tekst
behandling af methicillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) er blevet kompliceret af stigende antibiotikaresistens. MRSA-stammer udtrykker penicillinbindingsprotein 2a (PBP2a), kodet af mecA, som giver resistens over for Kurt-lactamer ved at beskytte det reaktive serin i en smal, utilgængelig kløft, hvilket tillader cellevægssyntese at fortsætte i nærvær af antibiotikum (1, 2). Ceftobiprol og ceftarolin er anti-MRSA cephalosporiner, der hæmmer PBP2a ved terapeutisk nyttige koncentrationer. R2-gruppen af ceftobiprol strækker sig ind i den smalle spalte af PBP2a for at få adgang til det aktive sted, hvorimod ceftarolinbinding forårsager en allosterisk ændring i PBP2a, hvilket afslører det aktive sted for binding med et andet molekyle (3, 4). Ceftobiprole er blevet evalueret i kliniske forsøg, og ceftarolin er FDA godkendt til behandling af hud og hud struktur infektioner, herunder dem forårsaget af MRSA (5-10).
tidligere undersøgelser fra vores gruppe har vist, at passage af Col-stammen i ceftobiprol vælger resistente mutanter med mutationer i PBP2a (11). Denne undersøgelse undersøger, om ceftarolin passage også vælger for lignende mutationer. Passageforsøg blev udført med to forskellige MRSA-baggrunde: COL, et arkaisk homogent resistent isolat fra 1961 og SF8300, en heterogent resistent moderne USA300 MRSA-stamme. Colneks og Sf8300eks, Meca-negative derivatstammer af COLn og SF8300 blev opnået ved (12) udskæring af kromosomalt stafylokokkassettekromosom mec (SCCmec) (13). Vildtype mecA blev genindført på plasmid pYK20 (afledt af plasmidpant8 og indeholdende vildtype mecA klonet fra COL ) til Colneks og Sf8300eks til passage undersøgelser. Hvis mecA medierede resistens, skulle enten hærdning af en resistent mutant af plasmidet eller introduktion af det i en modtagelig baggrund resultere i henholdsvis tab eller forstærkning af fænotype, hvilket muliggør bestemmelse af Meca ‘ s bidrag til resistens. Stammer og plasmider anvendt i dette studie er anført i tabel 1 og 2. Kolneks (pYK20) og Sf8300eks(pYK20) blev serielt passeret i tryptisk sojabuljong indeholdende stigende koncentrationer af Ceftarolin (Skovlaboratorier) som tidligere beskrevet (11).
- se inline
- se popup
liste over forældre-og mutantstammer anvendt i Meca-positive passage studiesa
- se inline
- se popup
plasmider anvendt i Meca-positive passage studier
efter 28 dage gav colneks(pYK20) og sf8300eks(pYK20), der blev passeret i ceftarolin, to mutanter, Colnekspt(pYK20COLT*) og sf8300ekspt(pyk208300t*) (en stjerne angiver et plasmid genereret under ceftobiprol-eller ceftarolinvalg i en col-eller Sf8300-baggrund) (tabel 1). MIC ‘ er til ceftarolin, ceftobiprol og andre kur-lactamer (Sigma-Aldrich) blev bestemt ved bouillonfortyndingsmetoden i henhold til CLSI-standarder (tabel 3) (15). Pyk20colt*) udtrykte resistens på højt niveau over for både ceftarolin og ceftobiprol med mikrofoner på henholdsvis 64 liter/ml og 32 liter/ml. Sf8300ekspt (pYK208300T*) udtrykte modstand på lavt niveau ved passage dag 4, med en MIC på 4 liter/ml, som forblev uændret på trods af yderligere 24 passager (tabel 3 og Fig. 1). Den tidligere beskrevne ceftobiprol-passaged mutant af Colneks (pYK20) (11), Colnekspb (pYK20COLB*), viste høj resistens over for både ceftobiprol og ceftarolin med en MIC på 64 liter/ml til hver.
- Vis inline
- Vis popup
Mikrofoner af lægemidler til mecA-positive forældre og passaged mutantstammer
fremkomst af ceftobiprol – og ceftarolin-passaged Meca-positive mutanter. Resistens over for ceftobiprol (BPR) og ceftarolin (CPT) blev genereret ved at passere stammer i subinhibitoriske koncentrationer af hvert antibiotikum i bouillon. Den højeste koncentration af lægemiddel, hvor stammer voksede hver dag, vises på y-aksen.
Plasmid mecA blev sekventeret for mutationer i passagestammer. Da PBP ‘ er er målet for kurr-lactamer, blev pbp1, -2, -3 og -4 også sekventeret. Endelig blev gdpP og acrB sekventeret, da mutationer i disse gener var blevet identificeret i en mecA-negativ ceftobiprol-resistent mutant af COL (16). Plasmid pYK208300T* (pYK20 fra Sf8300eks passeret i ceftarolin) havde en enkeltpunktsmutation (G til A ved kodningssekvensposition 1339) i mecA, hvilket resulterede i en ikke-synonymt aminosyreændring, E447K. ingen mutationer var til stede i andre PBP-gener, acrB eller gdpP (Tabel 4).
- se inline
- se popup
mutationer i mecA-positive mutantstammer, der er passeret med ceftobiprol og ceftarolin
Plasmid pYK20COLT* (pYK20 fra ceftarolin) havde ingen mutationer i Meca. En punktmutation (C til T ved CDs-position 1327), der introducerede h443y-mutationen i GdpP, en punktmutation (G til A ved CDS-position 466), der introducerede D156N-mutationen i PBP2, og to punktmutationer (A til G ved CDS-position 601 og C til G ved CDS-position 723), der introducerede t201a-og F241L-mutationer i PBP4 blev fundet (Tabel 4). Bemærk, ceftarolin passage af COL indeholdende mecA i sin naturlige kromosomale placering resulterede også i en mutant med resistens på højt niveau, men mangler mutationer i mecA (data ikke vist). Sekvensanalyse af den passaged mutant afslørede en punktmutation i pbp2 (G til A ved CDS-position 1891), hvilket resulterede i aminosyreændringen G631S og en i pbp4 (T til A ved CDS-position 414), der introducerede en n138k-mutation. Disse data indikerer, at selv i nærvær af mecA kan ceftarolin vælge for mutationer i andre gener, hvilket resulterer i resistens.
hærdning af Colnekspb(pYK20COLB*) og sf8300ekspt(pYK208300T*) af deres plasmider, som hver havde Meca-mutationer, nedsatte mikrofonerne for alle testede Karr-lactamer (tabel 5 og 6). Hærdning af Colnekspt (pYK20COLT*) af dets plasmid, som manglede mecA-mutationer, havde ingen effekt på Mikrofoner (tabel 5). Omdannelse af pYK20COLB*, som indeholder 6 substitutionsmutationer i mecA, til den modtagelige Kolneksforælder, hvilket gav transformantkolnekset(pYK20COLB*), resulterede i ceftarolin-og ceftobiprol-resistens på højt niveau. Omdannelse af pYK208300T*, som indeholder den enkelte mutation E447K i mecA, til Kolneks, hvilket gav transformanten Kolneks(pYK208300T*), resulterede i resistens på højt niveau over for ceftobiprol (MIC på 64 liter/ml), men kun modstand på lavt niveau over for ceftarolin (MIC på 4 liter/ml) (tabel 5). Omdannelse af pYK20COLB* til Sf8300eks, hvilket gav transformanten Sf8300eks (pYK20COLB*), resulterede i resistens på højt niveau over for ceftarolin og ceftobiprol (MIC på 32 Liter/ml til hver) (tabel 6). Flere forsøg på at transformere Sf8300eks med pYK208300T* mislykkedes.
- se inline
- se popup
Mikrofoner af lægemidler til Meca-positive passaged mutantstammer hærdet af plasmid og forældrestammer transduceret med plasmider fra passagedstammer i COL-baggrunden
- Vis inline
- Vis popup
Mikrofoner af lægemidler til Meca-positive passaged mutantstammer hærdet af plasmid og forældrestammer transduceret med plasmider fra passagedstammer i USA300 stamme SF8300 baggrund
en enkelt aminosyreændring ved E447 i mecA ser ud til at spille en nøglerolle i modstand. Det er til stede i ceftobiprole-passaged COL (blandt andre mutationer) (11), Det er den eneste mecA-mutation i ceftarolin-passaged SF8300, og det er rapporteret i kliniske isolater (17, 18). Strukturelt er E447 bosat i det penicillin-bindende domæne af PBP2a og interagerer med R2-gruppen af ceftobiprol og andre larr-lactamer (3, 19). E447K tildelte ceftobiprol-resistens på højt niveau og ceftarolinresistens på lavt niveau i Kolneks baggrund, sandsynligvis på grund af strukturelle forskelle mellem de to forbindelser. Flere mutationer i mecA giver resistens på højt niveau over for begge antibiotika (20). Den genetiske baggrund spiller også en rolle. Heterogen sf8300, der blev passeret i ceftarolin, udviklede resistens på lavt niveau over for ceftobiprol og ceftarolin med E447K (MIC 4 liter/ml). Denne mutation har været forbundet med lav resistens over for ceftarolin i kliniske isolater (17).
afslutningsvis vælger passage i enten ceftarolin eller ceftobiprol for en E447K-mutation i PBP2a, en mutation fundet i ceftarolinresistente kliniske isolater, hvilket understreger dens betydning ved formidling af resistensfænotypen (17, 18). Selvom helgenomsekventering ikke blev udført, hvilket er en begrænsning af denne undersøgelse, andre gener end mecA spiller en rolle, fordi resistensniveauet var forskelligt mellem Col og SF8300 baggrunde ved introduktion af e447k-mutationen og den meget resistente passaged Col-mutant havde ingen mecA-mutationer. Selvom der sandsynligvis er andre, synes mutationer i gener, der koder for PBP4 og GdpP, at være særlig vigtige, da disse gentagne gange er blevet identificeret i ceftobiprol – og ceftarolin-passaged mutanter. Rollen af disse gener og andre er under aktiv undersøgelse.
