig) på 86B tilsat til brøndene efterfulgt af tilsætning af 100 nM 11S og 0,25 gange furimasinsubstrat (endelig).

aluminiumsblokken til opvarmning af en 1.536-brøndsplade blev designet ved at måle en plade til bestemmelse af dimensionerne på det område, der er afgrænset af indstøbte forstærkningsribber i H og Y, og bundbrøndfladen og bundflangefladen i Å. derefter blev en blok, der skulle bearbejdes fra 6061 T6 aluminiumplade, støbt, hvilket ville være en fri pasform med cirka 0,5 mm afstand til pladen i alle akser. Blokken blev bearbejdet ved hjælp af en manuel lodret fræsemaskine, endefabrikker og en overfladefabrik. Til ovnopvarmningseksperimenter blev plader anbragt i det midterste rack af konvektionslaboratorieovn (Termofisher) og dækket med metallåg for at minimere fordampning.

CETSA i cellulære lysater

celler blev opsamlet i CETSA-buffer ved 1,0 liter 106 celler / mL (som beskrevet ovenfor), og NP40 blev tilsat til en endelig koncentration på 0,4%. Efter roterende prøver end-over-end i 30 minutter (stuetemperatur) blev lysater afklaret ved centrifugering ved 20.000 liter g i 10 minutter (4 oC). Cofaktor (f.eks. NAD+) blev tilsat til det klarede lysat. Til temperaturresponsforsøg blev 25 liter lysat overført til PCR-rør og opvarmet i 3,5 minutter til forskellige temperaturer. Til isotermiske dosisresponseksperimenter blev 5 liter klaret lysat dispenseret til 1536-brøndsplader ved hjælp af en BioRAPTR FRD-arbejdsstation, og prøver blev opvarmet på en aluminiumsblok. Prøver fik lov til at ækvilibrere til stuetemperatur, og substrat blev tilsat (slutkoncentration: 100 nM 11s, 0,5 gange furimasin). Luminescens blev fanget ved hjælp af et billedbillede som beskrevet ovenfor.

vestlige blots

prøver blev behandlet som beskrevet i sektion med komplementeringsassay med lav kapacitet ved hjælp af frysetøningscyklusser til lysis. Lysater blev centrifugeret ved 15.200 liter g i 20 minutter ved 4 liter C. prøver blev kørt på en 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel (ThermoFisher) ved anvendelse af MOPS-buffer og overført til en PVDF-membran ved anvendelse af et iblot 2-overførselssystem ved 25 V i 7 minutter. Membraner blev blokeret med en 5% mælkeopløsning (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% mellem 20), og primære antistoffer blev inkuberet natten over ved 4 liter C i blokeringsopløsning. Antistoffer var: anti-IDH1 (, celle signalering #8137, 1:500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, celle signalering #3582, 1: 1000). Anti-kanin / mus-HRP (kanin = cellesignalering 7074; mus = cellesignalering # 7076) blev tilsat ved 1:2500 og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Et kemiluminescerende signal blev genereret med Supersignal vest dura-opløsning (ThermoFisher) og fanget ved hjælp af et Biorad Chemidoc-system. Densitometrisk analyse blev udført ved hjælp af Photoshop-programmet (Adobe).

2-HG assay

HEK293T celler reverserer transficeret i 24 brøndskåle ved at tilføje 2.5, 105 celler på transfektionskomplekser (0, 75, plasmid-DNA, 1, 5, 2000, Lipofectamin pr.brønd). Cellekulturmedium blev opsamlet efter 72 timer, og 15 liter blev overført til 384-brønds uigennemsigtig plade. 1,5 liter på 660 mM HCI blev tilsat til hver brønd, og prøver blev inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter. 1,5 liter på 720 mM Tris-HCl base blev tilsat til hver brønd. Derefter 52 liter 2-HG detektionsopløsning (100 mm HEPES (pH 8,0), 100 liter NAD +, 1 liter / mL aktiv rekombinant D-2-hydroksiglutaratdehydrogenase (D2hgdh; Biovision, kat: P1001), 5 liter resurin, 0,03 mg/mL diaphorase (Sigma, kat: D5540) blev tilsat, og pladen blev inkuberet ved stuetemperatur. En 2-HG standardkurve blev fremstillet i 100 mM HEPES (pH 8,0). Fluorescens blev målt på en Visningslukslæser ved hjælp af eks: 525, Em: 598/25 filtre.

biokemiske assays

LDHA biokemiske assay blev udført som tidligere beskrevet29. Kort fortalt, 3 liter human lactatdehydrogenase 5 (2 nM endelig) (nr. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) i LDH-assaybuffer (200 mM Tris HCl, pH 7,4, 100 liter EDTA og 0,01% mellem 20) blev tilsat til en sort solid bund 1536-brønd assay plade (Greiner Bio-One). Efter overførsel af forbindelsespind (23 nL) blev 1 liter substratopløsning indeholdende NADH (0,06 mM endelig) og natriumpyruvat (0,2 mM endelig) (Sigma-Aldrich) i LDH-assaybuffer dispenseret for at starte reaktionen. Efter 5 min inkubation ved stuetemperatur blev der tilsat 1 liter detektionsreagens til hver brønd. Plader blev straks overført til en Visningslæser, og enhver resulterende resorufin-fluorescens blev målt (eks 540 nm, em 590 nm) ved 0 og 10 min. Fluorescens blev normaliseret ved hjælp af DMSO-behandlede kontrolbrønde på hver plade.

det biokemiske assay ALDH1A1 under anvendelse af ikke-tagget protein blev udført som tidligere beskrevet31,37. Kort fortalt blev 3 liter på 20 nM oprenset human ALDH1A1 i assaybuffer (100 mM HEPES pH 7,5 med 0,01% mellem 20) dispenseret i en 1.536-brønd solid-bund sort plade (Greiner Bio One). Tyve-tre nl af forbindelser eller kontrol Bay 11-7085 blev overført via pin værktøj. Prøverne blev inkuberet (rumtemperatur, beskyttet mod lys) i 15 minutter efterfulgt af en tilsætning af 1 liter substrat af NAD + og Propionaldehyd (endelige koncentrationer på henholdsvis 1 mM og 80 liter). Plader blev centrifugeret og aflæst i kinetisk tilstand på et billedbillede udstyret med 340 nm ophidselse, 450 nm emissionsfiltre i 5 minutter. Ændringen i fluorescensintensitet i løbet af 5 min blev normaliseret ved hjælp af kontrolbrønde, der var fri og DMSO-behandlede på hver plade.

TR-FRET Lanthascreen Eu Kinase bindende assay for CDK9 / cyclin K blev købt fra ThermoFisher og udført som pr producentens anvisninger. Kort fortalt blev 4 liter af en Masterblanding indeholdende 4 nM CDK9/Cyclin K (Invitrogen #PV4335), 2 nM Biotin Anti-his Ab, 2 nM Eu-Streptavidin og 10 nM Kinase Tracer 236 opløsning i 1 gange Kinasebuffer dispenseret i Greiner 1.536-brønd hvide medium bindende plader ved hjælp af en BioRAPTR FRD arbejdsstation. Treogtyve nL af forbindelse og kontroller (DMSO og LY2857785 ved en endelig koncentration på 6 liter) blev straks leveret til analysepladerne via stiftværktøjsoverførsel. Pladerne fik lov til at inkubere i 1 time ved stuetemperatur, og tr-FRET fluorescens blev efterfølgende målt med en PerkinElmer EnVision Multilabel pladelæser (eks: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; forsinkelsestid 100 liter; Integrationstid 200 liter).

Laktatproduktionsassay

HEK293T-celler blev dyrket som beskrevet ovenfor. Celler blev skyllet med PBS, trypsiniseret og resuspenderet i phenol red free DMEM (Life Technologies) uden kosttilskud. Celler blev straks belagt til 1536-brønds sorte klare bundplader (Corning) ved 250 celler pr. Forbindelse-eller køretøjskontrol blev tilsat til brønde via stiftværktøjsoverførsel, og celler blev inkuberet ved 37 liter C i 1 time. to liter lactatreaktionsblanding (Biovision K607-100) blev tilsat til hver brønd, og plader blev dækket og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Fluorescens blev målt ved hjælp af en Mikroplate imager udstyret med eks/Em 528/598 nm filtre.

Aldefluor-assay

til indledende bestemmelse af 86B-mærket ALDH1A1-aktivitet blev celler transficeret ved hjælp af en omvendt transfektionsprocedure, hvor 1 mL komplekser (6 ren Lipofectamin 2000 og 3 reng DNA) blev kombineret med 1 mL ln18-cellesuspension (5 ren 105/mL) og 100 renl / blandingsbrønd blev dispenseret i sorte 96-brøndplader med klar bund (Corning). Efter 24 timer blev medier fjernet og erstattet med 100 liter/brønd Aldefluor-buffer (STEMCELL Technologies) indeholdende BAAA-substrat og Hoechst 33342 (Termofisher, endelige koncentrationer på henholdsvis 500 nM og 0,5 nM). Vehicle DMSO eller deab (1 liter final) blev efterfølgende tilsat, og plader blev inkuberet i 30 minutter ved 37 liter C for at muliggøre omdannelse af BAAA til BAA. Celler blev vasket, og 100 liter/brønd Aldefluor-buffer blev dispenseret før billeddannelse på en in-Celle 2200 (GE Healthcare). Til analyser med høj gennemstrømning blev ln18-celler transficeret i T75-kolber ved anvendelse af en omvendt transfektionsprocedure som beskrevet ovenfor for HEK293T CETSA-analyser med høj gennemstrømning. Efter 16 timer blev celler høstet og belagt (1.000 celler/brønd/5 liter) i sort, optisk kvalitet klar bund, TC behandlede 1.536 brøndplader (Aurora mikroplader) ved hjælp af en Multidrop Combi dispenser og inkuberet natten over ved 37 liter C. Aldefluor-analysen med højt indhold blev efterfølgende udført på transficerede ln18-celler eller ikke-inficeret OV-90 som tidligere beskrevet31. Billeder blev analyseret ved hjælp af In Cell Investigator v1.6.2 analyseprogrammets dåse multi-Target analysealgoritme (GE Healthcare) som beskrevet.

membran thermal integrity assay

30.000 HEK293T-celler blev fremstillet i 30 liter cetsa-buffer indeholdende 1 gang proteasehæmmercocktail (ThermoFisher) suppleret med 0,5% DMSO (1,5% DMSO total). Til DMSO-toleranceeksperimentet blev DMSO føjet til DPBS ved 0, 1, 2 eller 3%. Cellesuspensioner blev opvarmet i 3,5 minutter ved 42 Til 74 liter C under anvendelse af 4 graders intervaller og derefter fjernet til en aluminiumsblok på våd is. Cellesuspensioner blev blandet med lige store dele Trypan Blue (Lone) ( = 0,2% trypan blue) og tælles straks ved hjælp af et C-chip hæmocytometer (iNCyto, Korea). Trypan positiv (permeabiliseret) og negativ (intakt) blev talt med n = 2 ved hver temperatur. For yderligere cellelinjer blev der fremstillet en million celler i 100 liter phenolrød fri DMEM indeholdende 1% DMSO. Celler blev opvarmet i 3 minutter over 42 til 90 liter C med 4 graders intervaller, derefter fjernet til en aluminiumsblok på våd is. Membranintegriteten blev vurderet som beskrevet ovenfor.

PAMPA

den omrørende dobbeltvask PAMPA-metode patenteret af pION Inc. (Billerica, MA) blev anvendt til at måle forbindelsespermeabilitet som tidligere beskrevet38. Forbindelser blev fortyndet i donor-og acceptoropløsninger bufret til pH7.4, og DMSO-koncentrationen var 0,5%. Permeabilitetsberegninger blev udført under anvendelse af Pion Inc. software.

HHT-analyse

Data fra hvert assay blev normaliseret plademæssigt til tilsvarende kontroller som beskrevet tidligere39. De samme kontroller blev også brugt til beregning af Å-faktoren for hvert assay. Procent aktivitet blev afledt ved hjælp af interne programmer (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Alle koncentrationsresponskurver blev monteret, og AC50 blev beregnet med GraphPad Prism-programmet; kurver blev klassificeret som beskrevet tidligere27. Arealet under kurven (AUC) blev beregnet ved hjælp af den trapesformede regel for at tilnærme arealet mellem responskurven og H-aksen på tværs af koncentrationsområdet. Ækvivalente koncentrationsintervaller blev anvendt for alle forbindelser inden for et eksperiment. Effektivitetsafskæring på 3 liter fra middelværdien (af vehikelkontrol) blev anvendt til at klassificere aktive forbindelser.