Dyr

Sebrafisk blev opretholdt ved 28,5 liter C på en 14 timer til/10 timer fra lyscyklus i Danieau-opløsning . Den kombinatoriske krystal mutant (albb4 / b4; perlemor2/v2;roya9/A9) blev genereret ved sekventielt krydsning tre forskellige enkelt mutant stammer, nemlig perlemor2 / v2 (ref. 9), roya9/A9 (ref. 4) og albb4 / b4 (ref. 18) mutanter. Det er vigtigt, at både larver og voksne krystalsebrafisk er levedygtige og ikke viser synlige morfologiske, funktionelle eller adfærdsmæssige abnormiteter bortset fra pigmenteringsfænotypen. Casper mutanten blev opnået ved at krydse nacre2/v2 og roya9/a9 mutanter, som tidligere beskrevet4. AB-linjen blev brugt til at opnå vildtype sebrafisk. Transgene linjer anvendt i denne undersøgelse inkluderer Tg(elavl3:GCaMP5G)21 og Tg(elavl3:GCaMP6f)28. Konfokale funktionelle billeddannelseseksperimenter blev udført i nacre-mutanten. Lysark billeddannelseseksperimenter blev udført i nacre, casper og crystal mutants. To-foton funktionelle billeddannelseseksperimenter blev udført i krystallarver. For at behandle sebrafisklarver med PTU fulgte vi standardprocedurer8, specifikt blev larver opdrættet i 200 liter PTU (Sigma) i Danieau-opløsning fra 24 timer efter befrugtning (hpf). TG (elavl3:GCaMP5G) larver anvendt til konfokal funktionel billeddannelse af visuelt fremkaldt neural aktivitet i den optiske tektum blev behandlet med 200 liter PTU fra 24 hpf til 3 DPF og afbildet ved 4 dpf. Dette arbejde blev godkendt af det lokale dyrevelfærds-og etiske Gennemgangsorgan (King ‘ s College London) og blev udført i overensstemmelse med Animals (Scientific Procedures) Act 1986 under licens fra Det Forenede Kongeriges hjemmekontor (PPL70/8057).

billeddannelse

heldyr in vivo mikroskopi

heldyrbilleder af voksne sebrafisk blev taget med et Nikon D7000 digitalt spejlreflekskamera udstyret med en sigma 150 mm makroobjektiv. Voksne sebrafisk blev bedøvet med 0.2% tricaine (MS222, Sigma) i fiskefacilitetsvand og anbragt i en 90 mm petriskål indeholdende fiskefacilitetsvand. Billeddannelse af larver blev udført ved hjælp af et Aksioskopmikroskop, der var forbundet med blå CCD-kameraer (Retiga) og Volocity-erhvervelsesprogram (PerkinElmer). Larvesebrafisk blev bedøvet med 0,02% tricain i Danieau-opløsning og immobiliseret i 1% agarose med lavt smeltepunkt (Sigma) på glasrutschebaner.

konfokal calciumafbildning

billeddannelse blev udført ved hjælp af et konfokalt mikroskop udstyret med et spektral detektionsscanningshoved og et 20 gange / 1.0 NA vand-nedsænkning mål(Carl). Funktionelle tidsserier af visuelt fremkaldte calciumresponser i retinale ganglionceller (RGC ‘ er) blev erhvervet med en hastighed på 4,1 HS og 0,415 liter 0,415 liter opløsning (256 liter 256 punkter) og 1 AU pinhole blænde. Eksitationslys blev leveret af en 488 nm multi-line laser. Ikke-bedøvet TG(elavl3:GCaMP5G) larver blev immobiliseret i 2% agarose med lavt smeltepunkt (Sigma) fremstillet i Danieau-opløsning og monteret rygside op på en hævet glasplatform, der blev anbragt i et specialfremstillet Danieau-fyldt kammer. Agarosen var tilstrækkelig til at begrænse larverne, så anæstesi ikke var påkrævet. Billeddannelse blev udført om eftermiddagen (1-8 pm).

Lysarkafbildning

helhjernelysarkafbildning blev udført ved hjælp af et lysark med lysark 1 mikroskop udstyret med to 10 gange/0,2 NA-belysningsmål og et mål med 20 gange / 1,0 NA-vand-nedsænkningsdetektering (Carl). 488 nm laser eksitationslys blev brugt til at fremkalde gcamp6f fluorescens, og et 505-545 BP-filter blev brugt til udsendt lysdetektion. Pivotscanneren blev brugt til at levere homogen belysning og derfor undgå skygger langs belysningsaksen. Tykkelsen af lyspladen var 5,39 liter i midten og 10,8 liter i kanterne af synsfeltet. Eksponeringstiden var 29.97 ms. Størrelsen af volumetrisk billeder var 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 x 490 pixel) med en opløsning på 0.415 × 0.415 × 0.631 µm. 4 DPF Nacre, casper og crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) larver blev først paralyseret i 10-15 minutter i Kurt-bungarotoksin (1 mg/ml; Biotium) fremstillet i Danieau-opløsning. Derefter blev larver immobiliseret i 2% agarose med lavt smeltepunkt (Sigma) og anbragt inde i en glaskapillær (20 liter volumen, 701904; mærke). Vi ekstruderede efterfølgende sektionen af agarosecylinderen indeholdende larvens hoved fra kapillæren og orienterede larverne, så den dorsale side af hovedet stod overfor detektionsmålet, og øjnene stod overfor de to belysningsmål. Hel-hjerne lysark billeddannelse af casper mutant larver blev udført ved hjælp af et specialfremstillet lysarkmikroskop bygget af Dr. Martin Meyer (King ‘ s College London) og udstyret med et 20 gange/1,0 NA vand-nedsænkning Hlumplanfln detektionsmål (Olympus).

to-foton calcium imaging

to-foton funktionel billeddannelse i nethinden blev udført ved hjælp af et Nikon A1R MP mikroskop udstyret med en 4-kanals GaAsP NDD og en Apochromat 25 gange / 1,1 NA vand-nedsænkningsmål (Nikon). Spænding blev leveret af en Chameleon Ultra II-Tilstandslåst titanium-safirlaser (sammenhængende) indstillet til 930 nm. Tidsserier af visuelt fremkaldte calciumresponser blev erhvervet med en hastighed på 4 timer og 0,248 liter 0,248 liter opløsning (512 liter 256 punkter). Efter aktivering af laserscanningen ventede vi 60 sekunder, før vi startede den visuelle stimulering for at sikre nethinden tilpasset baggrundslysniveauet forårsaget af multi-fotonlaseren. 4 DPF crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) larver blev først paralyseret i 10-15 minutter i Kurt-bungarotoksin (1 mg/ml; Biotium) fremstillet i Danieau-opløsning. Derefter blev larver immobiliseret i 2% agarose med lavt smeltepunkt (Sigma) og monteret på en hævet specialfremstillet glasplatform med rygsiden opad (45 liter vinkelhældning) og det ene øje mod en LCD-skærm (se visuel stimulering), der blev placeret under et specialfremstillet Danieau-fyldt kammer. Billeddannelse blev udført om eftermiddagen (1-8 pm).

visuel stimulering

bevægelige stænger i konfokal forberedelse

bevægelige stænger stimuli blev genereret som tidligere beskrevet22,33. Et diffusionsfilter (3026, Rosco) blev bundet til den ene side af kammeret for at tjene som en projektionsskærm. Agarosen foran øjet, der vender mod projektionsskærmen, blev fjernet, hvilket tillod et uhindret billede af det projicerede billede på siden af kammeret. Larver blev placeret 3 cm væk fra skærmen, og det projicerede billede fyldte et synsfelt på ~97 liter 63 liter. Visuelle stimuli bestod af lys (56 cd/m2) eller mørke søjler (8 cd/m2) (henholdsvis 175% og 25% af gennemsnitlig luminans) på en gennemsnitlig grå baggrund (32 cd/m2). Da der ikke blev bemærket nogen kvalitative forskelle mellem lyse og mørke søjler, blev data opnået ved anvendelse af de to stimuli kombineret. Hver bjælke var 10 liter i bredden bevæger sig med en hastighed på 20 liter/s og adskilt fra den foregående bjælke med 30 liter, hvilket muliggør mere end en bjælke på skærmen ad gangen. De lange akser af stængerne var ortogonale til bevægelsesretningen. Hver af de 12 bevægelsesretninger blev præsenteret en gang (3 sekunder) i en pseudo-tilfældig rækkefølge, der er unik for hver skive i hvert billede af dyr. Hvert interval mellem epoker var 10 sekunder for at aktivere GCaMP5G-signaler til at vende tilbage til baseline. En tom skærm null betingelse på 2 sekunder blev også sammenflettet. Visuelle eksperimenter blev genereret og kontrolleret ved hjælp af specialskrevet Labvisning og MATLAB-kode, implementeret på en ViSaGe stimulus-præsentator (Cambridge Research Systems) og leveret via en DLP Pico-Projektor (Optoma).

bevægelige riste i to-foton forberedelse

bevægelige riste stimuli i to-foton præparatet blev genereret og kontrolleret ved hjælp af Psykopy39 og leveret gennem en LCD-skærm (SKD5VA-3, God teknologi) placeret under et specialfremstillet Perspeksekammer. Et langpasset rødt glasfilter (FGL610, Thorlabs) blev placeret mellem LCD-skærmen og kammeret for at muliggøre samtidig billeddannelse og visuel stimulering. Larver blev placeret 2 cm væk fra skærmen, og billedet på LCD-skærmen fyldte et synsfelt på ~140 liter 100 liter (gennemsnitlig baggrundsluminans 30,4 cd/m2). Visuelle stimuli bestod af kvadratbølgegitter (100% kontrast, rumlig frekvens 1,66 cyklusser/cm, tidsmæssig frekvens 1 cyklusser/s). Hver gitterstang var 8,5 liter i bredden, og de lange akser på stængerne var ortogonale i forhold til bevægelsesretningen. Hver af de 12 bevægelsesretninger blev præsenteret en gang (6 sekunder) med et interval mellem epoker på 10 sekunder for at aktivere GCaMP6f-signaler for at vende tilbage til baseline. En tom skærm null betingelse på 6 sekunder blev også sammenflettet. TTL udløser (0-5-0 volt) for at optage epoketidshændelser, der genereres via en LabJack USB-enhed (U3-LV, LabJack Corporation). Efter aktivering af laserscanningen ventede vi 60 sekunder, før vi startede den visuelle stimulering for at sikre nethinden tilpasset baggrundslysniveauet forårsaget af multi-fotonlaseren.

optomotorisk responsanalyse

individuelle 5 DPF-larver blev anbragt i en 35 mm petriskål indeholdende Danieau-opløsning. LCD-skærmen på en iPhone 5 (Apple) styret af en MacBook Pro (Apple) gennem Duet-skærm (Kairos Technologies) blev brugt til at vise sorte og hvide kvadratbølgegitter (85% kontrast, rumlig frekvens 0,33 cyklusser/mm, tidsmæssig frekvens 3,5 cyklusser/s), der bevæger sig i 4 retninger (90 liter vinkelafstand) i bunden af petriskålen. Visuelle stimuli blev genereret i Keynote (Apple). Hver larve blev testet 5 gange i alt (hvert forsøg varede 6 s efterfulgt af 10 s statiske gitter) og scorede i henhold til de forsøg, den reagerede på (dvs.fisk drejer og svømmer i retning af de bevægelige gitter). Larvernes opførsel blev visuelt overvåget ved hjælp af et M165 FC stereomikroskop (Leica).

analyse

funktionelle analyser

in vivo calcium imaging data blev analyseret som tidligere beskrevet22,33. Sammenfattende blev funktionelle tidsserier behandlet før analyse som følger: tidsseriebilleder fra hvert eksperiment blev korrigeret for bevægelse med en stiv kropsalgoritme (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), median filtreret med en kernestørrelse på 1 voksel for at fjerne mørk og skudt støj og rumligt udglattet med en 2D Gaussisk kerne = 2 vokser for at forbedre signal-til-støj. En baseline (B), der korrigerer for lavfrekvente drev, blev bestemt ved hjælp af en kubisk spline-algoritme, der ekstrapolerede mellem knuder i gennemsnit fra 5 s af interepoke-intervaldataene. Begge relative signalintensitetsforandringer (Kurf = F-B; hvor f = rå fluorescens) og normaliserede signalintensitetsændringer blev beregnet ved hver voksel. I forbindelse med en analyse af populationsfunktionalitet blev der anvendt en basal analyse, mens % ‘er/F0 blev anvendt til manuelt definerede regioner af interesse (Roi’ er). For hver voksel eller ROI blev det integrerede respons over epokeintervallet beregnet til at tilvejebringe en enkelt responsmåling af hver præsenteret retning af stimulusbevægelse. Integralet inden for hvert epokevindue er en sammenfattende metrisk mere modstandsdygtig over for mætningseffekter af calciumsonden end maksimal signalændring. En tærskel for hver voksel inden for en anskaffelsesbilledsekvens blev bestemt ud fra variansen af LARPF-ændringer i interepoch-intervallerne og null-tilstand, threshold = 5 dip SDS. Alle vokaler, der var supra-tærskel inden for mindst to visuelle præsentationsepoker, blev betragtet som visuelt lydhøre og udsat for yderligere karakterisering.

for at analysere retningen og orienteringsselektiviteten af visuelt responsive vokaler retnings – og orienteringsselektive indekser (DSI og OSI)40, baseret på monterede von-Mises eller gaussiske profiler41, blev beregnet sammen med et skøn for deres god pasform, R2. DSI blev defineret som(Rpref−Rnull)/(Rpref + Rnull), hvor Rpref, svaret på den foretrukne retning, var det integrerede respons over det foretrukne retningsepokinterval. Rnull blev ligeledes beregnet som det integrerede respons fremkaldt af retningen modsat den foretrukne retning. OSI blev defineret som(Rpref−Rorth)/(Rpref + Rorth), hvor Rpref, svaret på den foretrukne orientering, var det integrerede respons over det foretrukne orienteringsepokinterval. Rorth blev ligeledes beregnet som det integrerede respons fremkaldt af den ortogonale orientering. For at minimere cross talk og over-fitting forbundet med DSi og OSI målinger, en streng tilgang blev gennemført. For at blive betragtet som retnings-selektiv (DS) eller orienterings-selektiv (os) blev der anvendt gensidigt eksklusive kriterier: DS if DSi > 0.5 og OSI < 0.5; og OS if OSI >0.5 og DSI < 0.5. I begge tilfælde måtte godheden af pasform (R2) for henholdsvis DSi og OSI være >0,8; således forklarede de monterede kurver mindst 80% af de integrerede responser. En enkelt von-Mises-fordeling blev brugt til at passe svar fra DS-vokaler og estimere deres foretrukne bevægelsesretning vinkel fra midten af den monterede kurve. Summen af to von-Mises (180 liter vinkelafstand fra hinanden) blev brugt til at passe svar fra os-vokaler og estimere deres foretrukne orientering af bevægelsesvinkler fra centrene af de monterede kurver. Cirkulær varians blev også beregnet til sammenligning som en alternativ måling af orienteringsselektivitet (cirkulær varians < 0.4)41.

morfologiske analyser

til bestemmelse af hjernevolumen afbildet i 4 dpf nacre, casper og crystal Tg(elavl3:Gcamp6f) larver, vi beregnet antallet af gcamp6f + vokaler i hvert volumetrisk billede ved at anvende justeringen>tærskelfunktion efterfulgt af analysen>histogram>list kommando i ImageJ42. Derefter blev de opnåede værdier multipliceret med volumenet af en enkelt voksel (0,415 liter 0,415 liter 0,631 liter 3 = 1,086 liter 10-1 liter 3).

statistiske analyser

statistiske testresultater rapporteres i tal og Figurlegender. Statistiske analyser og tests blev udført ved hjælp af Prism 6 (GraphPad) eller MATLAB R2014b (Matematikværker). Før der udføres statistiske tests, beskrivende statistik (f.eks. normalitetstest for at se, om værdier kommer fra en Gaussisk fordeling eller F-test for at sammenligne afvigelser) blev brugt til at vælge den passende statistiske test (rapporteret i Figurlegender sammen med testresultater). Kriteriet for statistisk signifikans blev sat til p < 0.05.