abstrakt

baggrund. Ekspression af human CD133 (human prominin-1) i kræftceller er blevet postuleret til at være en markør for stamceller og betragtes som en formodet markør for kræftstamceller (CSC ‘ er). Vi designede en undersøgelse for at beskrive ekspressionsmønsteret for CD133 i normal hud og i epitheliale kutane neoplasmer. Metode. CD133 immunhistokemisk ekspression af treogfyrre eccrine og apokrine tumorer blev sammenlignet med den, der blev observeret i andre epiteltumorer i huden. Derudover blev strømningscytometri anvendt til at detektere CD133-ekspressionen af fire epitelhudneoplasmer, inklusive et porocarcinom. Resultat. CD133 immunoreaktivitet ved den apikale eller ved den apikolaterale overflade af celler, der danner kirtelstrukturer, blev observeret. Celler fra faste områder af godartede eller ondartede tumorer blev ikke farvet. De porocarcinomafledte kulturceller viste en 22% af CD133 positive celler ved anvendelse af strømningscytometri, mens pladecellecarcinomkulturer indeholdt mindre end 0,1%. Konklusion. Disse observationer indikerer, at CD133 er en specifik markør for glandulær differentiering, der kunne inkluderes i det diagnostiske panel af kutane tumorer med mulig eccrin eller apokrin differentiering. Imidlertid bør brugen af CD133-ekspression som markør for CSC ‘ er fortolkes med forsigtighed i hudeksperimenter.

1. Introduktion

i de sidste par år er der rapporteret om en voksende mængde beviser, der understøtter forestillingen om, at evnen til at opretholde tumordannelse og vækst udelukkende ligger i en lille population af celler kaldet kræftstamceller (CSC ‘ er). Søgning efter markører, der demonstrerer den stamcellelignende fænotype af disse tumorinitierende celler, er et aktivt undersøgelsesfelt, og flere stamcellemarkører er for nylig blevet beskrevet i hudtumorer .

CD133 er den humane homolog af mus prominin-1, et fem transmembran domæne celleoverfladeglycoprotein, der har fået bemærkelsesværdig opmærksomhed på grund af dets ekspression begrænset til forskellige somatiske stamcelleunderpopulationer . Dette overfladeantigen blev opdaget som et mål for et monoklonalt antistof defineret som Mab AC133, en markør udtrykt ved en underpopulation af CD34-positive hæmatopoietiske stamceller afledt af human føtal lever og knoglemarv . Efterfølgende blev CD133 påvist i forskellige humane normale væv, herunder nyre, prostata, hjerne og bugspytkirtel, og fundet at være specifikt forbundet med mikrovilli og andre plasmamembranfremspring . Desuden er dette antigen også blevet identificeret i hæmatologiske maligniteter og i flere faste humane neoplasmer, herunder glialtumorer, prostatacarcinom, nyrekarcinom, hepatocarcinom, kolorektal carcinom og malignt melanom . Formålet med mange af disse undersøgelser var at bestemme eksistensen af CSC ‘ er, defineret som en lille gruppe kræftceller, der har kapacitet til selvfornyelse, tumorinitiering og vedligeholdelse af tumorvækst. Antistoffer, der rutinemæssigt anvendes til oprensning af AC133-positive celler, retter sig mod dårligt karakteriserede glycosylerede epitoper med usikker specificitet. Selvom den funktionelle aktivitet af CD133 stadig er kontroversiel , og dens fysiologiske funktion endnu ikke er bestemt, bliver det klart, at dette celleoverfladeprotein er en unik markør for både plasmamembranfremspring og membranmikrodomæner . Det er blevet foreslået, at CD133 i denne cellulære placering kan fungere som en regulator af membranlipidsammensætning, eller den kan deltage i mekanismerne for cellepolaritet og migration .

i tidligere undersøgelser, der rapporterer CD133 immunhistokemisk farvning af humant kirtelepitel, såsom spytkirtler, lacrimale kirtler, bugspytkirtelkanaler, endocervikale kirtler og svedkirtler, er der beskrevet et ejendommeligt mønster af CD133-ekspression . I disse epithelier har CD133 vist sig at være lokaliseret til plasmamembranfremspring ved de apikale områder af polariserede celler. Et lignende cd133 apikalt cytoplasmatisk farvningsmønster af celler, der omgiver et lumen, er også blevet observeret i carcinomer fra æggestok, tyktarm eller bugspytkirtel .

fundet af CD133 antistoffarvning svedkirtelceller fik os til at designe en undersøgelse, som vi nu rapporterer, for at evaluere ekspressionen af CD133 i hud eccrine og apokrine tumorer.

2. Materialer og metoder

2.1. Tilfælde

en retrospektiv søgning hentet 43 tidligere diagnosticerede hud eccrine og apokrine adneksale tumorer fra filerne fra afdelingen for patologi på Albacete Universitetshospital. Glasrutschebaner, paraffinblokke og histopatologiske rapporter fra alle tilfælde blev opnået. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). Tilfælde af basalcellekarcinom () og pladecellecarcinom () blev også inkluderet i denne undersøgelse for at sammenligne resultaterne opnået i disse neoplasmer med dem opnået i svedkirteltumorer. For at evaluere CD133-ekspressionen i normal hud analyserede vi hud fra forskellige områder opnået fra marginerne af seks kirurgisk resekterede tumorer i huden og fra tre obduktioner.

til dyrkning af hudkræftceller blev der opnået syv prøver fra humane hudtumorer, der svarede til et eccrin porocarcinom og seks pladecellecarcinomer. Frisk væv fra disse tilfælde blev inkluderet i Dulbecco ‘s Modified Eagle’ s medium (DMEM) suppleret med penicillin/streptomycin og fungison umiddelbart efter kirurgisk resektion.

2, 2. Immunhistokemi

formalinfast, paraffinindlejrede vævssektioner 4 liter brede blev skåret, deparaffineret i ksilen og rehydreret i en graderet serie ethanol. Endogen peroksidaseaktivitet blev blokeret med 3% H2O2 i 5 minutter. Slides blev behandlet med varmeinduceret epitopudtagning og immuniseret med tre forskellige anti-CD133 monoklonale antistoffer: Ac133 monoklonalt antistof, 293c3 monoklonalt antistof og ac141 monoklonalt antistof (alle fra Miltenyi Biotec, Tyskland). Antistoffer blev testet ved forskellige fortyndinger og inkubationstider. CD133-detektion blev udført ved hjælp af EnVision-systemet-HRP (Dako, Glostrup, Danmark) i en DakoCytomation Autostainer-platform i henhold til producentens anvisninger. Diaminobensidin (DAB substratsystem, Dako, Glostrup, Danmark) blev anvendt som kromogen. Fra de tre forskellige anti-CD133-antistoffer, der blev testet, arbejdede kun et, AC133 monoklonalt antistof, i paraffin. De to andre testede antistoffer mislykkedes, fordi sektioner inkuberet med disse antistoffer ikke viste nogen farvning, eller fordi den immunfarvning, der blev observeret, når høje koncentrationer af antistofferne blev anvendt, blev betragtet som uspecifik (lignende farvning blev observeret i negative kontroller). Det monoklonale ac133-antistof gav pålidelige resultater på de testede paraffinindlejrede sektioner. Vi etablerer for dette antistof en 1: 10 fortynding og 40 minutters inkubation ved stuetemperatur som de foretrukne arbejdsforhold. Efterfølgende blev alle forsøgene udført under disse forhold.

sektioner af hud med normale svedkirtler blev brugt som positive kontroller. Derudover blev normale svedkirtler fra huden ved siden af neoplasmerne anvendt som interne positive kontroller, når de var til stede i sektionerne. Negative kontroller blev udført ved at udelade anti-CD133-antistoffet under den primære antistofinkubation.

immunhistokemisk farvning af faste områder og af acinar-eller duktale strukturer fra tumorerne blev evalueret separat. CD133-farvning blev klassificeret ved hjælp af en semikvantitativ skala. Acinar eller duktale strukturer blev vurderet som følger: ( – ) ingen farvning; ( + ) farvning af sekretorisk materiale i lumen af isolerede kanaler eller acini og/eller svag farvning af den apikale eller luminale grænse af få kanaler eller acini; ( ++ ) klar farvning af den apikale eller luminale grænse for de fleste kanaler eller acini, der er til stede i tumoren; ( + + + ) farvning af den apikale eller luminale grænse for alle kanaler eller acini, der er til stede i tumoren. CD133-ekspression blev evalueret af to seniorpatologer (EP og SYNC) på en blindet måde uden kendskab til klinisk og patologisk information. I tilfælde af uoverensstemmende vurderinger blev dias revurderet af begge patologer under et multihovedmikroskop, og der blev opnået en aftale.

2, 3. Kultur af kræftceller fra hudtumorer

Tumorfragmenter blev mekanisk og adskilt ved fordøjelse med kollagenase type Ia (2 mg / mL) (Gibco, Invitrogen) i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) ved 37 liter C i 2 timer. Celler blev filtreret gennem et 40 liter nylonnet og blev yderligere dissocieret ved seriel passage gennem serologiske pipetter. Fordøjet væv blev centrifugeret ved 1000 liter g i 10 minutter, og pelleten blev vasket flere gange for at opnå en enkeltcellesuspension. Isolerede celler blev belagt i kulturkolber og dyrket ved 37 liter C i dmem/F12-medier indeholdende 10% føtalt bovint serum og suppleret med penicillin/streptomycin og fungison.

2, 4. Strømningscytometrianalyse

alle eksperimenter blev udført på cellesuspensioner fremstillet ved første passage af primær kultur fra tumorer. Celler blev løsnet under anvendelse af 0,02% EDTA i phosphatbufret saltvand (PBS) i 15 minutter ved 37 liter C og vasket med PBS før farvning. Cellesuspensioner blev justeret til celler / mL og inkuberet med den anbefalede antistoffortynding (1/10) i 20 minutter i mørke (4 liter C). Prøver uden primært antistof blev anvendt som negative kontroller. Det anvendte antistof var anti-CD133 / 1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Ubundne antistoffer blev fjernet ved vask med PBS, og celler blev resuspenderet i et passende volumen af buffer. Analyse blev udført på et lsrii-strømningscytometer (BD Biosciences). Data blev analyseret ved hjælp af Summit V5.0. 1. 5170 program (Dako).

3. Resultater

3.1. Kliniske fund

patientkohorten bestod af 29 mænd og 23 kvinder i alderen fra 24 til 90 år (median, 49 år). Præsentationsstedet var variabelt, de fleste af dem lokaliseret på hoved-og nakkeområdet. Kliniske data er opsummeret i tabel 1. Alle patienter gennemgik ekscisional hudbiopsi.

3.2. Immunhistokemiske Fund

fra de tre forskellige monoklonale antistoffer testet på formalinfaste, paraffinindlejrede vævssektioner, og i overensstemmelse med tidligere rapporter gav kun AC133 følsomme og pålidelige resultater. Det samlede immunhistokemiske farvningsmønster observeret med dette antistof var tæt relateret til vævsarkitektur. Farvningen var hovedsageligt lokaliseret til den apikale overflade af celler, der dannede duktale eller kirtelstrukturer. Immunhistokemiske fund observeret i disse strukturer under anvendelse af anti-CD133-antistoffet er opsummeret i tabel 1 og er beskrevet nedenfor. Faste områder fra nogen af de undersøgte tumorer eller fra de testede basalcelle-og pladecellecarcinomer kunne ikke demonstrere CD133-positivitet.

3.2.1. Normalt væv

CD133-ekspression blev observeret ved den endoluminale eller apikale overflade af cellerne i acini og terminale kanaler i normale eccrine kirtler (Figur 1(a)). Intercellulære canaliculi dannet ved den laterale membran af eccrine celler placeret i den sekretoriske del af normale svedkirtler blev tydeligt farvet (Figur 1(b)) såvel som sekretionen fundet i lumen af eccrine kanaler. Farvning af normale apokrine kirtler ved de terminale kanaler blev observeret ved den apikale grænse af cellerne, skønt med en ujævn fordeling. I acinære områder af disse kirtler, hvor den apokrine halshugningssekretion var åbenbar, viste CD133 kun en svag eller negativ farvning.

(a)

(a)

(a)
(b)

figur 1

cd133 i normale eccrine kirtler pletter den endoluminale overflade af cellerne og svedkirtelsekretionen(a). Intercellulære canaliculi ved den laterale membran af eccrine celler observeres også (b).

3.2.2. Tumorer

CD133 blev ikke udtrykt i nogen af de testede pladecellekarcinomer eller basalcellekarcinomer. Ved hjælp af AC133-antistoffet viste de adneksale tumorer, der blev analyseret i dette arbejde, følgende farvningsmønster (opsummeret i tabel 1).

godartede tumorer med Eccrin eller apokrin differentiering. Alle eccrine spiradenoma-tilfælde præsenterede CD133 immunoreaktivitet ved den apikale membran i de kanallignende strukturer, der er til stede i tumorknudlerne. Den luminale overflade af epithelcellerne, der dannede de unilokulære cyster i alle de analyserede eccrine hidrocystoma-tilfælde, var også positiv. Kanaler og små cyster, der var til stede i tre af de seks eccrine poroma-tilfælde, viste intens farvning af det indre cellelag fra de prolifererede tubuli, og denne farvning var placeret ved cellernes endoluminale kant. De andre tre analyserede poromasager viste det samme farvningsmønster i de fleste tubuli, men med et (++) eller (+) farvningsmønster af CD133-positivitet. Kanallignende strukturer, der er til stede i de fire cylindroma tilfælde, viste også immunoreaktivitet ved epithelcellernes apikale membran. Farvningen af de fire chondroid syringomer var fremtrædende, og alle de tilstedeværende kanaler, der dannede lejlighedsvise forgreningsstrukturer, viste intens positivitet ved den apikale membran (figur 2). De udvidede og snoede kanaler, der fører ind i cystiske rum i alle syringocystoadenoma papilliferum-tilfælde, viste immunoreaktivitet ved den apikale del af epitelcellerne eller ved cysternes luminale overflade med en intensitet, der varierede fra (++) til (+++) (figur 3). De fem tilfælde diagnosticeret som nodulært hidradenom viste isolerede kanallignende strukturer, som var positive for CD133 med en apikal farvning af cellerne, der dannede tubulerne (figur 4), der varierede i intensitet fra (++) til (+++). De to hidradenoma papilliferum-tilfælde viste også ekspression af CD133 ved den apikale del af kirtelstrukturerne. Kun to af de seks testede syringoma-tilfælde viste ensartet farvning ved luminaloverfladen af de små kanaler, der dannede tumorerne, som normalt var foret med to lag kubiske epitelceller. De apokrine hidrocystom-tilfælde kunne ikke påvise nogen positiv immunoreaktivitet.

figur 2

CD133 positivitet ved den indre overflade af chondroid syringoma forgreningsrør. Der ses ingen farvning af stromacellerne eller af ydre epitelceller.

figur 3

papillære fremspring af syringocystadenoma papilliferum foret med pseudostratificeret søjleepitel er CD133 positive. Positiviteten er meget intens ved den endoluminale overflade.

figur 4

lineær CD133 farvning af columnar celler foring tubuli af en hidradenoma tilfælde. Kun celler, der er placeret på rørets indre overflade, er farvede.

maligne tumorer med Eccrin eller apokrin differentiering. Ingen immunoreaktivitet kunne påvises ved luminaloverfladen af cysterne i sagen diagnosticeret som apokrin karcinom. De to mikrocystiske adneksale carcinomer analyseret i denne undersøgelse viste stærk CD133-positivitet ved den apikale overflade af celler, der dannede den lille og store lumina i de rørformede strukturer. CD133 immunfarvning kunne demonstreres ved de meget atypiske celler, der omringede de rørformede strukturer i porocarcinoma-sagen (figur 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 5

Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).

3.3. Karakterisering af primære kulturer fra humane hudtumorer og Strømningscytometrianalyse

syv prøver afledt af humane hudtumorer blev behandlet med det formål at opnå enkeltcellesuspensioner. På grund af et utilstrækkeligt antal celler opnået fra tumorerne eller til svampe-eller bakteriekontaminering blev kun fire prøver med succes dyrket og analyseret for celleoverflade CD133/1 epitopekspression. Disse vellykkede dyrkede biopsier inkluderer en eccrine porocarcinom og tre pladecellecarcinomer. Mikroskopisk undersøgelse af de dyrkede celler afslørede forskellige morfologier, der varierede konsekvent til den histologiske tumortype. Celler fra pladecellecarcinom viste epithelioid eller spindelcelleudseende, mens eccrine porocarcinomafledte celler havde mere afrundet form og grupperet sammen i Holme af små og atypiske celler. Tilstedeværelsen af epitelceller i disse kulturer blev bekræftet gennem E-cadherin og EpCam positiv ekspression som epitelmarkører.

for at bestemme, om hudtumorcellekulturer indeholdt en population af CD133-positive celler, brugte vi strømningscytometri til at undersøge ekspressionen af CD133/1 overflademarkør med AC133-antistoffet. Alle prøver fra pladecellecarcinom indeholdt mindre end 0,1% af positive celler, mens næsten 22% af positive celler blev påvist i eccrine porocarcinom. Figur 6 viser repræsentative histogrammer fra de to evaluerede hudtumortyper.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 6

CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. Pladecellecarcinom viser negativ farvning for CD133 og 0% positive CD133-celler på strømningscytometri.

4. Diskussion

fremskridt inden for kutan stamcellebiologi og i forståelse af carcinogenese afhænger meget af tilgængeligheden af markører, der er specifikke for karakteristiske stamcellepopulationer . Kendte markører for hudstamceller eller stamceller, der er identificeret i andre organer eller tumorer, kan anvendes til påvisning af kutane CSC ‘ er. En af disse markører, der kan testes i huden, er CD133-proteinet (prominin-1). Den første data, der rapporterede CD133-ekspression ved anvendelse af det monoklonale antistof AC133, produceret mod et nyt stamcelleglycoproteinantigen, viste, at CD133 selektivt blev udtrykt på CD34 hæmatopoietiske stamme-og stamceller afledt af human føtal lever og knoglemarv såvel som fra blod . Siden da har flere rapporter vist, at prominin-1 kan bruges til at identificere og isolere humane stamceller fra forskellige kilder , herunder det hæmatopoietiske system , prostata , bugspytkirtlen eller nyrerne . Derudover er monoklonale antistoffer mod CD133 blevet anvendt til identifikation og isolering af en formodet population af tumorinitierende celler eller CSC ‘ er i et antal humane carcinomer og i malignt melanom . I gliom er det øgede antal CD133-positive kræftceller såvel som tilstedeværelsen af klynger af disse celler blevet foreslået som en signifikant prognostisk faktor uafhængig af andre faktorer som tumorkvalitet . Imidlertid har andre undersøgelser, der bruger forskellige og nye anti-CD133-kloner, antydet, at ekspressionen af CD133 ikke er begrænset til stamme-og stamceller og synes at være udtrykt i voksne epitelceller i mus og humane væv . For eksempel ved hjælp af en CD133-klon, kaldet 13a4, afledt af museprominin-1, Et Al. demonstreret ekspression af prominin – 1 ved den apikale overflade af neuroepitheliale celler og voksne nyre proksimale tubuli og Karbanov Karr et al. , ved anvendelse af et monoklonalt antistof (80b258) genereret mod et humant prominin-1 polypeptid, observerede immunoreaktivitet i voksne humane væv, især i kirtelepitel. Disse resultater indikerer behovet for yderligere undersøgelser for at afklare, om AC133-antigenet, der tidligere blev fundet i strømningscytometri, er begrænset til de CD34-positive stamceller, udtrykkes i voksne epitelceller . Det er blevet foreslået, at den observerede variable cd133-ekspression er relateret til den differentielle affinitet af de forskellige antistoffer mod forskellige glycosylerede former for CD133 . Det monoklonale antistof AC133 genkender en glycosyleret epitop af prominin-1, og interessant nok kan glycosyleringen af dette protein ændre sig afhængigt af tilstanden af cellulær differentiering, eller det kan ændres under processen med malign transformation . I vores undersøgelse af humane hudtumorer har vi observeret, at cd133-ekspression er meget afhængig af dannelsen af svedkirtelkanaler og svedkirtelsekretion. CD133 immunoreaktivitet blev hovedsageligt set ved den apikale / endoluminale overflade af kanallignende strukturer eller cyster af de fleste godartede og ondartede eccrine tumorer. Ingen af de undersøgte tumorer, hverken godartede eller ondartede, præsenterede isolerede eller små klynger af CD133 positive neoplastiske celler i faste områder. Lignende CD133-farvningsmønster af den apikale cellemembran i sekretoriske celler er tidligere rapporteret i normale rørformede strukturer, såsom nyre proksimale tubuli eller i tumorkirtler af kolorektal cancer . CD133-farvning blev også fundet ved den apikale/endoluminale overflade af celler, der dannede et lumen i ovariecarcinomer . I disse tilfælde er den apikale placering af CD133 blevet impliceret i en mulig sekretorisk funktion af dette molekyle. Den morfologiske fordeling af cd133-farvningen demonstrerer en sammenhæng med velkendte sekretoriske strukturer af normale væv og kirtler, hvilket antyder en funktionel relation af CD133 med sekretion. Faktisk, i vores undersøgelse, tumorer, der mistænkes for at stamme fra svedkirtlernes duktale områder, som syringomer, viste et mindre intenst farvningsmønster end dem, der stammer fra de acinære dele.

CD133-ekspressionen på celleoverfladen af differentierede tumorceller er et argument mod CD133 som en specifik kræftstamcellemarkør i huden. Eksistensen af en lille CD133+ CSC-population kan imidlertid ikke udelukkes fuldstændigt, som det er blevet påvist i andre organer, hvor CD133 udtrykkes på celleoverfladen af begge, CSC ‘ er og differentierede tumorceller .

samlet set viser vores fund en specifik immunhistokemisk ekspression af AC133-antistoffet ved den sekretoriske overflade af differentierede normale og neoplastiske celler i eccrine kirtler. Eksperimenter, der bruger dette antistof som markør for CSC ‘ er i huden, skal fortolkes med forsigtighed. AC133-antistoffet er en følsom og specifik markør for kutan kirteldifferentiering, der er nyttig til diagnose af tumorer med mulig eccrin eller apokrin differentiering.

anerkendelser

forfatterne er taknemmelige over for Pedro Javier Benito Castellanos og Laura Abenda Larso for teknisk support.