det myeloide rum i det medfødte immunsystem består af en række celletyper, hvis funktioner inkluderer clearance af beskadigede og apoptotiske celler, antigenpræsentation, immunsuppression og beskyttelse af værten mod fremmede mikroorganismer.

monocytter repræsenterer en meget plastisk delmængde af celler, der komponerer det medfødte immunsystem. Disse celler er i stand til at krydse vaskulaturen og gennemgår differentiering i forskellige celletyper, når de udsættes for specifikke cytokiner. Cirkulerende monocytter klassificeres som enten ikke-klassiske eller klassiske og kan skelnes ved deres mønster af celle-overfladereceptorekspression. De klassiske monocytter i cirkulationen viser CD14++ + Hi / CD16 – / lo og er især til stede på infektionssteder eller sygdom (1,2).

humane ikke-klassiske monocytter i cirkulationen viser CD16+++Hi/CD14+ / lo overfladeekspression (1). Efter aktivering gennemgår monocytter flere morfologiske og biokemiske funktionelle ændringer, hvilket resulterer i monocytdifferentiering i nye celletyper, såsom makrofager (3).

I et paradigme, der betegnes klassisk aktivering, humane monocytter vise fænotypiske plasticitet, der kan udløses af udsættelse for Th1-respons—fremme af cytokin interferon-γ (IFN-γ) eller tumor necrosis factor α (TNF-α), samt endotoxin lipopolysaccharide (LPS) (4,5). Denne mekanisme for klassisk aktivering genererer M1-makrofager, som fungerer til at producere proinflammatoriske mediatorer, der giver værtsbeskyttelse mod bakterier og vira (6). Humane monocytter kan også differentieres til M2-makrofager ved eksponering for Th2-responsfremmende cytokiner, såsom interleukin-10 (IL-10) og transformerende vækstfaktor-Karri (TGF-Karri) (4,7). M2-makrofager udtrykker høje niveauer af CD206 (mannosereceptor) og CD163, producerer lave niveauer af proinflammatoriske cytokiner og fremmer sårheling og ombygning af matricen.dendritiske celler (DCs) er et andet sæt monocytafledte immunceller, hvis funktion er at præsentere antigener til T-celler for at initiere et adaptivt T-cellebaseret immunrespons. DCs kan stort set kategoriseres i tre undergrupper: klassisk (CDC ‘er), plasmacytoid (PDC’ er) og monocytafledt (modc ‘ er). CDC ‘ er findes typisk i lymfoide væv, milt, lymfeknuder og knoglemarv. PDC ‘ er ligner plasmaceller og findes typisk i blodcirkulationen (8). Monocytter kan differentieres til DCs, som ofte betegnes monocytafledte DCs (moDCs) efter eksponering for granulocytmakrofagkolonistimuleringsfaktor (GM-CSF) og IL-4 (9,10). modc ‘ er er rapporteret at udtrykke celleoverflademarkører CD80, CD83, CD86 og CD1a in vitro (11-13). Mens modc ‘ er adskiller sig fra makrofager i celleform og funktion, deler de ekspression af flere celleoverfladeantigener, herunder CD11c, CD206 og CD1a (14).

flere grupper har rapporteret vellykket differentiering af humane CD14 + monocytter til makrofager; imidlertid er mange af disse offentliggjorte protokoller forskellige. En almindelig variation blandt disse metoder er inklusion (15) eller udeladelse (16) af IL-6. En anden forskel mellem protokoller er behandlingstimingen. Denne mangel på sammenhæng mellem protokoller er problematisk.

for at løse disse problemer undersøgte og sammenlignede vi inklusion og udeladelse af IL-6 i cytokinbehandling anvendt i almindelige humane monocytdifferentieringsmetoder. Vi fandt ud af, at i mangel af IL-6 producerer disse strategier celler med en lav grad af homogenitet, hvilket kan give tvetydige eksperimentelle resultater. For det andet udviklede vi for yderligere at løse dette problem en ny faset in vitro-strategi med inkludering af IL-6. Vi fandt ud af, at denne strategi i høj grad forbedrede den cellulære homogenitet af M1-og M2-makrofager såvel som modc ‘ er, der blev differentieret fra humane CD14+ – monocytter. Denne forbedring af metodologien vil give forskerne bedre modeller til at undersøge immunsystemet og sygdomstilstandene.

materialer og metoder

Cellepræparater

Buffy coats blev opsamlet fra fuldblod fra fem eller flere raske mandlige donorer, der var blevet samlet. Mononukleære perifere blodceller (Pbmc ‘ er) blev fremstillet ud fra buffy coats ved Ficoll-pak (1,077 g/mL densitet) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscatve, NJ) densitetsgradientcentrifugering ved 400 liter g ved 18 liter C i 35 minutter for at adskille blodbestanddele. Celler blev vasket flere gange ved hjælp af 1 liter PBS og talt ved hjælp af en Neccelom Cellometer Auto T4 plus celletæller (Neccelom Bioscience, Laurence, MA). Når de blev talt, blev CD14+ monocytter isoleret fra Pbmc ‘ er ved magnetisk mærkning ved hjælp af MAB CD14 konjugerede mikroperler (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) efterfulgt af adskillelse ved hjælp af magnetiske søjler (130-042-401 og 130-042-302; Miltenyl Biotec) i henhold til producentens anvisninger med en undtagelse: ved opsamling af CD14+ – celler fra magnetkolonnen blev cellerne oprindeligt skyllet ud ved hjælp af 5 mL buffer, der kun var afhængig af tyngdekraften (uden brug af det medfølgende stempel). Efter den indledende 5 mL skylning blev der tilsat en yderligere 5 mL buffer og skyllet forsigtigt ved hjælp af det medfølgende stempel.

cellekultur

humane CD14+ monocytter blev podet ved en celletæthed på 2,0–3.0 liter 105 celler / mL i rpmi 1640-medium med 2 mM / L L-glutamin (Life Technologies, Frederick, MD) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penicillin (Life Technologies) og 100 mg/mL streptomycin (Life Technologies) ved 37 liter C i en befugtet 5% CO2-inkubator. For at differentiere celler i M1-makrofager var de anvendte cytokiner GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-Kurt (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) og endotoksin LPS (20 ng/mL). Til m2-makrofagdifferentiering var de anvendte cytokiner makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), IL-4, IL-6 og IL-13 i en koncentration på 20 ng/mL (PeproTech). modc ‘ er blev genereret ved tilsætning af GM-CSF (100 ng/mL) og IL-4 (20 ng/mL). Timingen af hver strategi er yderligere beskrevet i Figur 1.

Strømningscytometri

polariserede makrofager og DC ‘ er blev dyrket i 9 dage på 10 cm2 retter (Bd Falcon, Billerica, MA). På Dag 9 blev medier og ikke-klæbende celler opsamlet; klæbende celler blev vasket under anvendelse af 1 liter PBS, fjernet ved hjælp af celledissociation buffer (Life Technologies) og derefter tilsat til de opsamlede medier/ikke-klæbende celler, der skal vaskes. Suspenderede celler blev centrifugeret og vasket to gange (1 liter PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA), talt og derefter inkuberet med fluoroforkonjugerede primære antistoffer mod CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadherin (Aleksafluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE) og cd64 (FITC) i mørke i 45 minutter ved 4 liter C. fluorescens blev detekteret af en s3tm cellesorterer (Bio-Rad, Hercules, ca).

endocytoseanalyse

polariserede humane makrofager blev belagt i 4-brønds kammerglasrutschebaner (MA nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Valtham, MA) med en densitet på 3.0 105 celle / mL på Dag 7 og fortsatte med at blive dyrket med de passende cytokiner i de resterende 2 dage. Perylenbisimid (PBI-12-Man) (17) var en venlig gave fra Ke-Rang Vang ved Hebei Universitet. Celler blev dyrket med 10 liter/mL PBI-12-mand i 30 minutter ved 37 liter C, derefter vasket med 1 liter PBS. Celler blev fikseret ved hjælp af 70% ethanol og monteret med DAPI (P36962; Life Technologies). For at visualisere endocytose af PBI-12 Man blev dias ophidset og udsendt ved 585 nm. Røde fluorescensbilleder blev kvantificeret ved hjælp af Metafer-lysbilledscanningsprogrammer (MetaSystems, Boston, MA). Statistisk test blev dannet ved hjælp af MATLAB R2015a-programmet., Natick, MA). Rank-sum test blev udført for at teste for univariat statistisk signifikans mellem prøver.

immunofluorescens

makrofager blev differentieret under anvendelse af tidligere beskrevne metoder i 7 dage og derefter overført til Nunc Lab-Tek II 4-brøndglaskammerglas med de passende cytokiner. Celler blev efterladt til at vokse i de næste 7 dage; 14 dage efter den første plettering blev celler fikseret ved hjælp af 70% ethanol og monteret ved hjælp af Prolong Diamond anti-fade mountant med DAPI. Celler blev visualiseret ved hjælp af fasekontrast og fluorescensmikroskopi på EVOS FL Auto (Life Technologies).

resultater og diskussion

strategier og betingelser for human CD14+ monocytdifferentiering

Vi begyndte med at vurdere, hvilke strategier der var mest effektive til at producere homogene populationer af humane M1-og M2-makrofager såvel som modc ‘ er. Humane CD14 + monocytter blev isoleret og podet på vævskulturplader, der skulle differentieres til makrofager eller modc ‘ er in vitro. Vi testede derefter tre specifikke behandlingsbetingelser for at bestemme den metode, der gav de mest ensartede makrofag-og moDC-populationer. For den første betingelse dyrkede vi celler med tilsætning af kun GM-CSF eller M-CSF i 9 dage (Figur 1). Denne betingelse kaldes ” kun ” (Figur 1). Den anden behandlingsstrategi var at kontinuerligt udsætte celler for det gældende cytokinmiljø på dag 0, genopfylde medierne, cytokiner og LPS på dag 5 og analysere cellerne på Dag 9. Denne betingelse kaldes “kontinuerlig” (Figur 1). Den tredje strategi var at stimulere CD14 + – monocytter med enten GM-CSF eller M-CSF i 5 dage efterfulgt af tilsætning af friske medier indeholdende LPS for humane M1-makrofager og alle anvendelige cytokiner for en given behandlingsgruppe (GM-CSF, IFN-karrus og IL-6 for M1-makrofager eller M-CSF, IL-4, IL-13 og IL-6 for M2-makrofager). Denne behandlingsstrategi blev betegnet “faset” (Figur 1). Behandling af CD14 + monocytter med 100 ng/mL GM-CSF og IL-4 i 5 dage og udskiftning af medier og alle cytokiner på dag 5 genererede modc ‘ er. MoDCs blev derefter stimuleret med IL – 6 og LPS i 24 timer før analyse (dag 8) for at fremme DC modning og aktivering. Denne dyrkningsmetode blev betegnet” stimuleret ” (Figur 1). De modc ‘ er, der aldrig modtog IL-6 og LPS-eksponering, blev betegnet “ikke-stimuleret” (Figur 1). Efter 9 dages kultur under de specifikke betingelser beskrevet ovenfor blev celleoverfladereceptorekspression og cellefunktionalitet analyseret.

IL-6-eksponering øger m2-polarisationseffektiviteten in vitro

tidligere undersøgelser har vist, at makrofageksponering for cytokin IL-6 ikke kun skæver monocytdifferentiering fra en dendritisk celle til en makrofagfænotype, men at IL-6-eksponering også øger mRNA-ekspressionsprofilen forbundet med M2-makrofager (15,18). For at bekræfte disse fund og for at teste effekten af IL-6 på M1-og M2-polarisering blev humane CD14+ – monocytter under de kontinuerlige og fasede dyrkningsbetingelser behandlet med eller uden IL-6. Undersøgelse af M2-makrofagoverflademarkørekspression i M1-differentierede celler viste ingen signifikante ændringer, når de blev dyrket med IL-6 (figur 2), hvilket antyder, at IL-6-behandling ikke shunt M1-polariserede makrofager mod en M2-fænotype.

omvendt afslørede analyse af de kontinuerlige og fasede m2-makrofagkulturgrupper, at IL-6-behandling øgede ekspression af M2-makrofagoverflademarkører. I m2-makrofagpopulationer forblev både cd206-og CD36-ekspression høj og syntes uændret, når de blev udsat for IL-6 (figur 2, A og B). CD163 og E-cadherin viste imidlertid signifikante stigninger i overfladeekspressionsniveauer og populationshomogenitet, når de blev behandlet med IL-6 (figur 2, C og D). Dette demonstreres ved et fald i de lavudtrykkende CD163-og E-cadherin-toppe (røde pile i figur 2, C og D) og det resulterende skift mod en homogent højudtrykkende population.

IL-6 bruges ofte til at inducere modc modning (18,19). For at bestemme, om IL-6-behandling kunne resultere i uønskede modc ‘ er inden for de makrofagpolariserede populationer, moden DC-overflademarkør (CD83) – ekspression blev undersøgt. Strømningscytometrisk analyse viste, at ingen af M1-eller M2-dyrkningsbetingelserne fremmede nogen signifikant stigning i CD83-ekspression (figur 2e). Dette antyder, at der ikke var nogen moDC-forurening inden for disse makrofagpopulationer, eller at eventuelle forurenende modc ‘ er var IL-6 ufølsomme.

faset polarisering fører til øget ekspression af kanoniske M1 -, M2-og moDC-celleoverflademarkører

for at bekræfte, at humane CD14+ – monocytter var fuldt differentieret til enten makrofager eller modc ‘ er på Dag 9, strømningscytometri blev brugt til at analysere celle-overflademarkører og vurdere morfologiske forskelle (figur 3, A-C). Humane CD14 + monocytter blev differentieret (Figur 1) for at vurdere, hvilken strategi der ville give høj ekspression af celletype passende overflademarkører. Et panel af celleoverflademarkører blev testet for hver af celletyperne. Vores M1 celleoverflademarkeringspanel bestod af de kanoniske markører CD86 og CD80 (figur 3, A-C). Til m2-makrofagpanelet brugte vi CD206, CD163, CD124 (IL-4-receptor-lart), E-cadherin og CD36 (klasse B-scavenger-receptor) (figur 3, A-C). Til modc ‘ er blev CD83, CD86 og CD1a anvendt. Overfladeekspressionsniveauer for alle de testede markører blev bestemt for alle celletyper (supplerende figur S1). Median fluorescensintensitet (MFI) blev beregnet og vist som fold-ændring i forhold til den tilsvarende ufarvede kontrol (Se tabeller i figur 3).

interessant nok afslørede analyse af M2-celleoverflademarkørerne, CD36 og IL-4RA, i M1 GM-CSF-kun polariserede makrofager dramatiske stigninger (figur 3a). Når man sammenligner GM-CSF-kun behandlede celler med alle M1-behandlingsgrupper, havde den kun GM-CSF-gruppe markant højere CD36-ekspression. Disse kun GM-CSF – celler udtrykte også lave niveauer af de M1-associerede markører CD86 og CD80. Tilsvarende gav den kontinuerlige tilstand celler, der ikke kun var lave i CD86 og CD80, men også var høje i CD36 og IL-4RA-ekspression. Omvendt, når humane CD14+ monocytter blev differentieret under M1-faset tilstand, blev CD86 og CD80 mærkbart opreguleret, mens CD36 og IL-4RA-ekspression forblev lav. Yderligere strømningscytometrisk analyse af celle-overflademarkørekspression afslørede, at M1-makrofager havde lavere ekspression af CD206, CD36 og CD163 i forhold til M2-makrofager under både faset og kontinuerlig eksponering (supplerende tal S1 og S4). Derudover genererer disse forskellige dyrkningsbetingelser celler med forskellige morfologiske træk og struktur (figur 3a). Mens GM-CSF-kun behandlede celler ser ud til at være større, afslørede data om fremadspredning (FSC) minimale forskelle i størrelse mellem grupperne (supplerende tal S2 og S3). Sammenligning af intern kompleksitet (SSC) mellem behandlingsbetingelser afslørede en stigning i granularitet i GM-CSF og fasede grupper (supplerende figur S2). Tilsammen viser disse resultater, at kun GM-CSF og kontinuerlig behandling giver celler, der udtrykker lave niveauer af M1-markører og høje niveauer af visse m2-markører samt udviser morfologiske ændringer.

m2 makrofagkulturbetingelser gav lidt mere tvetydige resultater end dem, der blev fundet med M1 makrofagkulturbetingelserne (figur 3b). I forhold til kun m-CSF-gruppen viste de fasede og kontinuerlige grupper øgede ekspressionsniveauer af CD206. Omvendt var IL – 4RA overfladeniveauer markant højere I m-CSF-kun forhold i forhold til både kontinuerlig og faset. E-cadherin-ekspression forblev ensartet på tværs af grupper, mens CD163 var signifikant højere i både m-CSF-kun og fasede grupper. En observation af note er, at den kontinuerlige eksponeringsgruppe konsekvent var langt mindre homogen med hensyn til celle-overflademarkørekspression. Dette illustreres af den bimodale fordeling og store varians i ekspressionsniveauer, der findes på histogrammet. Derudover kan dramatiske morfologiske forskelle ses mellem behandlingsgrupperne. Baseret på fasekontrastbillederne producerede M-CSF-gruppen kun celler, der ser ud til at være mindre og meget granulære (figur 3b). Strømningscytometrisk analyse viser, at disse celler har lignende størrelse (FSC), men der er en stigning i cellulær granularitet i de fasede og kontinuerlige behandlingsbetingelser (supplerende figur S2). Endelig ændrede glutaminmangel m2-polarisering, hvilket viste, at metaboliske produkter er nødvendige under denne strategi (supplerende figur S5). Alt i alt antyder disse data, at de fasede forhold giver den største effektivitet for m2-makrofagpolarisering.

Vi undersøgte derefter overflademarkørekspression af modc ‘ er, der ikke blev stimuleret eller stimuleret med IL-6 og LPS 24 timer før strømningscytometrisk analyse. Stimulering med IL-6 og LPS resulterede i en stigning i cd80 -, CD83-og CD86-ekspression (figur 3c). Moden DC-markør CD83 celleoverfladeekspression steg dramatisk ved aktivering ved hjælp af IL-6 og LPS på Dag 8 i forhold til den ikke-stimulerede gruppe. Dette bekræftede, at IL – 6 og LP ‘ er var i stand til at fremme dendritisk cellemodning (supplerende figur S1L). CD1a-udtrykket forblev ensartet mellem de ikke-stimulerede og stimulerede grupper. Interessant nok forblev de stimulerede DC ‘ er i suspension, men de syntes at begynde at aggregere og klæbe til hinanden (figur 3c). Disse resultater bekræfter tidligere fund vedrørende modc-polarisering og giver en yderligere kontrol til overflademarkøranalyse for at identificere uønskede moDC-populationer inden for de forskellige makrofagkulturbetingelser.

M2-makrofager genereret ved faset cytokineksponering har M2-associeret funktionalitet

mannosereceptoren (CD206) er en endocytisk og genanvendelsesreceptor, der udtrykkes stærkt i vores m2-makrofagpopulationer under fasede behandlingsbetingelser. Vi ønskede derefter at vurdere CD206-medieret endocytisk optagelse i vores makrofager. Dette blev bestemt ved anvendelse af PBI-12-Man, et biokompatibelt middel, der fluorescerer ved binding til mannosereceptoren (17). Efter en 1 timers behandling af både M1-og M2-makrofager med PBI-12-Man var den røde fluorescens af PBI-12-Man overvejende intracellulær i m2-makrofager under fasede og kontinuerlige behandlingsbetingelser (figur 4, A og B). Dette fund antyder, at celleoverfladebinding til CD206 og endocytose resulterer i vesikulær lokalisering. Dette stemmer overens med de tidligere data fra strømningscytometri, som viste, at M2-makrofagerne under fasede behandlingsbetingelser viste en højere celleoverfladeekspression af CD206 i forhold til M1-makrofagpopulationen. Interessant nok fandt vi, at kun GM-CSF-celler viste høje niveauer af PBI-12-Mands endocytose (figur 4, A og B). Dette korrelerer med vores strømningscytometriske data (figur 2), som viste, at GM-CSF-kun dyrkningsbetingelser producerer M1-celler med M2-associeret overflademarkørekspression. Alt i alt demonstrerer vi, at disse celler havde de normale egenskaber ved makrofager, og at CD206 var funktionel i m2-makrofagpopulationen.

efter 14 dage i kultur viste m2-makrofager også evnen til at smelte sammen og nåede over 200 liter i størrelse og indeholdt flere kerner pr.celle (figur 4c). Disse lignede multi-nukleerede gigantiske celler (Mngc ‘ er), der er rapporteret at have fagocytiske og andre evner (20). Derudover har Mngc ‘ er været forbundet med fremmed materiale i kroppen, tuberkulose og kræft (20-23). Denne cellulære fusion blev udelukkende fundet i Vores m2-makrofagpopulationer og var langt mere signifikant i m2-faset tilstand. Mens m-CSF-kun-grupperne havde nogle multinucleated celler (figur 4c), var deres størrelse og tal meget lavere end den fasede gruppe. I betragtning af disse cellers evne til at udføre denne makrofagassocierede funktion indikerer disse resultater yderligere, at de fasede dyrkningsbetingelser producerer stærkt M2-lignende makrofager.

Her beskrev vi vores nyudviklede faseprotokol til makrofagpolarisering. Vi fandt ud af, at inkluderingen af IL-6 og faset polarisationsbehandlingstiming er absolut kritisk for at generere de mest M1 – og M2-lignende makrofager in vitro. Dette fund blev testet strengt sammenlignet med andre polarisationsmetoder. Af den grund mener vi, at den fasede polarisationsmetode giver et væsentligt skridt fremad. Dette vil give forskere ensartede eksperimentelle standarder til at producere homogene populationer af makrofager til brug in vitro og evnen til at sammenligne deres resultater. Mens denne protokol tilbyder en række forbedringer sammenlignet med de nuværende polarisationsstrategier, mener vi, at yderligere forskning og optimering af eksponeringstider og cytokincocktailen ville være nyttig. Dette vil hjælpe os med yderligere at forstå de komplekse roller M1 og M2 makrofager i forskellige former for sygdomsprogression og fremme udviklingen af nye terapeutiske midler.

anerkendelser

forskning til denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute-tilskud U54CA143803, CA163124, CA093900, CA143055, UNCF / Merck Postdoc-prisen for forskningsstipendier (JC) og af en samarbejdspris fra Medimmune, LLC. Vi takker Amanda brun, Dionna, J. James Frost, Kris Sachsenmeier (MedImmune, LLC.), Robert Holstebro (Medimmune, LLC.), David M. Mosser (University of Maryland), Susanne Ostrand-Rosenberg (University of Maryland – Baltimore County), Cherie Butts (Biogen) og Donald S. Coffey for deres frugtbare diskussioner om dette arbejde. Dette dokument er underlagt NIH ‘ s politik for offentlig adgang.