resultater og diskussion

I pattedyrssystemer har Cdc42-aktivitet vist sig at være vigtig i reguleringen af hudstamme/stamfadercelledifferentiering i hårsækkeceller, styring af neuroepitelial stamme/stamfaderpolaritet og hjernehalvkugleformet bifurcation og regulering af celletal og vækst i den perinatale udviklingsperiode (6-9). Interessant nok afslører en undersøgelse af Cdc42-aktivitet hos voksne mus i forskellige aldre, at det relative Cdc42-GTP-niveau hos ældre dyr er signifikant højere end hos yngre i forskellige væv, herunder hjerte, hjerne, lunge, lever, knoglemarv, milt og nyre (Fig. 1 A og data ikke vist), hvilket øger muligheden for, at øget Cdc42-aktivitet er involveret i den normale aldringsproces.

for at afgøre, om den øgede Cdc42-aktivitet forbundet med naturlig aldring kan have fysiologisk relevans, undersøgte vi den Cdc42-negative regulator, Cdc42GAP, i genmålrettede mus, efter at de har nået voksenalderen. Tidligere undersøgelser af de homosygøse cdc42gap-knockout-mus i den perinatale periode viste, at forskellige væv/celler indeholdt forhøjet Cdc42-GTP, og embryonerne/nyfødte hvalpe af Cdc42GAP −/− genotypen viste reduceret organ/organismestørrelse, der er relateret til øget spontan apoptose i forskellige celletyper (6). Hos voksne Cdc42GAP−/− mus var Cdc42-aktiviteten konstitutivt højere i flere vævs-/celletyper end for de matchende VÆGTMUS, hvorimod niveauet af RhoA-GTP eller Rac1-GTP forblev svarende til niveauet for vægt (Fig. 1b; data ikke vist), hvilket tyder på en specifik gain-of-Cdc42-aktivitet hos de voksne dyr svarende til den i perinatalperioden. Størstedelen af Cdc42GAP – / – mus døde i den nyfødte periode på grund af deres mindre størrelse og svage fysik (6). Imidlertid kunne en andel af dem (kr.7%) overleve den nyfødte periode under plejehjem ved ikke-relaterede pleje af kvinder. På trods af regelmæssigt mælkeindtag og normale serumglukose− og insulinkoncentrationer , der blev fundet hos homosygøse mus i den postnatale periode, begyndte vægtøgning af Cdc42GAP−/ – mus at aftage ved 3-måneders alderen sammenlignet med 5-måneders alderen for vægt eller heterosygøse mus, og de modne homosygoter blev 30% reduceret i kropsvægt på grund af et fald i den samlede cellularitet (Fig. 1 C og data ikke vist). Den mediane levetid for Cdc42GAP – / – musene var 12 måneder, mens kontrolmusene forblev vitale indtil en medianalder på 27 måneder (Fig. 1 D). Overlevelseskurven for de homosygøse mus er noget forskellig fra den typiske gompert-kurve, men svarer til dem, der er rapporteret for BubR1 (en mitotisk kontrolpunktsregulator) knockout (10) eller p44 (en kort isoform af p53-tumorundertrykkeren) transgene (11) dyr. Kyphos og manglende kraft i Cdc42GAP – / – mus blev tydelige i en alder af 12 måneder (Fig. 1 E). Flået Cdc42GAP – / – mus ved 15 måneders alderen viste en klar reduktion i kropsmasse, et betydeligt tab af subdermalt fedtvæv, svær lordokyphosis og muskelatrofi (data ikke vist). En røntgenscanning viste en signifikant kyphosefænotype og reduceret knoglemineraltæthed (BMD) i Cdc42GAP−/− mus i en alder af 15 måneder (Fig. 1 F). Yderligere kvantificering af de dissekerede knogler af Cdc42GAP−/− mus afslørede 3 – og 2,6 gange reduktioner af BMD i henholdsvis skinneben og lårben (SI Fig. 7). Derudover mistede både mandlige og kvindelige Cdc42GAP−/− mus fertilitet i en tidligere alder sammenlignet med vægt. Ved parring mellem Cdc42GAP – / – hunner og vægt hanner blev homosygoterne ufrugtbare ved 26 uger gamle sammenlignet med 48 uger gamle for vægt (Fig. 1 G). Disse observationer indikerer, at Cdc42GAP-mangel resulterer i det konstitutivt forhøjede Cdc42-GTP-niveau, reduceret kropsstørrelse, tidlig kyphos, reduceret BMD, forkortet fertilitetsperiode og reduceret levetid hos voksne mus.

H&E farvede sektioner gennem den 8 måneder gamle kvindelige musvertebrale krop viste, at Cdc42GAP- / -musene havde en tyndere, bøjet bark og tyndere trabeculae sammenlignet med VÆGTMUS (Fig. 2 a). På samme måde viste længdesektionerne af lårbenet hos de homosygøse mus en reduktion af kortikal knogletykkelse sammenlignet med den for VÆGTMUS (data ikke vist). Disse observationer er i overensstemmelse med det grove udseende og kliniske træk ved osteoporose. Milten, leveren og nyrerne hos voksne Cdc42GAP−/− mus blev reduceret i masse på grund af et fald i den samlede cellularitet, hvilket var tydeligt i h&e-farvede sektioner af milten, og de T-og B-celleholdige hvide pulpregioner i 12 måneder gamle Cdc42GAP-/− milt blev markant reduceret sammenlignet med dem hos aldersmatchede VÆGTMUS (Fig. 2 B og data ikke vist), hvilket tyder på udtalt lymfoid atrofi hos homosygoterne. I overensstemmelse med den tilsyneladende reduktion af subdermalt fedtvæv afslørede histologisk analyse af tværsnittene af dorsal hud et næsten fuldstændigt fravær af s.C. fedtceller i 9 måneder gamle Cdc42GAP- / -mus (Fig. 2 C). Et tab i muskelmasse og muskelatrofi blev også bekræftet ved undersøgelsen af h&E-farvede skeletmuskulatursektioner fra 12 måneder gamle Cdc42GAP-/-mus og de aldersmatchede VÆGTMUS (Fig. 2 C). Cdc42GAP – / – musene viste også markant reduktion i hårregenerering efter fjernelse af dorsalhåret ved barbering, mens den alders – og kønsmatchede vægt viste robust hårgenvækst (SI Fig. 8). Evnen til at tolerere stress, såsom sårheling, en aldringsassocieret aktivitet (12) af Cdc42GAP-/− musene, blev signifikant reduceret sammenlignet med vægten (Fig. 2 D). Histopatologisk analyse af sårsektionerne viste ringe reepithelialisering i sårkanten af Cdc42GAP−/− musene, hvorimod fuldstændig reepithelialisering af VÆGTMUS var tydelig 4 dage efter, at såret blev introduceret (Fig. 2 E). Ud over disse observationer var en række hæmatopoietiske fænotyper af de homosygøse mus, herunder anæmi, nedsat milt og knoglemarvscellulariteter, defekter af hæmatopoietisk stamcelleindgravering til knoglemarven og øget følsomhed af hæmatopoietiske stamceller til induceret mobilisering (13, 14) i overensstemmelse med tidlig aldring i det hæmatopoietiske system. Det er vigtigt, at en undersøgelse af unge homosygøse mus (<4 måneder gammel) før manifestationen af åbenlyse fænotyper afslørede ingen større abnormiteter i knogle, hud og milt (SI Fig. 9 A og B og data ikke vist), hvilket antyder, at de aldringslignende fænotyper af Cdc42GAP-/− musene ikke skyldes en tidlig udviklingsforstyrrelse. Desuden kunne et antal fænotyper af de homosygøse mus, herunder reduceret kortikal knogletykkelse, kyphos og tab af muskelmasse og epidermale væv, findes i de gamle (>2,5 år gamle) VÆGTMUS (SI Fig. 9 C og D og data ikke vist). Som opsummeret i Si-tabel 1 giver disse resultater samlet stærke beviser for, at Cdc42GAP-mangel forårsager for tidlig aldringslignende fænotyper hos dyrene.

farvning af væv fra 9 måneder gamle voksne, inklusive lever, nyre og milt, til senescensassocieret Karr-galactosidase (sa-Karr-gal) afslørede en stærk aktivitet af denne senescensmarkør i de homosygøse mus, der ikke kunne påvises i vævene i alders-og kønsmatchede VÆGMUS (Fig. 3 A og Si Fig. 10), hvilket indikerer, at Cdc42GAP – / – voksenvæv kan gennemgå for tidlig aldring. Interessant nok var øget apoptose af de homosygøse væv, der blev observeret i perinatalperioden, fraværende hos de voksne homosygoter, når den forhøjede SA-Larus-gal-aktivitet var tydelig (ref. 6 og data ikke vist). Cdc42GAP – / – mus embryonale fibroblastceller (MEF) celler, som indeholder 3 gange højere cdc42-GTP, men normalt Rac1-GTP-eller RhoA-GTP-indhold sammenlignet med vægt-MEF-celler (6), udviste signifikant øget SA-Karr-gal-aktivitet og akkumulerede en flad og forstørret senescent morfologi, der begyndte ved passage 6, Når vægt-MEF-celler var negative for SA-Karr-gal-aktivitet og var kontraktlige i morfologi (Fig. 3 B og SI Fig. 11). Cdc42GAP – / – MEF-cellerne begyndte at aftage i vækst ved passager 5-7, da de matchede vægt-MEF-celler voksede eksponentielt (Fig. 3 C) (6), og de gennemgik massiv replikativ senescens efter passage 7, hvorimod de fleste vægt MEF-celler ikke nåede senescens før passage 13 (SI Fig. 11 og data ikke vist). Derudover dannede en signifikant højere procentdel af Cdc42GAP−/− MEF-celler ved passage 7 større foci i kernen end VÆGTCELLER (SI Fig. 12). Disse resultater indikerer, at Cdc42GAP-mangel inducerer tidlig væv / celle senescens.

en velkendt medvirkende faktor til for tidlig aldring af pattedyr og cellens aldring er øget genomisk ustabilitet (15). Metafasespredningsanalyse viste, at>30% primære splenocytter fra 8 måneder gamle homosygøse mus var aneuploide, mens alder-og kønsmatchede SPLENOCYTTER ikke havde nogen påviselig aneuploidi (Fig. 3 D), hvilket indikerer, at Cdc42GAP−/− vævet LED genomisk ustabilitet. Til støtte for dette fund viste Cdc42GAP−/− MEF-celler en signifikant stigning i dobbeltkerneceller under DAPI-farvning sammenlignet med VÆGTCELLER ved passage 7 (SI Fig. 12). Karyotypeanalyse af de senere passager af MEF− celler (passage 6-7) afslørede yderligere, at selv om de fleste kromosomer fra VÆGTCELLER (80%) forblev intakte, indeholdt 42% af Cdc42GAP−/ – celler mindst en kromosomafvigelse, 20% indeholdt to eller flere aberrationer, og 14% indeholdt tre eller flere aberrationer (Fig. 3 E). Procentdelen og graden af aneuploidi steg også signifikant i Cdc42GAP – / – MEF-celler, hvor >32% af cellerne viste unormale kromosomtal fra 72 til 102, mens de fleste VÆGTCELLER var diploide (Fig. 3 E og SI Fig. 13). Karyotypeanalyse af de kromosomale skader indikerer, at afvigelserne af de homosygøse MEF-celler var forskellige, herunder kromatidbrud, for tidlig søsterkromatidseparation (et kendetegn ved et defekt spindelmonteringskontrolpunkt), translokation, kromosombrud, dicentrisk kromosom og kromosomfragmentering (Fig. 3 F og Si tabel 2), hvilket antyder, at DNA− skadesreparationsmaskineriet er kompromitteret i Cdc42GAP−/ – celler. Immunofluorescensfarvning af phospho-H2-økse i cellekernen, en DNA− skadesresponsmarkør (16), viser, at selvom 10% af passage 7 Cdc42GAP−/ – MEF-celler var positive for DNA-skademarkøren, <1% af VÆGTCELLER var positive (Fig. 3 G). Korrelationen mellem begyndelsen og progressionen af de aldringslignende fænotyper af Cdc42GAP-/− musene og den observerede grad og sværhedsgrad af de genomiske aberrationer i Cdc42GAP− / − celler understøtter en rolle af Cdc42 i udviklingen af progeroidfunktionerne.

for at bestemme den mulige mekanisme for de akkumulerede DNA− skader i Cdc42GAP−/ – celler sammenlignede vi det endogene reaktive iltartsniveau (ROS) for de homosygøse celler med niveauet for VÆGTCELLER, fordi Rac1 og Rac2, to nært beslægtede Rho Gtpaser, er kendte regulatorer af cellulær ROS (17). SI Fig. 14 viser, at Cdc42GAP – / – celler viste en ROS-aktivitet svarende til den for VÆGTCELLER, hvilket indikerer, at Cdc42GAP regulerer genomisk stabilitet gennem en endogen ROS-uafhængig mekanisme. På grund af lighederne mellem flere cdc42gap−/− musefænotyper og dem fra et antal genmålrettede musemodeller af DNA−skadesreparationsmolekyler, herunder Brca1−/− p53+/−, Ku80−/−og MTR−/− VRN− musemodeller (12, 18, 19), undersøgte vi yderligere reaktionsevnen af de tidlige passagerede Cdc42GAP – / – celler til forskellige DNA-skademidler. I DNA-skadesresponsvækstanalysen viste de Cdc42GAP-mangelfulde celler en bred defekt af DNA-skadesreparationsaktivitet (Fig. 4), som manifesterede sig som signifikant højere procentdele af celledød blandt de homosygøse celler sammenlignet med VÆGTCELLER efter behandling ved stigende doser af H 2O2, ioniserende bestråling, camptothecin, methyl-methansulfonat eller mitomycin C. Således kan de akkumulerede forskellige genomiske abnormiteter, der findes i de senere passager af Cdc42GAP−/− celler, i det mindste delvis tilskrives nedsatte DNA-skadesreparationsaktiviteter.

en konsekvens af vedvarende genomisk skade i cellerne er induktion af multiple DNA-skadesrespons og / eller senescensgener (20, 21). Udtrykkene for p53, p21Cip1, p16Ink4a og phospho-p53 (Ser-15) i Cdc42GAP−/− MEF-celler var signifikant højere end for vægt MEF-celler efter lignende passager, hvorimod p19ARF i de homosygøse celler viste en lignende tendens til stigning med passager, ligesom VÆGTCELLERNE (Fig. 5 a). Proteinniveauerne af p53, p21Cip1, p16Ink4a, phospho-p53 (Ser-15) og DNA-skademarkøren phospho− H2− øksen i Cdc42GAP-/-væv fra 8 måneder gamle mus var også signifikant højere end dem i de tilsvarende væv fra matchede VÆGTMUS (Fig. 5 B). Disse resultater giver bevis for, at aktivering af den p53-regulerede vej, især p21Cip1 og p16Ink4a, er forbundet med Cdc42GAP-mangelinduceret tidlig senescens. For at undersøge spørgsmålet om, hvorvidt forhøjet Cdc42-aktivitet i de Cdc42GAP-mangelfulde celler er tilstrækkelig til at redegøre for den tidlige senescensfænotype, udtrykte vi en aktiverende mutant af Cdc42, Cdc42F28L, i primære vægt MEF-celler og analyseret for cellernes sa-kurr-gal-aktivitet i sammenligning med den af matchende EGFP-ekspressive celler ved forskellige passager. Cdc42F28L-ekspression forårsagede en signifikant stigning i SA-Krish-gal-positiv cellepopulation (35% i Cdc42F28L-celler sammenlignet med 7% i EGFP-ekspressive celler) i tidlige passagerede MEF-celler (Fig. 5 C), hvilket indikerer, at Cdc42-aktivering er tilstrækkelig til induktion af tidlig celleforældelse.

for yderligere at undersøge muligheden for, at senescensfænotypen af Cdc42GAP−/− celler kan reddes af en p53−defekt, genererede vi Cdc42GAP+/− p53+ / – mus og forsøgte at forberede MEF-celler fra krydset. Af 44 embryoner blev seks med Cdc42GAP−/ – p53+ / – genotypen og ingen af Cdc42GAP−/−p53−/− genotypen opnået. Cdc42GAP−/ – p53+ / – MEF-cellerne voksede med en hastighed mellem den for p53+/− og VÆGTCELLER og viste en basal senescent population sammenlignelig med den for p53+/− eller VÆGTCELLER ved passage 7, hvorimod p53−/− og Cdc42GAP−/− MEF-cellerne spredte sig med en lineær kurve og en bøjningspopulation fordoblingskurve og var henholdsvis senescensresistente og senescens-tilbøjelige ved tilsvarende passager (Fig. 5 D og E). Disse resultater indikerer, at Cdc42 aktiveringsinduceret for tidlig aldring afhænger af p53.

den begrænsede levetid for celler og dyr kan skyldes replikativ senescens som reaktion på forskellige belastninger, herunder DNA-skade (22), telomer erosion (23), ROS (24) og/eller uhensigtsmæssigt aktiverede onkogener (25). Cdc42GAP – / – musene præsenterer en gain-of-Cdc42-aktivitet dyremodel, der efterligner mitogen signalinduceret Cdc42-aktivering (6) og tillader en vurdering af de mulige virkninger af Cdc42-aktivering på dyre-og cellefysiologi. Vi demonstrerer, at Cdc42GAP-mangel forårsager den tidlige begyndelse af aldring i celler og for tidlig aldringslignende fænotyper i dyret. Især inducerer Cdc42GAP-genmålretning en global stigning i Cdc42-aktivitet og fremmer cellegenomisk ustabilitet med reduceret DNA-skadereparationsevne, som igen kan aktivere p53 og p16 Ink4a, hvilket fører til tidlig aldring (Fig. 5 F). Tidligere har Cdc42 vist sig at være aktiveret i senescent celler for at modulere morfologisk justering (26). Det er også blevet foreslået at være involveret i p53-reguleret cellemorfologisk ændring, apoptose og proliferation (27-29) og i c-Jun N-terminal kinase-kontrolleret apoptose (30, 31), begivenheder, der har været forbundet med cellulær aldring og aldring af dyr (32, 33). Vores fund om, at Cdc42-aktivering er forbundet med naturlig aldring, og at Cdc42GAP-mangel forårsager en DNA-skadesreparationsfejl for at give celler mulighed for at akkumulere genomiske abnormiteter, der fører til tidlig aldring, antyder yderligere en funktionel forbindelse mellem Cdc42-aktivitet og aldring af pattedyr.

aktivering af p53-vejen eller forstyrrelsen af gener involveret i DNA-skadereparation eller genomisk stabilitetsregulering har vist sig at inducere tidlig aldring hos mus (11, 12, 33, 34). I overensstemmelse med tidligere observationer, at Cdc42 muligvis ikke er involveret i regulering af cellulære superokteaktiviteter (17), fandt vi, at den akkumulerede DNA− skade i Cdc42GAP−/ – celler ikke er forbundet med ROS-aktiviteten, fordi homosygøse celler ikke viser øget ROS-aktivitet. Cdc42GAP-sletning forårsager en markant reduktion af DNA-skadesreparationsevne i et bredt spektrum, herunder reaktioner på DNA-tværbindingsmidlet og dobbeltstrengsbrud eller enkeltstrengsbrudsinducer, hvilket antyder, at langvarig aktivering af Cdc42 kan dæmpe DNA-skadesreparationsevne. Mangfoldigheden af den genomiske skade, der findes i Cdc42GAP−/− cellerne, er også i overensstemmelse med en påvirkning fra en global DNA-skadesreparationsfejl. De vigtige spørgsmål, der stadig skal behandles, inkluderer, hvilke specifikke molekylære determinanter der er involveret i Cdc42GAP-reguleret DNA-skadereparation, og hvilke opstrømssignaler der forårsager øget Cdc42-GTP under den normale aldringsproces.