systemisk agonistisk cancerimmunterapi inducerer differentiel ekspansion af CD4-og CD8-T-lymfocytter i lymfoide og perifere organer

kombination af anti-CD40 med IL-2 har vist sig at inducere forsinket vækst og regression på tværs af flere murine tumormodeller . I lighed med offentliggjorte data ved hjælp af cellelinjetumormodeller førte behandling af brystets intraepiteliale neoplasi-udvækst (min-O) model, en vævstransplantationslinje med anti-CD40 og IL-2 immunterapi (IT) til signifikante antitumorresponser (P = 0,0057) inklusive regression i >50% af de behandlede mus (yderligere fil 1: Figur S1A). Tidligere undersøgelser har vist, at disse antitumorresponser skyldes CD8 T-celler derfor vurderede vi t-cellefænotype i milten såvel som i tumoren og lungerne (et almindeligt metastatisk sted for mange forskellige tumormodeller). Mens vi bemærkede terapi generelt induceret CD8-ekspansion på tværs af alle organer, bemærkede vi nogle forskelle i CD8 T-cellehukommelsesfænotype på tværs af organsteder (yderligere fil 1: Figur S1B-C).

vi og andre har tidligere vist, at stærke immunstimulerende terapier for kræft inducerer kraftig proliferation af hukommelse (Cd44høj) CD4 og CD8 T-celler i milten og lymfeknuder . Det blev også observeret, at CD4, men ikke CD8, T-celler også gennemgår aktiveringsinduceret celledød på en interferon(IFN) – kur-afhængig måde, hvilket resulterer i ubetydelig samlet ekspansion af CD4 T-celler med tal i disse samme organer sammenlignet med baseline . Disse data blev genereret ved hjælp af lymfoide organaflæsninger. Imidlertid, i lyset af fænotyper observeret i MIN-O-lejet, immunterapibehandlede mus, ekspansion, aktivering, og apoptose af aktiverede T-celler kan påvirkes differentielt i det perifere væv. Derfor forsøgte vi yderligere at karakterisere og sammenligne t-celleaktivering i perifere organer (hvor den primære tumor og/eller metastatiske læsioner kan opholde sig) og sekundære lymfoide organer (som ofte undersøges under immunterapeutiske undersøgelser for at vurdere virkningsmekanismer). Vi evaluerede CD8 og CD4 T celle (Rævp3neg) frekvens, ekspansion og apoptose systemisk i både lymfoide og perifere organer. I overensstemmelse med tidligere rapporter fra vores gruppe, mens de ikke ændrer deres samlede hyppighed væsentligt (Fig. 1A), anti-CD40/IL-2 immunterapi resulterede i signifikant ekspansion i det samlede antal CD8 T-celler i Milter og lymfeknuder (Fig. 1b). I takt med stigningen i det samlede antal CD8-celler blev hyppigheden af CD8-T-celler, der inkorporerede bromodeoksyuridin (BrdU) in vivo, signifikant udvidet, og andelen af apoptotiske celler vurderet ved ekstracellulær anneksin V-ekspression var ikke signifikant forskellig fra kontrollerne (Fig C-D). I modsætning hertil faldt den samlede CD4 T-cellefrekvens, og antallet ændrede sig ikke signifikant sammenlignet med kontroller inden for de samme organer (Fig. 1a-b). Mens CD4 T-celler ekspanderede som vurderet ved brdu-inkorporering, gennemgik en betydelig del af dem også apoptose (Fig. 1c-d) resulterer i en netto ubetydelig ændring i det samlede antal. Disse data var i overensstemmelse med det, der tidligere blev observeret . Da vi vurderede ikke-lymfoide organer inklusive lunger og lever, så vi lignende tendenser i både CD4-og CD8-T-celler, nemlig at CD8-T-celler ekspanderede og overlevede på tværs af alle organer, der fulgte det (Fig. 2a-b) der henviser til, at CD4 T-celler (Rævp3neg) ekspanderede og samtidig gennemgik apoptose i lignende grad, hvilket resulterede i ubetydelige ændringer i både deres frekvenser og tal (Fig. 2c-d) i periferien.

t-cellehukommelsesfænotyper varierer mellem sekundære lymfoide organer og perifere ikke-lymfoide væv i CD8 T-celler, men ikke CD4 T-celler, der følger efter det

hos mus kan CD4-og CD8-T-celler yderligere kategoriseres i hukommelse og Na-larvefænotyper baseret på CD62L (L-selectin) og CD44-ekspression med cd44-lavcd62l+ – populationen betragtes som na-larve (TN), cd44highcd62l+ – populationen betragtes som central hukommelse (TCM) og cd44highcd62lneg-populationen betragtes som effektor-og/eller effektorhukommelse (te/em). Det er kendt, at CD4-og CD8-T-celler adskiller sig i deres fordeling af disse undergrupper i lymfoide og perifere organer. Mens na-larvefrekvenser inden for CD4-og CD8-populationer forbliver relativt ens, er Cd44høj population mere central hukommelse skæv i CD8 T-celler og effektorhukommelse skæv i CD4 T-celler i en hvileorganisme . I de perifere organer er vævsbestandige T-celler i både CD4-og CD8-T-celleundersætene overvejende af effektorhukommelsesfænotypen .

tidligere undersøgelser har vist, at hukommelsesfænotypeceller (CD44high) er den vigtigste celletype, der ekspanderer efter stimulerende immunterapier . For bedre at forstå sammensætningen af CD4-og CD8-T-celler på tværs af forskellige organer vurderede vi deres hukommelsesfænotypestatus i hvert organ, der fulgte den. I hvile var Cd44høj population af CD8 T-celler i lymfoide organer overvejende TCM (>90%), mens det i perifere organer var en kombination med ~60% TCM (Fig. 3a, c, e, – f). Generelt resulterer det i en samlet udvidelse i Cd44høj frekvens på tværs af alle organer. TCM-frekvenserne var enten uændrede eller lidt forøgede, mens TE/EM-populationerne ekspanderede markant (Fig. 3e-f) fra ~10% til 30% i lymfoide organer og imponerende fra ~30-85% i perifere organer.

inden for Cd44høj population af CD4 T-cellerne var hvilende mus mere skævt mod TE / EM-fænotypen med ca.60-70% i lymfoid og 75-95% i perifere væv (Fig. 3b, d). Som det skete i CD8 T-cellerne, fulgte den Cd44høj andel udvidet, men på grund af det faktum, at det var så stærkt skævt til TE/EM-fænotypen på tværs af alle organer i hvilende mus, frekvenserne af CD4 TE/EM var stort set konsistente på tværs af alle organer i IT-behandlede mus (Fig. 3e). TCM CD4-frekvenserne forblev relativt lave og konsistente på tværs af alle organer, både før og efter det (Fig. 3f).

ekspression af aktiveringsmarkører i CD4-og CD8-T-celler er afhængig af placering og hukommelsesfænotype

ud over forskelle i proliferation og apoptose har vi også rutinemæssigt bemærket, at CD4-og CD8-T-celler differentielt opregulerer aktivering og hæmmende molekyler, der følger den. Det mest bemærkelsesværdige eksempel på dette er PD-1, som baseret på undersøgelser med fokus på sekundære lymfoide organer (milt og LN) fortrinsvis blev opreguleret på CD4 og ikke CD8 T-celler og menes sandsynligvis at være involveret i den præferentielle AICD-proces, der fandt sted i CD4, men ikke CD8 T-celler efter den . Et andet eksempel ville være den præferentielle opregulering af NKG2D på CD8 T-celler, men ikke CD4, der giver tilskuerinduceret lytisk evne efter stærk cytokineksponering for CD8-delmængden i hukommelsen. Tidligere undersøgelser foretaget af vores laboratorium samt data præsenteret i Fig. 3 har vist, at blandt både CD4-og CD8-T-celler er de primære celler, der aktivt prolifererer og reagerer på det, CD44high memory fænotype celler . Derfor fokuserede vi derefter på denne befolkning.

i Cd44høj population er det blevet vist, at de prolifererende CD8 T-celler undlader at opregulere markører, der er i overensstemmelse med aktivering af en antigenspecifik stimulus, såsom CD25 og PD-1, men alligevel opregulerer markører, der giver dem mulighed for at erhverve en tilskuerfænotype, nemlig NKG2D, hvilket giver evnen til at handle mere på en NK-lignende antigen ubegrænset måde. Omvendt Cd44høj, prolifererende (Rævp3neg) CD4 T-celler uforholdsmæssigt opregulerer PD-1 (i modsætning til CD8 T-celler og Rævp3+, regulerende CD4 T-celler), som vi har foreslået, tillader dem at være fortrinsvis målrettet mod induktion af apoptose . I overensstemmelse med disse tidligere rapporter observerede vi lignende fænotyper blandt milt-og lymfeknude bosiddende, it-behandlede CD44highCD8+ T-celler, som signifikant opregulerede NKG2D, men ikke PD-1 (Fig. 4A, c) og CD44highCD4+ T-celler, som robust opregulerede PD-1, men ikke NKG2D (Fig. 4b, d). Da vi vurderede de samme fænotypiske markører i T-cellepopulationerne, der var bosiddende i perifere, ikke-lymfoide organer, var CD44highCD8+ t-cellefænotypen væsentligt forskellig fra dem, der var bosiddende i de sekundære lymfoide organer. Mens CD44highCD8 + T-celler, der var bosiddende i lungerne og leveren, stadig var NKG2D+CD25neg (Fig. 4A, c), hyppigheden af nkg2d+ celler i denne population syntes at stige fra 20-30% i lymfoide organer til 40-50% i perifere organer (Fig. 4a). I modsætning til lymfoide organer, hvor PD-1-ekspression var uændret, blev PD-1-ekspression øget signifikant i både lungerne og leveren efter det i cd44highcd8+ – populationen (Fig. 4c). Omvendt var cd44highcd4 t-cellefænotype bemærkelsesværdigt lig milt og lymfeknude CD4 T-celler på tværs af alle organer (Fig. 4b, d) med sammenlignelig ekspression af PD-1 og minimal opregulering af NKG2D. CD25 blev ikke opreguleret i CD4-eller CD8-T-celler på noget sted (data ikke vist). Dette var uventet, fordi vi tidligere har antydet, at differentiel ekspression af PD-1 sandsynligvis var den underliggende mekanisme for differentiel induktion af apoptose mellem CD4-og CD8-T-celler efter stærke, immunstimulerende it-regimer. Men i de perifere organer er CD4 T-celler fortsat uforholdsmæssigt påvirket af apoptose på trods af at PD-1-ekspression er sammenlignelig mellem CD4 og CD8 T-celler. Dette mønster, der opstod, var også interessant, fordi det øgede aktiveringsmarkørudtryk i periferien syntes at korrelere direkte med te/EM-overvægt, især i tilfælde af PD-1.

det er for nylig blevet vist, at cirkulerende TE/EM-celler udtrykker forhøjede niveauer af PD-1 I Hvile mennesker . Derfor antog vi, at CD8+ TE/EM-celler fortrinsvis kan udtrykke disse aktiveringsmarkører frem for CD8+ TCM, hvilket resulterer i differentielle frekvenser af CD44highCD8+ T-celler, der udtrykker aktiveringsmarkører i sekundære lymfoide og perifere organer efter det. Derfor evaluerede vi nkg2d og PD-1 ekspression på CD8 + CD44highCD25neg TE/EM og TCM celler på tværs af alle organer i hvile og IT-behandlede mus. I kontrolmus, både NKG2D (Fig. 5a) og PD – 1 (Fig. 5c) blev udtrykt med en højere frekvens på TE / EM-delmængden af CD8 + CD44highCD25-populationen. Imidlertid er den samlede frekvens af TE / EM-populationen blandt CD8 + T-celler i hvilende mus relativt lav sammenlignet med TCM (cirkeldiagrammer Fig. 5a) er derfor generelt udtrykket af både PD-1 og NKG2D overvejende lavt (Fig. 4) Da TCM udgør størstedelen af CD8+ T-celler i hvile. I de immunterapibehandlede mus blev både nkg2d og PD-1 ekspression øget på tværs af alle organer (Fig. 4). Endnu en gang, både NKG2D (Fig. 5b) og PD – 1 (Fig. 5d) blev udtrykt mere højt på TE / EM CD8 + T-cellerne end TCM CD8+ T-cellerne. I lymfoide organer, hvor TE/EM-populationen ekspanderede sammenlignet med kontrol, var den stadig signifikant mindre end CD8+ TCM-celler (cirkeldiagrammer, Fig. 5b) resulterer i mindre signifikante udvidelser på disse steder. I modsætning til lymfoide organer udgjorde CD8+ TE/EM-celler størstedelen af de perifere organer, der blev analyseret (cirkeldiagrammer, Fig. 5b) derved gør det samlede udtryk for NKG2D og PD-1 signifikant højere på disse steder. Igen er det vigtigt at bemærke, at i lymfoide organer af immunterapibehandlede mus var den samlede ekspression af begge aktiveringsmarkører signifikant lavere end i perifere organer på grund af TCM-skævheden i lymfatiske stoffer over periferien i CD8-populationen. Ekspressionsniveauerne varierede ikke meget blandt TE / EM fra forskellige organer (der var ingen signifikante forskelle mellem lymfoide og perifere organer) inden for de samme behandlingsgrupper, men steg generelt i IT-behandlet sammenlignet med kontrol, en tendens, der var mere markant udtalt med NKG2D end PD-1 (Fig. 5). I modsætning hertil forblev TCM-aktiveringsmarkørekspression relativt konstant ikke kun blandt organer fra mus inden for en behandlingsgruppe, men også mellem kontrol-og IT-behandlede grupper (Fig. 5a-b). Samlet set antyder disse data, at sammensætningen af hukommelse/aktiveret pool (TCM vs TE/EM) vejer tungt på fænotypen af den aktiverede T-cellepopulation, især med CD8 T-celler, da deres sammensætning varierer meget mellem lymfoide og ikke-lymfoide organer.

vurdering af T-celler fra patienter, der får højdosis systemisk immunstimulerende terapi

dernæst ønskede vi at vurdere, om disse resultater blev oversat til humane patienter, der fik immunstimulerende terapier for kræft. Der er i øjeblikket ingen forsøg, der vurderer kombinationsagonistisk anti-CD40 med rekombinant human IL-2, men vi har rutinemæssigt sammenlignet vores kombinationsbehandling med andre systemiske immunstimulerende behandlinger inklusive højdosis TLR-agonister og højdosis systemisk cytokinbehandling og vist lignende fænotypiske og funktionelle ændringer i T-celler som observeret i vores prækliniske model . For at vurdere, om patienter i klinikken viste lignende ændringer i overflademarkørekspression, indsamlede vi perifere blodmononukleære celler (Pbmc ‘ er) fra metastatiske melanompatienter, der gennemgik systemisk højdosis IL-2-behandling. Patienterne fik 6h10^5 IE / Kg hver 8.time for en planlagt total på 14 doser. Pbmc-prøver blev indsamlet en dag før behandlingsstart (baseline) eller på dag 8 i den første behandlingscyklus (dag 8) for at vurdere t-cellefænotype. Sammenligning af baseline-og dag 8-prøver var der en signifikant stigning i PD-1+ hukommelsesfænotype (CD45RO+) celler i både CD4-og CD8 T-celleundersæt efter IL-2-behandling med høj dosis (Fig. 6a-c). Når denne population yderligere blev opdelt i central hukommelse (CD62L+) og effektor/effektorhukommelse (CD62L-) på tidspunktet dag 8, udtrykte effektor/effektorhukommelsesundersættet signifikant højere PD-1-ekspression end den centrale hukommelsesundersæt (Fig. 6d-e). Sammen korrelerer disse data med det, der blev observeret i murine undersøgelser, hvilket tyder på, at disse data er anvendelige til humane studier og kan være en indikator for, hvad der forekommer lokalt.