Dette er den første i en tredelt serie om transformation af E. coli. Ved udgangen af dette bør du være ekspert på E. coli transformation og på hvilke stammer at vælge til forskellige applikationer. Hvis du allerede er ekspert, håber jeg, det vil være en fornøjelig genopfriskning for dig. I begge tilfælde, bedes kommentere nedenfor, hvis du har noget at tilføje.

brug af elektricitet til Transformation

fremmed DNA kan indføres i Kompetent E. coli ved hjælp af elektroporation eller kemisk transformation. Når du bruger elektroporation, anvender du en elektrisk strøm over cellen. Strømmen menes at skabe øjeblikkelige “porer” i cellemembranerne, som tvinger det negativt ladede DNA ind i cellerne ved en elektroforese-type effekt. For at gøre elektro-Kompetent E. coli, vask cellerne grundigt for at fjerne alle mediumsalte. Dette sikrer, at ladningen ikke udføres gennem mediet. Udfør også elektroporationen ved 0 liter C for at minimere varmeskader på cellerne.

kemikalier: de arbejder også

for at fremstille kemisk kompetente celler, resuspend E. coli i en CaCl2-opløsning ved 0 liter C. Under disse betingelser menes Ca2 + – ionen at skabe porer i membranen, hjælpe med at binde DNA ‘et til cellemembranen og maskere den negative ladning på DNA’ et. Sammen letter disse passagen af DNA gennem den hydrofobe cellemembran. Tving DNA ‘et ind i cellerne ved at anvende et kort 42 liter C varmechok, hvilket resulterer i en termisk strøm, der fejer DNA’ et ind i cellerne.

fordele og ulemper ved hver

elektroporation er mindre besværlig end kemisk transformation og giver generelt højere transformationseffektivitet (målt i kolonier dannet pr.mikrogram DNA). Det er dog dyrere. Det kræver et specialiseret apparat til at levere ladningen og kuvetterne for at overføre ladningen til cellesuspensionen. Elektroporation er følsom over for salt-du kan miste dyrebare prøver, hvis overskydende salt overføres til kuvetten.

personligt foretrækker jeg kemisk transformation. Selvom det tager omkring en halv time længere, finder jeg, at resultaterne er mere forudsigelige, og jeg kan godt lide det faktum, at der kan tilsættes et større volumen DNA, hvis koncentrationen er for lav. Du kan ikke øge mængden af DNA med elektroporation på grund af risikoen for at tilføje for meget salt til opløsningen. Selvom den almindeligt citerede ulempe ved kemisk transformation er dens lavere effektivitet, kan du nu købe ultrakompetente celler, som f.eks.

artikler i denne serie:

• E. coli elektroporation vs kemisk Transformation (denne artikel)
• Kompetent E. coli: at købe eller ikke at købe?
• valg af en kompetent E. coli stamme

oprindeligt offentliggjort den 18. September 2007. Revideret og opdateret den 11. juli 2016.