bidraget af Paul Barber
DNA-ekstraktion via Cheleks
Cheleks er berygtet for at være så vægelsindet som det er billigt og nemt. Her er nogle tips til gode forstærkninger: 1. Nogle gange prøverarbejde bedst, hvis det bruges straks, nogle gange er det bedre at vente natten over, før du bruger dem. Eksperimenter og find ud af, hvad der fungerer for din Art. Resultaterne kan variere efter takst.2. Når du laver indledende PCR ‘ er, skal du foretage en seriel fortynding af skabelonen.Mængden af DNA-ekstraktion anvendt i en PCR kan være så høj som halvdelen af PCR-volumenet eller så lav som 1 mikroliter af en 1:10.000 fortynding. Jeg finder ud af, at 1 mikroliter af en 1:1 er god til de fleste applikationer.3. Hvis du ikke får forstærkninger fra din PCR første gang med et Cheleksekstrakt, skal du gentage hvirvel, spin, inkubere, hvirvel, spin, sidde natten over procedure beskrevet ovenfor. Ofte vil dette gøre et negativt PCR-arbejde.
metode liter
- steriliser en tør reagensspatel med blegemiddel og en lille magnetisk omrørestang.
- Forbered en 5-10 vægtprocent opslæmning af Cheleks100 harpiks (Biorad del 143- 3832,100-200 natriumform) og UV-steriliseret HPLC-vand. Den mest effektive måde at gøre dette på er at tage et 50 ml sterilt falcon-rør, placere på en skala inde i et lille bægerglas og nul skalaen. Tilsæt derefter 5 gram Cheleks og fyld til 50 ml mærket med vand.
præcision er ikke kritisk. Steril teknik er.
- anbring steril stirbar i røret og læg den på magnetisk omrører. Hvis gyllen ikke er godt blandet, vil dine koncentrationer og resultater være variable. Hold opslæmningen godt blandet, alikvot 300 – 500micro liter i 0,6 eller 1,6 ml eppendorf rør (igen, steril) og hætte straks. Hvis du har adgang til en laminær strømningshætte, er det et godt sted at gøre alt dette. Det kan være en god ide at tørre vægten og omrøreren ned med en 10% blegemiddelopløsning og/eller UV-sterilisering inden brug.
- Tænd for varmeblokken. Sæt til 95 liter C. Fyld huller med vand.
- brug sterile tang (flamme over alkoholbrænder flere gange for at sterilisere), Fjern et lille stykke væv fra din prøve. Dette stykke væv skal være stort nok til at være synligt, men ikke så stort, at det er let synligt. Forestil dig at skære en 0,2 mm sektion af en standard hæfteklammer. Dette er meget stort. For meget væv kan hæmme dine reaktioner.
steriliser tang mellem prøver.
- når du er færdig, lav en negativ Cheleks kontrol ved at dyppe dine steriliserede tang i et rør af Cheleks gylle.
- Hvirvelprøve og cheleksopslæmning i 10-15 sekunder.
sørg for, at lågene er fastgjort tæt, inden du begynder.
- Spin prøver kort ved høj hastighed i en mikrocentrifuge
- inkuber prøver i 20 minutter ved 95 liter C
*bloktemperaturen kan falde lidt, når du udfører dette trin. Dette fald er normalt. Kontroller rørene, mens de inkuberes for at sikre, at lågene ikke er sprunget af.*
- Hvirvelprøver igen i 10-15 sekunder.
vær forsigtig, da damp kan sprænge låget af centrifugerøret. Hold lågene nede.
- Spin rør igen ved høj hastighed i mikrocentrifuge.
- prøver er klar til brug.
brug kun supernat til PCR-reaktioner. Vil inaktivere Tak!
denne metode er baseret med tilladelse på en original protokol, der er tilgængelig her.
