introduktion
de komplette genomsekvenser af forskellige organismer, inklusive pattedyr, er for nylig blevet tilgængelige som en konsekvens af hurtige fremskridt inden for DNA-sekventeringsteknologi. Men især hos pattedyr spiller analysen af transkripter stadig en nøglerolle i at bygge bro mellem genomet og proteomet. Dette skyldes hovedsageligt, at vi i øjeblikket ikke nøjagtigt kan forudsige strukturer af transkripter afledt af et bestemt gen fra den genomiske information alene. Som en metode til analyse af udskrifter er cDNA-bibliotekskonstruktion således afgørende, selv i post-genom-sekventeringstiden. Selvom cDNA-kloning af gener af interesse ved PCR har givet en forenklet alternativ rute til analyse af transkriptionsstrukturer uden cDNA-bibliotekskonstruktion, er opførelsen af et cDNA-bibliotek den valgte tilgang, når et stort antal cDNA ‘ er fra en enkelt mRNA-kilde skal analyseres. Hidtil er der gjort en stor indsats for at udvikle en metode til udarbejdelse af cDNA-biblioteker af høj kvalitet (1-4). I modsætning hertil er spørgsmålet om, hvordan man forbereder et cDNA-bibliotek af høj kvalitet fra en lille pool af RNA ‘ er, ikke blevet behandlet så aktivt. Dette er imidlertid blevet et højt prioriteret mål, fordi forskere ofte er interesserede i hypotetiske gener, der forudsiges kun at blive udtrykt i visse typer celler eller væv under særlige forhold, såsom dem, der ses i patologiske prøver.
der har været en række rapporter, der beskriver brugen af små mængder kilde-RNA til generering af amplificeret cDNA eller cRNA, hvorfra mål for mikroarray-analyse kan fremstilles (5-15). Deres endelige mål er at opnå fuld længde, ikke-populationspartisk RNA, der er meget repræsentativ for det oprindelige mRNA. For at udføre dette vedtager disse metoder normalt PCR eller in vitro transkription med T7 RNA-polymerase for at amplificere det originale mRNA i form af henholdsvis cDNA eller cRNA. Selvom sammenligningen af ekspressionsprofiler er en af de mest effektive tilgange til at undersøge forskelle i de fysiologiske tilstande af celler eller væv, strukturel karakterisering af udskrifter (f.eks. identifikation af alternative splejsningsmønstre, transkriptionsstartsted og transkriptionstermineringssted) kan ikke udføres ved en sådan mikroarray-analyse. Sekventeringsanalyse af hvert transkript er uundgåelig i disse tilfælde.
Vi udviklede en metode, der tillader, at en lille mængde start-RNA bruges til at konstruere et cDNA-bibliotek, der er egnet til genkloning og omfattende sekventeringsanalyse. Metoden mærker 3 ‘og 5’ enderne af cDNA ‘ erne i første runde med henholdsvis T7 og SP6 fagpromotorsekvenser for at minimere størrelsesforstyrrelser under amplifikationen. Efter to-runde cRNA-amplifikation konverterede vi de amplificerede Crna ‘er til cDNA’ er, klonede disse produkter til et plasmid og evaluerede derefter det resulterende cDNA-bibliotek i sammenligning med det, der blev konstrueret ved en konventionel metode (4,16,17).
materialer og metoder
cRNA-amplifikation
sekvenserne af oligonukleotider anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel 1. For at etablere protokollen brugte vi 1 larg Total RNA fremstillet af ICR-mushjerne (8 uger gamle hanmus) som en skabelon. En blanding(10 liter) af 1 liter Total RNA og 100 pmol T7-ikke-(dT)18 primer blev inkuberet ved 70 liter C i 10 minutter og derefter snapkølet på is. Dobbeltstrenget cDNA-syntese og adapterligering blev udført efter protokollerne fra SUPERSCRIPT-plasmidsystemet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (4,16,17) med mindre ændringer. Kort, for det første-strand cDNA-syntese, 4 µL 5× første-strand buffer (Invitrogen), 1 µL 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 µL 10 mM dntp ‘ er, 1 µL (40 U) RNaseOUT™ (Invitrogen), og 1 µL vand blev tilføjet til denatureret RNA/T7-Ikke-(dT)18 primer mixure og inkuberes ved 37°C i 3 minutter at anneale primere. Derefter blev der tilsat 2 liter (400 U) SUPERSCRIPT III RNase H-revers transkriptase (Invitrogen) til reaktionsblandingen, og temperaturen blev justeret til 50 liter C for at starte den første streng cDNA-syntese. Efter 1 time, den anden-strand cDNA-syntese blev udført som tidligere beskrevet af Gubler og Hoffman (18); til den første strand cDNA blanding, 91 µL vand, 30 µL 5× anden strand buffer (Invitrogen), 3 µL 10 mM dntp ‘ er, 1 µL (10 U) Escherichia coli DNA-ligase, 4 µL (40 U) E. coli-DNA-polymerase og 1 µL (2 U), E. coli RNase H blev tilføjet, og blandingen blev inkuberet ved 16°C i 2 timer. cDNA termini var så slutningen-poleret med 10 U T4 DNA-polymerase (Invitrogen) på 16°C i 5 min, og reaktionen var standset ved tilsætning af 10 µL 0,5 M ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA). De resulterende cDNA ‘ er blev oprenset ved ekstraktion med phenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1), efterfulgt af ethanoludfældning som tidligere beskrevet (17), bortset fra anvendelse af 1 liter gærtrna i stedet for polyadenylsyre som bærer. Det udfældede cDNA blev opløst i 50 liter te (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 og 1 mM EDTA), blandet med 30 liter af en 20% (vægt/v) polyethylenglycol (PEG) 6000/2, 5 M NaCl-opløsning og derefter inkuberet på is i 1 time (17). Efter inkubationen blev cDNA-blandingen centrifugeret ved 18.000 liter g ved 4 liter C i 15 minutter. Den resulterende cDNA-pellet blev skyllet to gange med 70% ethanol, tørret og derefter resuspenderet i 30 liter vand. De oprensede cDNA ‘ er blev ligeret med 500 pmol SP6-adapter (tabel 1) under anvendelse af 5 U T4 DNA-ligase (Invitrogen) i et 50-liter reaktionsvolumen ved 16 liter C natten over. Den adapterligerede blanding blev fortyndet to gange med vand, og derefter blev cDNA ‘ er oprenset under anvendelse af en DNAclear kolon (Ambion, Austin, TK, USA). Eluatet (i 16 liter vand) blev brugt som en skabelon til cRNA-syntese. Ved hjælp af MEGAscript Kristit T7 kit (Ambion) blev Crna ‘ er syntetiseret ved 37 kr.C natten over i et 40-kr. – reaktionsvolumen. Efter at skabelon-cDNA ‘er blev nedbrudt af 4 U DNase I, blev de syntetiserede Crna’ er oprenset ved hjælp af et Rneasy-mini-sæt (CHIAGEN, Valencia, CA, USA) og elueret med 100-vand. Koncentrationen af cRNA blev bestemt ved ultraviolet (UV) absorption. Til cRNA-amplifikation i anden runde blev der anvendt 2 liter af den syntetiserede cRNA og 100 pmol SP6 up-primer (svarende til den øverste streng oligonukleotid af SP6-adapter vist i tabel 1) som henholdsvis skabelon og primer. Den anden runde cDNA-syntese blev udført som i den oprindelige revers transkription fra kilden RNA, bortset fra at SP6 up primer annealing blev udført ved 50 liter C i 3 minutter. Efter oprensning af det opnåede dobbeltstrengede cDNA gennem en DNAclear søjle blev 0,5-larg af cDNA anvendt som en skabelon til den næste SP6-RNA-polymeraseassisterede cRNA-amplifikation. Ved anvendelse af MEGAscript SP6-kittet (Ambion) blev cRNA-syntese udført ved 37 liter C i 6 timer. efter at skabelon cDNA blev nedbrudt under anvendelse af DNase i, blev de syntetiserede Crna ‘ er oprenset som beskrevet ovenfor.
cDNA-Bibliotekskonstruktion
to mikrogram af de resulterende Crna ‘ er blev underkastet dobbeltstrenget cDNA-syntese ved hjælp af 100 pmol attB2-Not – (dT) 18 primer (tabel 1). CDNA-syntese, end-blunting, oprensning og adapter-ligeringstrin blev udført som i de foregående cDNA-synteser, bortset fra at attB1-adapteren (tabel 1.500 pmol) blev ligeret til de dobbeltstrengede cDNA ‘ er. Efter at de attB1-adapterligerede cDNA ‘ er blev oprenset ved successive behandlinger af phenol/chloroform/isoamylalkoholekstraktion, ethanoludfældning og PEG/NaCl-udfældning i denne rækkefølge, blev de opløst i 50 liter te og behandlet med RNase A (ved en endelig koncentration på 10 liter/mL; Invitrogen) for at nedbryde kontamineret RNA ved 37 liter C i 30 minutter. Reaktionsblandingen blev igen oprenset ved ekstraktion med phenol/chloroform/isoamylalkohol efterfulgt af ethanoludfældning og peg/NaCl-udfældning. De resulterende cDNA ‘ er blev opløst i 15 liter TE, og deres mængde blev estimeret ud fra fluorescerende farvningsintensitet efter elektroforese på agarosegel (4). De attB1-ligerede cDNA ‘ er (36 ng) blev udsat for en in vitro-rekombinationsreaktion (Port-kar-system; Invitrogen) med 250 ng attP-pSP73 donorvektor som tidligere beskrevet (4,16,17). I korte attB1-ligated cDNA og attP-pSP73 donor vektor blev blandet og inkuberes i 10 µL reaktion volumen, som indeholder 2 µL 5× BP Clonase™ reaction buffer og 2 µL BP Clonase (både fra Invitrogen) ved 25°C natten over. CDNA-blandingen blev behandlet med 2-liter-proteinase K (Invitrogen) ved 37-liter C i 10 minutter for at slukke reaktionen og ekstraheret med phenol/chloroform/isoamylalkohol, efterfulgt af ethanoludfældning med 2-liter-gærtrna som bærer. Det udfældede cDNA blev opløst i 10 liter vand, og 1 liter af blandingen blev anvendt til transformationen af Elektromaksisk-kurr DH10B-kurr E. coli-celler (Invitrogen). Efter titrering af det resulterende cDNA-bibliotek blev cDNA-plasmiderne udvundet fra ca.1.000.000 kolonier ved en alkalisk natriumdodecylsulfat (SDS) metode som tidligere beskrevet (4,19). De resulterende cDNA-kloner var i en form for plasmid, der bærer attL-steder. Fordi plasmiderne, der bærer attB-steder, er påkrævet i nogle applikationer, blev disse plasmider omdannet til dem, der bærer attB-steder som tidligere beskrevet (16). Dette cDNA-bibliotek blev derfor betegnet som MB-AL (Mus hjerne forstærket cRNA-afledt bibliotek).
på samme måde som beskrevet for MB-AL konstruerede vi et cDNA-bibliotek fra nonamplified RNA (100 kg mus hjerne Total RNA) og betegnet det som MB-CL (mus hjerne konventionelt konstrueret bibliotek).
undersøgelse af størrelse-Bias-effekt på amplificerede Crna ‘er
for at undersøge størrelse-bias-effekten på Crna’ er blev Crna ‘er i første runde transkriberet af T7 RNA-polymerase og Crna’ er i anden runde transkriberet af SP6 RNA-polymerase kørt på 1,0% agarosegel (1 liter hver) og derefter blottet på nylonmembran (Biodyne ren B nylonmembran; PALL, East Hills, NY, USA). De blev hybridiseret med 32P-mærket SP6 up primer (tabel 1) og ikke-(dT)18 (5′-GCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′) oligonukleotid, henholdsvis. Ti picomoler af hver sonde blev mærket med ATP (ca. 3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences, NJ, USA) ved hjælp af T4 polynukleotidkinase (Takara, Kyoto Japan). Efter hybridisering natten over i GMC-buffer (20) ved 45 kg C blev disse membraner grundigt vasket i 1 liter standard saltvandcitrat (SSC)/1% SDS-opløsning tre gange ved stuetemperatur. Analyse af hybridiserede signaler blev udført på en BAS 2000-Billedanalysator (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)
evaluering af cDNA-biblioteker
gelelektroforese. Fordeling af cDNA-indsatsstørrelser blev undersøgt ved elektroforese af Crna ‘er syntetiseret af T7 RNA-polymerase under anvendelse af NotI-fordøjet MB-AL og MB-CL plasmid cDNA’ er som skabeloner. Efter oprensning ved hjælp af et Rneasy Mini Kit blev Crna ‘ erne elektroforeseret på en formaldehydholdig agarosegel med perfekte RNA-markører (EMD Biosciences, Madison, Vi, USA). Efter farvning af gelen med SYBR Luther Green II (Invitrogen) blev fluorescerende farvningsintensitet analyseret ved hjælp af Billedækvivalent Luther (version 5.0) på en FluorImager 595 (Amersham Biosciences).
tilfældig single-pass sekventeringsanalyse. 3 ‘ – end-sekvenser af cDNA-kloner blev undersøgt ved DNA-sekventering. Plasmid-DNA fra 768 tilfældigt plukkede kloner blev oprenset ved hjælp af en MFK-9600 Magnia kar (Toyobo, Osaka, Japan) og analyseret af en RISA 384-kapillær Sekvensator (Shimadsu, Kyoto, Japan) (16). Efter trimning af vektorsekvensen ved hjælp af Sekvenscher-version 4.1 (Hitachi-program, Tokyo, Japan) blev de opnåede cDNA-sekvenser, der var længere end 200 nukleotidrester, grupperet med cDNA-poster i GenBank-databasen og vores interne musedatabase. Undersøgelse af integriteten af de 3′ ender af cDNA-kloner blev udført ved en analyse af, om der blev fundet en kanonisk polyadenyleringssignalheksamer (5′-aataaa-3’) eller dens enkeltbasevarianter (11 signalheksamere) inden for de 50 nukleotidrester opstrøms fra Poly(a) halen af cDNA ‘ er (21).
cDNA microarray. Microarray-analyser blev udført for at sammenligne cDNA-populationer i MB-AL-og MB-CL-bibliotekerne. Hjemmelavede cDNA nylon mikroarrays med 3534 prober blev fremstillet, og radioisotopisk detektion blev udført (22). Kort fortalt blev cDNA-plasmider, som blev isoleret i vores institut, og for hvilke der allerede var kendt fulde sekvenser eller slutsekvenser, spottet ved hjælp af GeneTAC kurra1 (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, USA) på BioDyne B nylonmembran og derefter fastgjort efter producentens anvisninger. Listen over cDNA ‘ er, der er immobiliseret på denne mikroarray, er tilgængelig efter anmodning fra forfatterne. MB-AL-og MB-CL-mål-cDNA ‘ er blev fremstillet ved anvendelse af revers transkription fra hver af de 1 larg cRNA-prøver, der blev anvendt til insertstørrelsesanalysen som beskrevet ovenfor. Disse mål blev syntetiseret og mærket i reaktionsblandingen indeholder 1 mg af hver cRNA, 100 ng tilfældig hexamer, 1× første-strand buffer, 10 mM DTT, hver 800 µM dATP, dTTP, og dGTP, 800 nM, dCTP, 5 µL dCTP (>2500 Ci/mmol; Amersham Biosciences), og 100 U Hævet II RNase H – reverse transkriptase ved stuetemperatur i 10 min. og derefter ved 42°C i 1 time. Efter alkaline lysis og neutralisering, mærket cDNAs blev renset med QIAquick® PCR-rensning kit (QIAGEN) og tælles. Mål cDNA, der blev udsat for hybridisering med cDNA nylon microarray i overværelse af 1 µg polyadenylic syre og 2,5 µg Mus Barneseng-1 DNA® (Invitrogen) i 250 µL PerfectHyb™ buffer (Toyobo) på 68°C natten over. Efter streng vask ved 68 liter C med 2 liter SSC/1% SDS (to vasker på 15 minutter hver) og derefter med 0,1 liter SSC/1% SDS (to vasker på 30 minutter hver) blev hybridiseringssignalerne detekteret og analyseret på en FLA-8000 (Fuji fotofilm). CDNA-pletterne, der viste stærkere signaler end baggrundskontrollen, blev valgt og underkastet yderligere analyse. Efter udførelse af global normalisering blev scatter-plots af signalintensiteter af cDNA-pletter, der stammer fra MB-AL og MB-CL-mål, opnået.RNA blot hybridisering. RNA blot hybridisering blev udført for at undersøge størrelse-bias effekter. MB-AL-og MB-CL-Crna ‘ erne (hver 1,5-larg, syntetiseret som beskrevet ovenfor) blev elektroforeseret på formaldehydholdig agarosegel og overført til BioDyne B nylonmembran. Probe-cDNA ‘ erne blev fremstillet under anvendelse af PCR-amplifikation. Primere blev designet baseret på de sekvenser, der er registreret i GenBank-databasen eller vores interne database; skabeloner var de cDNA-plasmider, som vi havde isoleret. Sonden af ribosomalt S6-protein var 724 bp i længden, forstærket med 5′-CGCTCGGCTGTGTCAAGATG-3′ og 5′-GAGGACAGCCTACGTCTCTCTGGG-3′ primere, og sonden af varmechokprotein (hsp) 70.940 bp i længden blev forstærket med 5′-GATGGACAAGGCGCAGATCC-3′ og 5′-ctcgatggtgggtcctgagc-3’ primere. 3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences) ved hjælp af RadPrime DNA-mærkningssystemet (Invitrogen). Efter hybridisering natten over i PerfectHyb-buffer ved 65 kg C blev membranerne vasket successivt med 0,1 kg SSC/1% SDS ved stuetemperatur i 5 minutter og i 15 minutter og derefter ved 65 kg C i 30 minutter. Hybridiseringssignalerne blev detekteret på en BAS 2000-billedanalysator.
resultater og diskussion
cDNA-bibliotekets konstruktionsmetode, som vi udviklede i denne undersøgelse, er vist i Figur 1 (nyligt introducerede trin fremhæves med en stjerne). Denne metode består af to runder af cRNA-amplifikationstrin, omdannelse af Crna ‘er til cDNA’ er og rekombinationskloning til et plasmid. Det vigtigste trin i denne metode er adapterligering til tag cDNA ender med SP6 promotor sekvens. Når vi med succes kan syntetisere cDNA’ er i dette format, bliver det muligt specifikt at vende transkribere Crna ‘er i første runde, der indeholder SP6-promotorsekvensen i deres 3’ – ende. Crna ‘erne i anden runde syntetiseres med SP6 RNA-polymerase under anvendelse af de resulterende dobbeltstrengede cDNA’ er som skabeloner. Efter de to runder af RNA-polymeraseassisteret amplifikation omdannes de resulterende Crna ‘er derefter til dobbeltstrengede cDNA’ er ved omvendt transkription ved hjælp af attB2-Not-(dT)18-primeren. Brugen af attB2-Not-(dT)18 primer i omvendt transkription gør det muligt for os kun at konvertere Crna’erne, der bærer sekvensen 5′-(a)18gcggccgc-3′ i deres 3 ‘ ender. Fordi disse ændringer kun bør tillade amplifikation og kloning af cDNA ‘ er, der har korrekt mærkede ender, forventer vi, at denne metode vil minimere størrelsesforstyrrelse under RNA-polymeraseassisteret amplifikation.
trinene i den adapterligeringsassisterede cRNA-forstærkning og den følgende cDNA-bibliotekskonstruktion er illustreret. For at opretholde de forstærkede cDNA-størrelser med dem fra cDNA ‘ erne i første runde introducerede vi nogle ændringer i konventionelle RNA-polymeraseassisterede metoder (fremhævet med stjerner). Blå og røde linjer angiver henholdsvis cDNA og RNA. E. coli, Escherichia coli.
for at teste effektiviteten af metoden konstruerede vi cDNA-biblioteker ved en konventionel metode (16) ved anvendelse af ikke-forstærket total RNA fra musehjernen (100 liter) og ved den ovenfor beskrevne metode ved anvendelse af 1 liter total RNA fra musehjernen. Tabel 2 opsummerer mængderne af cDNA og cRNA opnået i hvert trin, beregnet som et gennemsnit af tre uafhængige eksperimentelle kørsler af MB-AL-konstruktion. Vi opnåede et gennemsnit på 6,4 liter 107 uafhængige cDNA-kloner som den endelige produktion. Da dette antal cDNA-kloner stammer fra i alt 36 ng cDNA genereret ved hjælp af amplifikationsprotokollen, beregner vi, at denne metode giver ca.1,2 liter 1011 cDNA-kloner ud fra 1 Total-RNA.
for at undersøge størrelse-bias-effekten under amplifikationstrin eksperimentelt sammenlignede vi derefter størrelsesfordelingerne af første runde og anden runde cRNA ved RNA blot hybridiseringsanalyse. I disse eksperimenter blev Crna ‘erne i første runde og anden runde hybridiseret med SP6 UP primer og med henholdsvis ikke-(dT)18 oligonukleotid, fordi disse oligonukleotidprober kun registrerer Crna’ er korrekt transkriberet til slutningen. Som vist i figur 2 viste RNA-størrelsen ved toppen af hybridiseringssignalet i cRNA i anden runde sig at være næsten den samme som i cRNA i første runde, men med et lille skift til mindre størrelse. Vi formoder, at trunkering af Crna ‘ er sandsynligvis fandt sted under anden runde cDNA-syntese med SP6 UP-primeren.
for yderligere at vurdere kvaliteten af det resulterende forstærkede cDNA-bibliotek sammenlignede vi også forskellige funktioner i cDNA-bibliotekerne genereret med og uden amplifikationen (henholdsvis MB-AL og MB-CL). Vi undersøgte først størrelsesfordelingen af cDNA-indsatserne, som vist i figur 3a. resultaterne af fluorescensintensitetssignaler opnået fra gelfarvningsbilledet viste, at cDNA-indsatsstørrelserne på MB-AL og MB-CL var ens, men toppunktet var lidt mindre i MB-AL (0,65 kb) sammenlignet med det i MB-CL (0,8 kb). Dernæst analyserede vi 3 ‘ – end-sekvenser af tilfældigt samplede cDNA-kloner fra hvert bibliotek. Klyngeresultaterne for disse udtrykte sekvenskoder (Est ‘ er) er vist i figur 3b og antyder, at kompleksiteten af MB-AL var så høj som MB-CL. Det er dog værd at bemærke, at meget overflødige cDNA-kloner forsvandt i MB-AL. Ved en statistisk analyse (Chi-test) blev det påvist, at forskellen i afskedigelser mellem MB-AL og MB-CL var signifikant (sandsynligheden for, at afskedigelserne i MB-AL og MB-CL er ens, er <0,001). Derudover undersøgte vi integriteten af 3’ ender af cDNA ‘ er ved at analysere, om hver EST indeholdt en polyadenyleringssignal sekskamer eller ej. Resultaterne viste, at 80,1% og 87,3% af cDNA-kloner i henholdsvis MB-AL og MB-CL indeholdt plausible polyadenyleringssignalsekvenser (21). Faldet i forekomsten af polyadenyleringssignaleksamere i MB-AL indikerede sandsynligvis en stigning i antallet af cDNA-kloner, hvor cDNA-syntese blev internt primet på grund af to runder dt-priming.
Ved mikroarray-hybridisering undersøgte vi cDNA-populationen af MB-AL i sammenligning med MB-CL. Figur 3c viser et scatter plot af hybridiseringssignaler af MB-AL og MB-CL mål. Resultaterne indikerede en betydelig høj korrelation af hybridiseringssignaler mellem MB-AL og MB-CL mål, hvilket tyder på, at der ikke var en skadelig virkning af amplifikationen i cDNA-populationen.
endelig udførte vi RNA blot hybridiseringsanalyse for at undersøge størrelse-bias effekter med opmærksomhed på husholdnings gener (figur 3D). For ribosomalt S6-protein og hsp 70 var cRNA-størrelser både i MB-AL og MB-CL ens og sammenlignelige med dem, der forventes af deres rapporterede nukleotidsekvenser. Hybridiseringsmønsteret for HSP 70 Crna ‘ er i MB-AL var imidlertid lidt anderledes end det i MB-CL, hvilket indikerer, at størrelsen-bias-effekten ikke blev fjernet fuldstændigt.
metoden til cDNA-bibliotekskonstruktion beskrevet i denne rapport blev udtænkt for at minimere størrelsesforstyrrelser under amplifikationstrin assisteret af RNA-polymerase. En sådan RNA-polymeraseassisteret bibliotekskonstruktionsmetode fra en lille RNA-pool til omfattende sekventeringsanalyse er ikke blevet undersøgt godt, mens cDNA/cRNA-bibliotekskonstruktionsmetoder til mikroarray-hybridisering er blevet aktivt forfulgt. Selvom Lukyanov et al. (23) og Piao et al. (24) rapporterede metoder, der bruger PCR-amplifikation til at konstruere et cDNA-bibliotek ud fra en submikrogrammængde af total RNA, har PCR-amplifikation iboende ulemper såsom svær størrelse og populationsforstyrrelse og lav troskab af cDNA-amplifikation. Derfor forsøgte vi at udvikle en cDNA-bibliotekskonstruktionsmetode baseret på RNA-polymeraseassisteret amplifikation i denne undersøgelse.
til dette formål udtænkte vi en ny RNA-polymeraseassisteret amplifikationsstrategi som vist i Figur 1, fordi metoderne til Ebervine et al. (5), Huang et al. (10), og Lin et al. (11) har stadig ulemper til fremstilling af et plasmidindesluttet cDNA, der er egnet til omfattende genstrukturanalyse. I førstnævnte udføres cDNA-syntese efter cRNA-amplifikation med tilfældige sekskamere, og dette gør de forstærkede cDNA ‘ er uundgåeligt kortere end de originale (5,7). I sidstnævnte er introduktionen af en homopolymerisk hale ved den første streng cDNA-ende ved terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) eller Moloney murine leukæmivirus (MMLV) revers transkriptaseaktivitet (10,11) giver mening at minimere størrelsen-bias effekt under RNA-polymeraseassisteret amplifikation som i vores metode. Imidlertid er den homopolymeriske halemetode kendt for at forårsage trunkering af cDNA ‘ er på grund af uventet priming af cDNA-syntese fra en homopolymerisk strækning af interne RNA-sekvenser. Fordi adapterligationsmetoden beskrevet i denne undersøgelse kunne tilvejebringe en specifik sekvens for cDNA-priming, kunne vi forvente at reducere omfanget af cDNA-trunkering ved hjælp af vores metode.
i princippet bør vores metode kun forstærke cDNA ‘ erne flankeret af en iboende poly(A) hale og SP6-adaptersekvensen, som blev genereret i cDNA-syntesen i første runde. Resultaterne vist i figur 2 og figur 3a var i det væsentlige i overensstemmelse med dette, skønt cDNA-populationen i det mindre størrelsesområde var lidt forøget. Resultaterne af RNA blot analyse (figur 3D) viste også, at størrelsen-bias effekt kunne reduceres, men ikke helt fjernet, selv i vores metode. Dette skyldtes sandsynligvis, at trunkerede cDNA ‘ er tilføjet af en poly(A) hale og SP6-promotorsekvensen blev genereret under konvertering af cRNA til cDNA. Denne opfattelse blev understøttet af det faktum, at forekomsten af polyadenyleringssignalsekvenserne i MB-AL var signifikant lavere end den, der blev observeret i det konventionelle cDNA-bibliotek (21). Trunkering af cDNA ‘ er kan forekomme under cDNA-syntese på grund af intern priming af RNA med DT-tailed primer og SP6 primer. Fordi homopolymeriske strækninger ofte forekommer i eukaryote mRNA ‘ er, den homopolymeriske halemetode kan pålægge mere alvorlig størrelsesforstyrrelse på Crna-forstærkning med flere runde end vores adapter-ligeringsmetode. Selvom hævning af reaktionstemperaturen under revers transkription og nedsættelse af primerkoncentrationen kunne undertrykke den afvigende interne priming i cDNA-syntese til en vis grad, det vides at være vanskeligt at eliminere dette på nuværende tidspunkt fuldstændigt. Således, selvom vi udførte to-runde cRNA-forstærkning til demonstration af den samlede protokol, anbefaler vi i praksis at springe over cRNA-amplifikationen i anden runde, når der kan opnås tilstrækkelig cRNA i første runde-reaktionen.
i betragtning af disse resultater konkluderer vi, at vores nye metode er nyttig til cDNA-bibliotekskonstruktion fra en lille mængde start-RNA. Faktisk har vi med succes og rutinemæssigt brugt denne metode til konstruktion af cDNA-biblioteker, når mængden af total RNA er mindre end 1-larg (data ikke vist). Fordi 1 larg Total RNA kunne udvindes fra 105-106 pattedyrceller eller 1 mg pattedyrvæv, kan cDNA-biblioteker let konstrueres fra celler fraktioneret af cellesorterere eller mikrodissektion ved hjælp af vores metode. Desuden, fordi vi beregner, at denne metode gør det muligt for os at opnå mere end 105 cDNA-kloner fra 1 pg total RNA, som er tæt på mængden af total RNA i en enkelt celle, kan et enkeltcelleafledt cDNA-bibliotek konstrueres baseret på denne adapter-ligeringsassisteret cRNA-amplifikation.
anerkendelser
forfatterne er taknemmelige for instruktionen af statistisk analyse fra Dr. Undersøgelsen blev støttet af et tilskud fra Kasusa DNA Research Institute til R. O., R. F. K. og O. O.
konkurrerende interesser Erklæring
forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
- 1. K. Shibata, T. Ohsumi, M. Itoh, M. Kamiya, K. Shibata, et al.. 1996. Høj effektivitet fuld længde cDNA kloning af biotinyleret CAP trapper. Genomik 37: 327-336.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 2. N. Nakajima, M. Ohira, N. Seki og N. Nomura. 1997. Konstruktion og karakterisering af cDNA-biblioteker med menneskelig hjerne, der er egnede til analyse af cDNA-kloner, der koder for relativt store proteiner. DNA Res. 4: 53-59.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 3. Det er et af de mest kendte og mest kendte steder i verden. 1997. Konstruktion og karakterisering af en fuld længde-beriget og en 5′-end-beriget cDNA bibliotek. Gen 200: 1149-1156.Crossref, Google Scholar
- 4. Ohara, O. og G. Temple. 2001. Retningsbestemt cDNA-bibliotekskonstruktion assisteret af in vitro-rekombinationsreaktionen. Nukleinsyrer Res. 29: e22.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 5. Det er en af de mest populære og mest populære måder at gøre det på. 1992. Analyse af genekspression i enkelt levende neuroner. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3010-3014.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 6. Det er en af de mest populære og mest populære destinationer i verden. 2000. High-fidelity mRNA-amplifikation til genprofilering. Nat. Biotechnol. 18:457–459.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 7. Baugh, L. R., A. A. Hill, E. L. Brunog C. P. Hunter. 2001. Kvantitativ analyse af mRNA-amplifikation ved in vitro-transkription. Nukleinsyrer Res. 29: e29.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 8. L. Diatchenko, A. Chenchik og P. D. Siebert. 2001. Anvendelse af SMART-larp-genereret cDNA til genekspressionsstudier i flere humane tumorer. Bioteknologi 30: 158-163.Link, CAS, Google Scholar
- 9. Gomes, L., R. Silva, B. S. Stolf, E. B. Cristo, R. Hirata, Jr., F. A. Soares, L. Reis, E. J. Neves, et al.. 2003. Sammenlignende analyse af amplificeret og nonamplified RNA til hybridisering i cDNA microarray. Anal. Biochem. 321:244–251.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 10. Huang, J., T. Lin, D. Chang, S. Lin og S. Ying. 2003. Trunkeret Bcl-2, en potentiel præ-metastisk markør i prostatacancer. Biochem. Biofys. Res. Commun. 306:912–917.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 11. Lin, S. L. og S. Y. Ying. 2003. mRNA / cDNA bibliotek konstruktion ved hjælp af RNA-polymerase cykling reaktion. Metoder Mol. Biol. 221:129–143.Medline, CAS, Google Scholar
- 12. M. V., M. V. 2003. Amplifikation af repræsentative cDNA-puljer fra mikroskopiske mængder dyrevæv. Metoder Mol. Biol. 221:103–116.Medline, CAS, Google Scholar
- 13. Petalidis, L., S. Bhattacharyya, G. A. Morris, V. P. Collins, T. C. Freeman og P. A. Lyons. 2003. Global forstærkning af mRNA ved skabelon-skifte PCR: linearitet og anvendelse til mikroarray analyse. Nukleinsyrer Res. 22: e142.Crossref, Google Scholar
- 14. Det er en af de mest almindelige årsager til, at en person er i stand til at vælge en person, der er i stand til at vælge en person, der ikke er i stand til at gøre det.. 2003. Troskab og forbedret følsomhed af differentielle transkriptionsprofiler efter lineær amplifikation af nanogrammængder af endotel mRNA. Physiol. Genomik 13: 147-156.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 15. C. D. Pepper, Y. Hey og C. J. Miller. 2004. Amplifikationsprotokoller introducerer systematiske, men reproducerbare fejl i genekspressionsundersøgelser. Bioteknologi 36: 498-506.Link, CAS, Google Scholar
- 16. Ohara, O., T. Nagase, G. Mitsui, H. Kohga, R. Kikuno, S. Hiraoka, Y. Takahashi, S. Kitajima, et al.. 2002. Karakterisering af størrelse-fraktioneret cDNA bibliotek genereret af in vitro rekombination-assisteret metode. DNA Res. 9: 47-57.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 17. Ohara, O. 2003. Konstruktion af størrelsesfraktioneret cDNA-bibliotek assisteret af en in vitro rekombinationsreaktion. Metoder Mol. Biol. 221:59–71.Medline, CAS, Google Scholar
- 18. Gubler, U. Og B. J. Hoffman. 1983. En enkel og meget effektiv metode til at generere cDNA-biblioteker. Gen 25: 263-269.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 19. Sambrook, J. og Russell. 2001. Fremstilling af plasmid-DNA ved alkalisk lysis med SDS, s.1.31-1.42. Molekylær kloning, (3.udgave). CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.Google Scholar
- 20. Kirke, G. M. og Gilbert. 1984. Genomisk sekventering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 21. Han er en af de mest kendte og mest kendte mennesker i verden. 2000. Mønstre af variantpolyadenyleringssignalbrug i humane gener. Genom Res. 10: 1001-1010.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 22. T. S., S. A. Jaradat, M. K. Lim, G. J. Kargul, M. J. Grahovac, S. Pantano, Y. Sano, et al.. 2000. Genom-dækkende ekspressionsprofilering af Mid-drægtighed placenta og embryo ved hjælp af en 15.000 mus udviklingsmæssige cDNA microarray. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 9127-9132.Crossref, Medline, Google Scholar
- 23. Lukyanov, K., L. Diatchenko, A. Chenchik, A. Nanisetti, P. Siebert, N. Usman, M. Matts og S. Lukyanov. 1997. Konstruktion af cDNA-biblioteker fra små mængder total RNA ved hjælp af supression PCR-effekten. Biochem. Biofys. Res. Commun. 230:285–288.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 24. Piao, Y., N. T. Ko, M. K. Limog M. Ko. 2001. Konstruktion af langtranskripter berigede cDNA-biblioteker fra submikrogrammængder af samlede RNA ‘ er ved en universel PCR-amplifikationsmetode. Genom Res. 11: 1553-1558.Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
