2. Regulering af Cysteinkatepsinaktivitet

aktivering af cystein er et af de vigtigste midler til regulering af cathepsinaktivitet. Alle katepsinerne syntetiseres nemlig som inaktive cymogener og aktiveres i det sure miljø i de endolysosomale vesikler. Den molekylære mekanisme for deres aktivering var forvirrende i lang tid. Den kritiske information kom fra kombinationen af strukturelle undersøgelser af procathepsiner B, K og L, som viste, at propeptidet løber gennem det aktive sted for cathepsiner i den modsatte retning af substratet, hvilket udelukker spaltningen af propeptidet i molekylet uden enorme og energisk ugunstige strukturelle bevægelser af propeptidet og derved eliminerer den unimolekylære mekanisme , der oprindeligt blev foreslået, og detaljerede kinetiske undersøgelser, som tydeligt viste, at aktiveringen af cathepsin B er en bimolekylær proces . Den nuværende model, der hovedsagelig er baseret på cathepsin B-undersøgelserne, antyder, at propeptidet i cathepsinsymogen skifter mellem to konformationer, den såkaldte “lukkede” og “åbne.”I den” lukkede ” konformation, begunstiget ved neutral til let sur pH, blokerer propeptidet det aktive sted og forhindrer substrathydrolyse, hvorimod propeptidet i den “åbne” form, begunstiget ved sur pH under pH 5,0, fjernes fra den aktive sidespalte, hvilket resulterer i en lav katalytisk aktivitet af cymogenet. Denne aktivitet er tilstrækkelig til at aktivere et andet katepsinsymogen i et eller flere trin og derved starte kædereaktionen, hvor en sådan fuldt aktiv moden katepsin B behandler størstedelen af dens molekyler .

de andre vigtige regulatorer af cysteinkatepsiner er makromolekylære hæmmere, der binder til det aktive sted og derved forhindrer forening af peptidasen med dets substrat. De tilhører flere forskellige familier, herunder cystatinerne, thyropinerne og serpinerne, der ud over serinproteaser også kan hæmme flere katepsiner .

3. Glycosaminoglycaner som vigtige regulatorer af Cysteinkatepsinaktivitet

glycosaminoglycaner (gag ‘ er) er heteropolysaccharider sammensat af gentagne disaccharidenheder med en høj negativ ladning. Dette er et resultat af tilstedeværelsen af flere carboksyl grupper og sulfat substitutioner. De fleste gag ‘ er er sulfaterede, herunder chondroitinsulfater (CS), keratansulfat (KS), dermatansulfat (DS), heparansulfat (HS) og heparin, mens hyaluronan (HA) er den eneste ikke-sulfaterede GAG. I de senere år har GAGs vist sig som vigtige regulatorer af cysteinkatepsiner med forskellige effekter på deres mål. Traditionelt var cysteinkatepsiner blevet betragtet som lysosomale proteaser og havde ligesom andre lysosomale symptomer været kendt for at være hæmmet af intralysosomale GAGs i hvilende lysosom . I dag er cysteinkatepsiner imidlertid etableret som store aktører i ekstracellulær proteolyse . Deres handling i det glycosaminoglycanrige ekstracellulære miljø rejste spørgsmål om samspillet mellem cysteinkatepsiner og GAGs uden for lysosomet. De to grupper af endogene humane cysteinkatepsiner, der oftest er forbundet med ekstracellulær proteolyse, er cathepsin L-lignende proteaser (cathepsin K, L, S og V hos mennesker) og cathepsin B . Data akkumuleret i løbet af de sidste to årtier viser, at samspillet mellem disse peptidaser og gag ‘er går begge veje; cysteinkatepsiner er i stand til at spalte proteoglycan-kerneproteiner og derved frigive gag’ er fra deres støtte, mens gag ‘ er igen påvirker både aktiviteten og stabiliteten af cysteinkatepsiner i det ekstracellulære rum.

reguleringen af papainlignende cysteinpeptidaser med GAGs blev først beskrevet for cathepsin L . I disse tidlige værker blev det konstateret, at gag ‘ er og forskellige negativt ladede overflader i det væsentlige fremskynder aktiveringen af katepsin L-mymogenet i den modne form, inklusive ved pH tæt på neutralen, såsom også fundet i det ekstracellulære miljø under forskellige sygdomsbetingelser. Dette er blevet bekræftet for flere andre cathepsiner, den vigtigste er cathepsins B og S, og endda for en T. congolense parasit homolog congopain, hvilket antyder, at GAGs og andre negativt ladede overflader kan spille en vigtig rolle i ekstracellulær katepsinaktivering ved sygdom. Imidlertid antyder nylige fund med cathepsin S ved høj GAG-koncentration, at dette kan opføre sig noget anderledes under sådanne betingelser med chondroitin-4-sulfat (C4S), der endda udviser en decelererende virkning . Ikke desto mindre blev det også en rutinemæssig metode til fremstilling af rekombinante katepsiner at lette autokatalytisk aktivering af katepsiner med det negativt ladede polysacchariddekstransulfat .

størstedelen af informationen om den molekylære mekanisme for GAG-assisteret cathepsinaktivering kom fra en undersøgelse foretaget af Cagli Kurt et al. brug af human cathepsin B som model . Som vist synes GAGs at bidrage til behandlingen på to måder. For det første synes de ved binding at omdanne cathepsinsymogenet til et bedre substrat. For det andet favoriserer binding af gag ‘ er tilsyneladende den åbne konformation af cymogenet og derved fremmer aktivering ikke kun ved sur pH, men også ved pH-værdier tættere på neutral. Dette ser ud til at være tilfældet for de fleste gag ‘er og afhænger ikke kritisk af ladningstætheden af gag’ er, Da HA også var i stand til at fremskynde aktiveringen, skønt i lavere grad, hvilket er usædvanligt for en protein-GAG-interaktion. Desuden var allerede et tetrasaccharid tilstrækkeligt til en fremtrædende acceleration af cathepsin B autoaktivering, hvilket er væsentligt mindre end fundet for en række andre GAG-medierede reaktioner . Interaktionen medieres af Ioniske interaktioner; der synes imidlertid ikke at være nogen konserveret GAGBINDENDE overflade på disse stoffer, da fuldstændigt ikke-relaterede rester i procathepsiner L og B, som stort set var placeret på prodomænerne, viste sig at styre interaktionen .

den anden vigtige rolle GAGs i reguleringen af cathepsinaktivitet kom fra undersøgelserne om papain, den arketypiske repræsentant for familien . Denne reguleringsmåde fik hurtigt mere opmærksomhed med opdagelsen af, at chondroitinsulfat fra brusk fremtrædende øgede den kollagenolytiske aktivitet af cathepsin K . Denne særlige peptidase var blevet opdaget et par år tidligere som den eneste protease, der var ansvarlig for kollagennedbrydning i knoglemodellering og straks anerkendt som en potentiel lægemiddelkandidat til behandling af metaboliske knoglesygdomme, såsom osteoporose . Interaktionen mellem cathepsin K og chondroitinsulfat og andre glycosaminoglycaner blev senere undersøgt detaljeret ud fra både de strukturelle og funktionelle perspektiver , og glycosaminoglycaner er blevet anerkendt som de første kendte allosteriske regulatorer af en cysteinkatepsinpeptidase, som beskrevet detaljeret i de følgende afsnit. Parallelt er funktionelt relevante interaktioner med glycosaminoglycaner også dokumenteret for andre medlemmer af cystein cathepsin-familien. Samlet set har glycosaminoglycaner vist sig at påvirke både aktiviteten og stabiliteten af cysteinkatepsiner. Kinetiske profiler er normalt i overensstemmelse med hyperbolske mekanismer, hvilket indikerer interaktioner med andre stoffer uden for det aktive sted, muligvis via allosteriske mekanismer. Den stabiliserende virkning er vigtig, især på grund af den relative ustabilitet af cysteinkatepsiner ved neutral pH, der findes i den ekstracellulære matrice.

4. Regulering af Cathepsin K-aktivitet og stabilitet

af alle papainlignende peptidaser er cathepsin K blevet etableret som det katepsin, der er mest tæt forbundet med glycosaminoglycaner. Det blev oprindeligt identificeret som en protease udtrykt overvejende i osteoklaster, og dets nedsatte aktivitet viste sig at resultere i alvorlige knoglesygdomme . Cathepsin K er en kollagenase med unik aktivitet blandt pattedyrspeptidaser , som specifikt moduleres af glycosaminoglycaner via allosteriske mekanismer . På grund af sin centrale rolle i knogleomsætningen betragtes cathepsin K i øjeblikket som et af de mest lovende mål for behandling af osteoporose . Bortset fra knoglemodellering er cathepsin K involveret i forskellige fysiologiske og patologiske processer (for en nylig gennemgang se ). Det kan spalte et antal ekstracellulære substrater, herunder proteoglycaner , for at frigive aktive glycosaminoglycaner, som igen modulerer dets aktivitet. I brusk nedbryder cathepsin K både type I og type II collagener og bidrager derved til udviklingen af forskellige inflammatoriske leddsygdomme . Desuden har cathepsin K været forbundet med hjerte-kar-sygdomme, fedme, schisofreni og kræft .

interaktionen mellem cathepsin K og forskellige glycosaminoglycaner har været genstand for en grundig undersøgelse. Selvom flere aspekter af disse interaktioner forbliver undvigende, akkumulerede data antyder, at interaktionerne er heterogene og forskellige og sandsynligvis involverer flere bindingssteder. Chondroitin-4-sulfat (C4S) blev oprindeligt identificeret som GAG med den mest dramatiske effekt på cathepsin K, mens virkningerne af chondroitin-6-sulfat (C6S), dermatansulfat (DS) og hyaluronan (HA) var svagere. Alle testede gag ‘ er øgede stabiliteten af cathepsin K over et bredt pH-område. C4S havde den mest fremtrædende virkning på nedbrydningen af type i og II collagener af cathepsin K , hvorimod dens virkning på hydrolysen af et syntetisk substrat var næsten identisk med C6S og DS og resulterede i en dobbelt stigning i værdierne for specificitetskonstanten . I en senere undersøgelse viste keratansulfat (KS) og C6S sig at have en stimulerende virkning på cathepsin K svarende til C4S, hvorimod heparin og HS havde en begrænset virkning på den kollagenolytiske aktivitet af cathepsin K . Tidlige eksperimenter har også antydet, at kompleks dannelse med CS er nødvendig for den kollagenolytiske aktivitet af cathepsin K ; nylige fund har imidlertid vist, at type I-kollagen også effektivt kan nedbrydes i fravær af glycosaminoglycaner . Ikke desto mindre har det vist sig, at knoglebestemte gag ‘ er forstærker den kollagenolytiske aktivitet af cathepsin K, og endogene GAGKONCENTRATIONER i knogler var tilstrækkelige til en maksimal effekt på cathepsin K-aktivitet .

den kinetiske mekanisme for effekten af CS, DS og heparin (HP) på cathepsin K blev også undersøgt detaljeret ved fysiologisk plasma-pH på 7,4. Under disse betingelser blev CS og DS karakteriseret som ikke-væsentlige aktivatorer med en overvejende virkning på affiniteten for substratet . DS var mere effektiv end CS, hvilket blev tilskrevet dets større fleksibilitet på grund af færre intramolekylære hydrogenbindinger . I modsætning til eksperimenter udført ved pH 5,5 fungerede CS og DS som hæmmere af kollagennedbrydning ved fysiologisk plasma-pH. i modsætning hertil var den kinetiske mekanisme af heparin bifasisk, hvilket indikerer interaktion med to forskellige steder på f.eks. Alt i alt var heparin en stærk aktivator af cathepsin K ved fysiologisk plasma-pH, hvilket øgede både dets kollagenolytiske og elastinolytiske aktiviteter. Desuden havde heparin en stærk stabiliserende virkning på cathepsin K under disse betingelser, hvilket resulterede i en mere end 5 gange stigning i halveringstiden for fsymet .

5. Strukturelt grundlag for interaktionen mellem Cathepsin K og GAGs

krystalstrukturen af cathepsin K og C4S afslørede det strukturelle grundlag for interaktionen . Bindingsstedet er placeret på bagsiden af cathepsin K og interagerer med tre disaccharidenheder af CS i krystalstrukturen (figur 2(a)). Som sædvanlig medieres glycosaminoglycan / proteininteraktionen hovedsageligt af elektrostatiske interaktioner mellem den negativt ladede GAGKÆDE og positivt ladede rester på f.eks. Binding af chondroitinsulfat forårsager ikke signifikante konformationsændringer i cathepsin K sammenlignet med CS-fri cathepsin K. omvendt bøjes CS-kæden ved binding til cathepsin K (figur 2(b)). Størstedelen af konformationsændringen kan tilskrives interaktionen med en kort spiralformet region Arg8-Lys9-Lys10, der interagerer med fire negativt ladede grupper på CS (figur 2(c)). Yderligere tætte kontakter inkluderer Asp6, Ile171, Gln172, Asn190, Lys191 og Leu195 og et par yderligere vandmedierede kontakter .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

Interactions between human cathepsin K and GAGs. (a) Crystal structure of the cathepsin K/chondroitin-4-sulfate (C4S) complex. Proteinet er vist i tegneserie repræsentation og C4S er vist som pinde. (B) Konformationsændring i C4S ved binding til cathepsin K. (c) detaljeret repræsentation af interaktionen i panel (a). C4S er vist som pinde. Rygraden i cathepsin K vises som bånd, og rester, der interagerer med C4 ‘ er, vises som pinde. (d) placering af det forudsagte andet heparinbindingssted i cathepsin K. positivt ladede rester, der foreslås at interagere med heparin, vises som blå pinde. Til orientering vises C4 ‘ er bundet på det første bindingssted som pinde. Placeringen af det aktive sted kløft er markeret med en pil. Koordinater for cathepsin K / C4S-komplekset blev hentet fra Proteindatabanken under tiltrædelseskode 3c9e. opløsningsstrukturen af C4S blev modelleret ved hjælp af data fra . Alle billeder blev oprettet med PyMOL.

DS kinetiske opførsel var analog med CS: det blev derfor foreslået, at det interagerer med cathepsin K på samme måde som CS . Heparin blev derimod foreslået at binde til to steder på cathepsin K ifølge dets kinetiske profil. Mens det første bindingssted blev foreslået at være identisk med det for CS/DS, blev det andet bindingssted forudsagt på bunden af molekylet ved kemiske tværbindingseksperimenter og beregningsmodellering . Fra et strukturelt perspektiv er det forudsagte bindingssted en fortsættelse af CD/DS-bindingsstedet og består af flere basiske rester (Lys10, Lys40, Lys41, Arg108, Arg111, Arg127 og Lys214) organiseret i en ringformet struktur (figur 2(d)). Kinetiske eksperimenter har bekræftet, at heparin kan bindes til begge steder på samme tid . Det skal dog stadig afgøres, om dette kræver en HP-kæde, der interagerer med begge steder på samme tid eller to separate HP-kæder. Dette er hverken klart for interaktionen mellem andre gag ‘ er og det andet HP-bindingssted.

6. Interaktioner af GAGs med cathepsin S og B

bortset fra cathepsin K har to andre humane papainlignende peptidaser, cathepsin S og B, vist sig at være reguleret af glycosaminoglycaner i deres modne former . Cathepsin S, den nærmeste slægtning til cathepsin K, er usædvanlig blandt cysteinkatepsiner for at være stabil ved neutral pH . Cathepsin S har store fysiologiske roller i antigenpræsenterende celler som den vigtigste protease i antigenbehandling og blev for nylig fundet reguleret af C4S . I modsætning til den Aktiveringseffekt, der blev observeret med cathepsin K, fungerede C4S som en hæmmer af type IV-kollagennedbrydning af cathepsin S. inhibering blev også observeret med HS, hvorimod HP, DS, C6S og HA øgede den proteolytiske aktivitet af cathepsin s lidt under anvendelse af type IV-kollagen som substrat. C4S, C6S og HS hæmmede også hydrolysen af Phe-Arg-AMC via en delvis, blandet mekanisme. Svarende til cathepsin K, subtile konformationsændringer i cathepsin S blev observeret ved C4S-binding ved iboende fluorescensspektroskopi. Tre bindingssteder for C4 ‘ er blev forudsagt på cathepsin s ved molekylær docking(figur 3 (a)). Et af de foreslåede steder er det aktive sted, som dog ikke er i overensstemmelse med den observerede blandede inhiberingsprofil af C4S; den anden er placeret på den nederste højre side af molekylet og svarer til det nyligt identificerede allosteriske sted i cathepsin K , mens det tredje er placeret i bunden af molekylet og omtrent svarer til det sekundære heparinbindingssted identificeret i cathepsin K .

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 3

Predicted GAG-binding sites in papain-like peptidases. (a) Three predicted CS-binding sites in cathepsin S. (b) Two predicted HS/HP-binding sites in cathepsin B. (c) The conserved GAG-binding motif in papain. Forudsagte steder vises i cirkler, og positivt ladede rester på hvert sted vises som blå pinde og mærkes. Placeringen af det aktive sted kløft er markeret med en pil. Alle koordinater blev opnået fra Proteindatabanken (tiltrædelseskoder: 1nkc for cathepsin S, 3ai8 for cathepsin B og 1ppn for papain, resp.). Alle billeder blev oprettet med PyMOL.

Cathepsin B er unik blandt cysteinkatepsiner for både at være en endopeptidase og en peptidyldipeptidase, afhængigt af konformationen af den okkluderende sløjfe, en cathepsin B-specifik struktur, der tilvejebringer en pH-specifik skift mellem begge aktiviteter . I lysosomet begrænser den lave pH protease til en lukket eksopeptidase-konformation, hvorimod den næsten neutrale pH i det ekstracellulære miljø fremmer endopeptidaseaktivitet af cathepsin B . Ekstracellulær cathepsin B er oftest forbundet med kræft og forskellige typer af arthritis . Protease lokaliseret til celleoverfladen i flere undersøgelser og viste sig at være involveret i cellemigration under både fysiologiske og patologiske tilstande . På molekylært niveau blev det vist at spalte et antal ekstracellulære substrater, herunder laminin, type IV collagen og fibronectin . For nylig er cathepsin B også blevet foreslået at være en larr-secretase, der producerer amyloid-prispeptider i sekretoriske vesikler af neuronale chromaffinceller . Imidlertid, Det har også vist sig at nedbryde amyloidaflejringer i en dyremodel, og det samlede resultat er blevet foreslået at blive bestemt af balancen mellem cathepsin B og dets endogene inhibitor cystatin C .Binding af HP eller HS har vist sig at øge stabiliteten af det ellers ustabile pH ved alkalisk pH (8,0), samtidig med at aktiviteten af pH reduceres en smule langs hele ph-profilen . Beregningssimuleringer har forudsagt, at heparin stabiliserer molekylets konformation under disse betingelser og har forudsagt to formodede GAGBINDINGSSTEDER (figur 3(b)), en på hver side af molekylet . Det formodede bindingssted i L-domænet består af fem basiske rester (Arg85, Lys86, Lys130, Lys141 og Lys144), mens den i R-domænet kun indeholder to (Lys158 og Arg235). Forfatterne har antydet, at bindingsstedet i R-domænet har højere affinitet for kortere GAGFRAGMENTER, såsom heparin-disaccharidet, der anvendes i deres dockingsimuleringer, hvorimod den i L-domænet sandsynligvis er mere relevant for bindingen af længere GAGFRAGMENTER .

7. Interaktioner af GAGs med andre Papainlignende peptidaser

interessant nok har papain også vist sig at interagere med GAGs. På trods af at de ikke har nogen fysiologisk relevans, peger disse interaktioner på evolutionært bevarede reguleringsmekanismer i familien. HP hæmmede papain ved hjælp af en hyperbolisk blandet mekanisme og påvirkede dens konformation . En klassisk heparinbindende konsensussekvens blev identificeret i papain i form af sekvensen 187-ile-Arg-ile-Lys-Arg-Gly-192. Strukturelt er denne sekvens placeret på højre side af molekylet (figur 3(c)) i en region, der ligger mellem begge allosteriske steder kendt i cathepsin K.

derudover er der beskrevet et par eksempler på proteaser fra protosoiske parasitter, der interagerer med GAGs, hvilket antyder muligheden for deres indflydelse på vært-parasitinteraktioner. Cathepsin l homolog brucipain, en afgørende virulensfaktor for den enkleste parasit Trypanosoma brucei, har vist sig at være allosterisk moduleret af HS. Virkningen af HS i denne undersøgelse var subtil, og den havde evnen til at vende substratinhibering med et lille dipeptidsubstrat (h-Phe-Arg-AMC) . En stærkere virkning af HS blev observeret for crusipain fra den beslægtede parasit Trypanosoma Crusi. I dette tilfælde var HS en aktivator af peptidasen, der forårsagede en signifikant (op til 6 gange) stigning i aktiviteten af peptidasen målt med et syntetisk substrat. Desuden øgede HS frigivelsen af kinin fra kininogen med høj molekylvægt ved hjælp af crusipain in vitro såvel som ved levende trypomastigoter og reducerede kininogens inhiberende egenskaber mod crusipain . Tilsvarende blev HP for nylig vist at modulere aktiviteten af cathepsin L-lignende peptidase rCPB2.8 fra Leishmania meksicana . I dette tilfælde inhiberede HP og HS, men ikke CS eller DS, hydrolysen af H-Phe-Arg-AMC ved hjælp af en hyperbolisk blandet mekanisme og påvirkede proteinets konformation . Alt i alt viser disse eksempler, at interaktioner med gag ‘ er ikke er begrænset til endogene cysteinkatepsiner, men kan også spille forskellige roller i værtspatogeninteraktioner og kan fungere enten som en del af kroppens forsvar mod invaderende patogener eller som faktorer, der bidrager til patogenens invasive mekanismer.

8. Farmakologisk målretning

Cathepsin K repræsenterer i øjeblikket det mest attraktive lægemiddelmål blandt cathepsinerne, selvom cathepsin S også er et relevant mål i sygdomme forbundet med forhøjet immunrespons, såsom bronchial astma og psoriasis . Flere cathepsin k-hæmmere er i øjeblikket under udvikling, som er målrettet mod det aktive sted for fermet (indsamlet i ). I øjeblikket er den mest lovende hæmmer odanacatib (Merck & Co., Inc. NJ, USA), en nitril sprænghoved-indeholdende inhibitor, meget selektiv for cathepsin K . Fase III kliniske forsøg med odanacatib er afsluttet med succes, og ansøgninger om godkendelse forventes snart indgivet. Hvis det godkendes, vil lægemidlet positionere sig på markedet mod andre nye generationsmedicin, såsom anti-RANK-ligand-antistoffet denosumab (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, USA) og teriparatid, en rekombinant form for parathyroidhormon (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA) såvel som de veletablerede bisphosphonater . Målretning mod cathepsin K/chondroitin-sulfat-interaktion ville repræsentere et alternativ til disse behandlinger. Endogent chondroitinsulfat er tilstrækkeligt til at udvise en maksimal Aktiveringseffekt på cathepsin K, og dets fordøjelse reducerer aktiviteten af cathepsin K med 40% . En reduktion i knogleomsætning af denne størrelse ville sandsynligvis være tilstrækkelig til behandling af patienter med mindre alvorlig knogletæthedsreduktion. En ekstra fordel ville være, at cathepsin K-aktivitet i sig selv såvel som levedygtigheden og celletallet af osteoklaster og osteoblaster ville forblive uforstyrret.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt vedrørende offentliggørelsen af dette papir.

anerkendelse

arbejdet er blevet støttet af tilskud fra det slovenske forskningsagentur (P1-0140 og J1-3602) til Boris Turk.