resultater

karakterisering af Plasmacytoid dendritiske celler i tyndtarmen.

vi anvendte standardprocedurer for at isolere immunceller placeret i epitelet (intraepitelial, IE) og LP fra tarmen. I begge cellepræparater fandt vi en særskilt population af CD11c+B220+Ly6C+ celler, der tegnede sig for op til 1% af alle celler. I modsætning til pDC var myeloid (m)DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) kun til stede ved meget lave tal i IE-præparatet (Fig. 1 a). Både PDC af LP og IE-præparatet viste lave niveauer af overflade MHC klasse II-ekspression (Fig. 1 a). Yderligere analyse viste, at CD11c + B220 + Ly6C + celler fra begge præparater ensartet udtrykker pDC markørerne PDCA1 såvel som 120g8 (Fig. 1 B). Cytospiner fra sorteret pDC (CD11c+B220+Ly6C+) og myeloid DC (mDC) af IE-præparatet afslørede en rund og glat, plasmacellelignende morfologi af pDC, hvorimod mDC viste de karakteristiske dendritter (Fig. 1 C). For yderligere at karakterisere lokaliseringen af pDC i tarmen anvendte vi anti-B220, anti-120g8 og anti-CD3 mAb i immunhistologi. Mikrografer blev tilfældigt taget fra sektioner og, som afbildet i Fig. 1 D blev placeringen af 120g8+B220+CD3− celler bestemt i forhold til epitelceller ved anvendelse af billedanalyse (analyse; Olympus, Hamborg, Tyskland). Evaluering af positioneringen af kr150 pDC observerede vi, at 4,9% af disse celler var tydeligt placeret i epitelcellelaget, mens yderligere 6,7% var placeret inden for en afstand på 5-10 kr fra epitelcellernes apikale spids (Fig. 1 D). Disse data viser, at en vis mængde af pDC lokaliseres inden for eller tæt på tarmepitelet, mens >80% af de analyserede celler blev placeret i afstande >15 LPM, hvilket gør dem som LP-celler (Fig. 1 D). Fordi lignende antal pDC var til stede i IE-og LP-præparatet efter standardisoleringsprocedurer, det er i øjeblikket uklart, om pDC af LP forurener IE-præparatet, eller om PDC-lokalisering til epitelet er mere effektivt isoleret. Fordi vi næppe finder nogen mDC inden for IE-forberedelsen, favoriserer vi sidstnævnte mulighed. Alligevel er det stadig at afgøre, om begge populationer tjener forskellige funktioner eller tilhører en fælles cellepopulation. Fordi PDC af IE-præparatet i modsætning til pDC af LP-præparatet kan isoleres ved temmelig blide procedurer, blev udelukkende pDC af IE-præparatet anvendt til funktionelle analyser i denne undersøgelse.

CCR9-ekspression på Intestinal pDC.

for at identificere de molekylære mekanismer, der tillader migrering af pDC til tarmen, analyserede vi ekspressionen af homing molekyler. Selvom det er veletableret, at integrin aE (CD103) medierer lymfocytadhæsion til epitelceller i tarmen, kunne vi ikke identificere ekspression af dette integrin på intestinal pDC. Tilsvarende CCR7 (Fig. 1 E), der i det væsentlige er involveret i homing af lymfocytter i perifere lymfoide organer, udtrykkes ikke af tarmens PDC. I modsætning hertil observerede vi høje niveauer af CD18 (kurt2-integrin) og mellemniveauer af kurt4 kurt7, mens Kurt 50% af PDC udtrykker P-selectin ligander (Fig. 1 E). Af interesse udtrykte langt størstedelen af intestinal pDC store mængder af kemokinreceptoren CCR9 (Fig. 1 E), hvorimod mDC af LP udtrykte nej eller lave niveauer af CCR9 .

CCR9 ekspression af pDC isoleret fra forskellige lymfoide organer.

i betragtning af den ensartede ekspression af CCR9 på intestinal pDC analyserede vi ekspression af CCR9 på pDC isoleret fra sekundære lymfoide organer, herunder milt, huddrænende LN, mesenterisk LN og Peyers patches (PP; Fig. 2 A) og anvendte CD4 + CD8 + thymocytter, kendt for at udtrykke høje niveauer af CCR9, som en positiv kontrol (11); Fig. 2 B). Interessant nok udtrykte kun en brøkdel af pDC til stede i nogen af disse organer CCR9 (Fig. 2 a), hvorimod 95% af PDC isoleret fra BM bar denne receptor (Fig. 2 C). De fleste BM pDC udtrykker også CCR5 og CKS3, mens CCR2 kun er til stede på ca.25% af cellerne. CKSCR4, der vides at tilbageholde celler til BM, udtrykkes kun meget svagt (Fig. 2 C). Sammen viser disse data, at pDC er udstyret med forskellige kemokinreceptorer, inden de frigives fra BM. Denne funktion tillader formodentlig homing ikke kun til steder med betændelse, men også til den ikke-betændte tarm.

Kemotaksanalyse af Flt3L-udvidet pDC.

baseret på den stærke ekspression af CCR9 på BM og intestinal PDC sammenlignede vi migrationskapaciteten af pDC og mDC mod kemokinccl25/TECK, som er den eneste kendte ligand for denne receptor (12). Hyppigheden af pDC varierer mellem forskellige musestammer, og det er velkendt, at for eksempel C57BL/6 (B6) mus har meget mindre pDC end 129sv-mus (13). Uanset den genetiske baggrund er antallet af pDC, der kan isoleres fra musevæv, imidlertid utilstrækkeligt til at udføre standard in vitro-kemotaksianalyser. For at overvinde denne begrænsning udvidede vi DC-populationen in vivo ved at implantere en Flt3-L-udskillende tumorcellelinie (B16-FL) i B6-mus i 14 dage (14).

i løbet af denne tidsperiode steg procentdelen af CD11c+ celler til stede i milten fra 3% til 30-35% (data ikke vist). Otteogtreds procent af den in vivo udvidede pDC udtrykte CCR9, med niveauer, der meget ligner dem, der findes på BM pDC (Fig. 2 C og Fig. 4 C) mens in vivo ekspanderet mDC kun udtrykte små mængder af denne receptor(SI Fig. 6B). Milt pDC blev beriget med CD11c + MACS-sortering, hvilket resulterede i 95% renhed for CD11c+ celler, der indeholdt 15% Ly6C+B220+ pDC. In vitro-migrationsanalyser afslørede et stærkt kemotaktisk respons fra pDC til CCL25, såvel som til CKSCL9, en ligand for CKSCR3 og til CKSCL12, som er en ligand for CKSCR4. Kun et svagt respons blev observeret mod CCL19, som tjener som en ligand for CCR7. mDC viste lille kemotaktisk respons mod CCL25 og CKSCL9 og moderat respons mod CKSCL12 og CCL19 (Fig. 3 a).

reduceret antal pDC i tyndtarmen hos CCR9-mangelfulde mus.

baseret på disse observationer karakteriserede vi fordelingen af pDC i CCR9-mangelfulde mus. Vi fandt lignende procentdele af pDC i lunge og lever (SI Fig. 7) såvel som i inguinale og mesenteriske lymfeknuder, mens antallet af milt pDC var lidt forøget i CCR9−/− mus. I modsætning hertil observerede vi et >90% fald i tarm og en 50% reduktion af PP pDC (Fig. 3 B).

PDC migrerer fortrinsvis til tyndtarmen.

baseret på de hidtil beskrevne resultater syntes det sandsynligt, at pDC kræver CCR9 til homing til tyndtarmen. For at bevise denne hypotese overførte vi adoptivt celler fra B6 og CCR9−/− donorer, der bar en Flt3-L-udskillende tumor i 14 dage. Under påvirkning af Flt3L ekspanderede pDC i tilsvarende grad i B6 og CCR9−/− mus (Fig. 4 A og Si Fig. 8) og kunne ikke skelnes med hensyn til ekspressionen af CCR2, CCR5 og CCCR3, mens CCR9 kun blev påvist på pDC afledt af B6, men ikke CCR9-mangelfulde donorer (Fig. 4 C). Uden yderligere oprensning blev splenocytter af disse donorer mærket med henholdsvis 5 (6)-carboksyfluoresceindiacetat n-succinimidylester(CFSE) og 5 (6)-carboksytetramethylrhodamin n-succinimidylester (TAMRA). En blanding af vægt-og CCR9-mangelfulde celler, justeret til at indeholde lige mange pDC, blev i.V. overført i B6-modtagere. Efter 18 timers overførsel analyserede vi først sammensætningen af adoptivt overførte VÆGTCELLER til stede i IE såvel som LP-præparatet og bemærkede, at 54% og 25% af alle celler, der blev genvundet fra henholdsvis IE og LP-fraktionen, var pDC (Fig. 4 B). Disse fund viser, at blandt de forskellige cellepopulationer overførte pDC hjem mest effektivt til tarmen. Disse konkurrencedygtige overførsler afslørede også, at CCR9-mangelfuld pDC stort set er nedsat i deres evne til at komme hjem til tarmen, hvilket afspejles af det lave migrationsforhold mellem CCR9-mangelfuld vs. vægt pDC fundet i IE og LP-præparatet (Fig. 4 D). I modsætning hertil migrerede CCR9-mangelfuld og B6 pDC med lignende effektivitet som perifere og mesenteriske lymfeknuder (Fig. 4 D). Arten af cellemærkning havde ingen indflydelse på disse eksperimenter, fordi udveksling af farvestoffer mellem B6 og CCR9−/− celler gav identiske resultater (data ikke vist). Selv om disse data klart viser, at pDC kræver CCR9 for effektiv homing til tarmen, skal det nævnes, at PDC ‘ s handelsegenskaber fra FLT3-ligandbehandlede mus kan være forskellige fra dem, der er til stede under fysiologiske situationer.

pDC rekrutteres til den betændte tarm.

fordi det er kendt, at pDC spiller en vigtig rolle i antiviral immunitet (4, 10), spekulerede vi i, at pDC kunne rekrutteres til tarmen under inflammatoriske processer for at styrke første linje forsvar. Koleratoksin (CT) er kendt for at inducere tarmbetændelse, når det administreres oralt, og det er rapporteret, at inden for 2 timer efter oral påføring øges antallet af MDC, der transient rekrutteres til tarmen, 4 gange (15). Vi observerede, at ud over mDC steg PDC-antallet også 3 gange, når man fodrede B6-mus med 10-kilog CT (Fig. 4 E). Af interesse resulterede den identiske eksperimentelle opsætning aldrig i nogen stigning i pDC hverken i IE eller LP-præparatet af CCR9-mangelfulde mus efter 1, 2 eller 3 timer CT-behandling (Fig. 4 E og data ikke vist). Det specifikke krav til CCR9 på pDC for deres rekruttering til tarmen under inflammatoriske processer blev bekræftet ved adoptiv overførsel af vægt og CCR9-mangelfuld pDC til ccr9-mangelfulde modtagere efterfulgt af anvendelse af CT som beskrevet ovenfor. Mens adoptivt overført vægt pDC var rigeligt til stede i IE-og LP-præparatet, CCR9-mangelfuld pDC blev næsten fuldstændigt udelukket fra disse rum (Fig. 4 F). Tilsammen viser disse resultater, at pDC under inflammatoriske hændelser kan rekrutteres til tarmslimhinden, og at denne mekanisme i vid udstrækning er afhængig af CCR9.

en rolle for Intestinal pDC til hurtig mobilisering af LP Myeloid DC.

det er for nylig vist, at oral anvendelse af TLR7/8 ligandresikvimod (R848) resulterer i hurtig mobilisering af LP DC, og at TNFa, muligvis frigivet af pDC, er involveret i denne proces (16). Vi spekulerede således i, at intestinal pDC kunne være kilden til TNFa, der potentielt udløser mobilisering af nabo mDC. For at teste denne hypotese stimulerede Vi in vitro B6 pDC af IE og LP-præparatet til 16 h med R848. Faktisk udskilte pDC betydelige mængder TNFa, men producerede ikke nogen påviselige mængder IL-2, IL-4, IL-5 eller IFNy (Fig. 5 a). Vi analyserede derefter mobiliseringen af LP mDC in vivo efter oral anvendelse af R848. Mens ubehandlede B6− og CCR9−/ – mus ikke var forskellige med hensyn til tilstedeværelsen af intestinal MDC (Fig. 5 B), inden for 2 timer oral R848 inducerede mobilisering af kr 60% af mDC i vægt, men kun 10,8% i CCR9−/− mus. Det er vigtigt, at når CCR9-mangelfulde mus i. V. modtog milt pDC af flt3l-behandlede VÆGTDONORER 16 timer tidligere oral anvendelse af R848, kunne denne mangel i intestinal MDC-mobilisering reddes fuldstændigt (Fig. 5 C). Disse eksperimenter viser, at en CCR9-afhængig homing af pDC til tarmen er involveret i hurtig mobilisering af intestinal MDC efter oral påføring af en TLR7/8 ligand. Fordi det er blevet vist af andre i rottemodellen, at anvendelse af LP ‘er også inducerer mobilisering af LP mDC (17), anvendte vi 50 liter LP’ er i.P. til vægt og CCR9-mangelfulde dyr. Af interesse kunne vi under disse eksperimentelle forhold ikke observere nogen forskel mellem vægt og CCR9-mangelfulde dyr med hensyn til mobilisering af LP mDC (SI Fig. 9).