Caspase-aktivering og specifik spaltning af substrater efter Cossackivirus B3-induceret cytopatisk virkning i HeLa-celler

admin

abstrakt

Cossackivirus B3 (CVB3), et enterovirus i familienpicornaviridae, inducerer cytopatiske ændringer i cellekultursystemer og skader direkte flere modtagelige organer og væv in vivo, inklusive myokardiet, tidligt efter infektion. Biokemisk analyse af celledødsvejen i CVB3-inficerede HeLa-celler viste, at 32-kDa-proformen af caspase 3 spaltes efter de degenerative morfologiske ændringer, der ses i inficerede HeLa-celler. Caspase-aktiveringsassays bekræfter, at den spaltede caspase 3 er proteolytisk aktiv. Caspase 3-substraterne poly (ADP-ribose) polymerase, en DNA-reparationsfaktor og DNA-fragmenteringsfaktor, en cytoplasmatisk hæmmer af en endonuklease, der var ansvarlig for DNA-fragmentering, blev nedbrudt ved 9 timer efter infektion, hvilket gav deres karakteristiske spaltningsfragmenter. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at bruge et par timer til at kontrollere, om det er nødvendigt.FMK) inhiberede ikke den virusinducerede cytopatiske virkning, mens hæmning af caspase-aktivering af VVAD.fmk i kontrolapoptotiske celler induceret ved behandling med porfyrinderivatet monoacid ring A og synligt lys hæmmede den apoptotiske fænotype. Caspase-aktivering og spaltning af substrater er muligvis ikke ansvarlig for den karakteristiske cytopatiske virkning produceret af picornavirusinfektion, men kan være relateret til ændringer i sent stadium af cellulære homeostatiske processer og strukturel integritet.B3 (CVB3) er et enterovirus i familien Picornaviridae. Efter binding til koksackievirus og adenovirusreceptor (6, 64) kommer det virale RNA ind i cytoplasmaet, hvor det oversættes til et enkelt polyprotein af værtstranslationsmaskineriet. Polyproteinet behandles derefter proteolytisk af virale proteaser for at producere alle de virale strukturelle og ikke-strukturelle proteiner. Den viruskodede RNA-afhængige RNA-polymerase transkriberer virale RNA ‘ er med negativ streng, der tjener som skabeloner til syntese af flere afkom genomer. Efter viral emballage frigives virussen, potentielt under påvirkning af det viruskodede 2B-protein (67). Under den replikative proces og frigivelse af viral afkom forekommer den cytopatiske virkning (CPE), og værtscellen er skadet med eventuelt tab af levedygtighed.

flere værtscellulære processer ændres under parasitering af picornavirus. Virusprotein 2apro spalter direkte eukaryot initieringsfaktor 4 gamma (eIF4G). Spaltning af denne oversættelsesinitieringsfaktor afskaffer ikke kun cap-afhængig mRNA-oversættelse (19); spaltningsprodukterne antages at stimulere oversættelse af ikke-lukket mRNA, såsom det ikke-cellulære picornavirus-genom (43), som bruger en ny intern ribosomindgangsmekanisme til at begynde proteinoversættelse (31, 76). Poliovirusproteiner 2Apro og 3cpro har vist sig at spalte det TATA-bindende protein, idet 3Cpro også lukker transkription af RNA-polymeraser i, II og III (11, 72, 74). Transkriptionsfaktorerne TFIIIC (10), CREB (73) og Oct-1 (75) spaltes også af 3cpro under picornavirusinfektion. CVB3-protein 2b har vist sig at modificere endoplasmatisk retikulum og plasmamembranpermeabilitet (14), hvilket forårsager en stigning i den cytosoliske frie calciumkoncentration (28, 67) og membranlæsioner, som kan lette frigivelse af viral afkom. Ioniske gradienter kollapser (40, 52), og phospholipaseaktiviteten ændres (24, 29). Cvb3-infektion af HeLa-celler resulterer i tyrosinphosphorylering af to cellulære proteiner ved 4 timer efter infektion, og inhibering af disse phosphoryleringer reducerer signifikant viral afkomsproduktion (27). Det er klart, at infektion er en dynamisk cellulær proces, hvor rettidige interaktioner mellem virale og værtsproteiner bestemmer resultatet for både virus og værtsceller.det er nu klart, at cysteinproteaser i caspase-familien er nøgleeffektormolekyler i apoptotisk celledød. Når den er aktiveret, spalter caspaser specifikke substrater, herunder Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (35), DNA-fragmenteringsfaktor (DFF) (37), gelsolin (34), lamin a (58), sterolregulerende elementbindende proteiner (68), Kurt-fodrin (12, 66), fokal adhæsionskinase (71) og mdm2 (18), blandt mange andre. Sådanne spaltningshændelser resulterer i vigtige ændringer i normale homeostatiske cellulære processer og tilsvarende cellemorfologiske-strukturelle ændringer.

mange vira har biokemiske mekanismer til at unddrage sig og/eller inducere apoptose i celler, hvor de bor (for anmeldelser, se referencer49 og 60). Forskellige vira interagerer på forskellige stadier af den apoptotiske dødsvej. Vira har udviklet strategier rettet mod Fas ligand-Fas eller tumornekrosefaktor alfa (TNF-Kurt)–TNF-receptorsignaleringskompleks, Bcl-2-familien af regulatorer eller caspase-familien af bødler (49, 60). Dødsmekanismerne for cvb3-inficerede celler skal fortsat bestemmes; der er imidlertid begrænset morfologisk bevis for induktion af apoptose i picornavirus-inficerede celler. Bevis opnået med Theiler ‘ s murine encephalitis virus (32, 65) og poliovirus (63) har indikeret, at picornavirus-inficerede celler gennemgår apoptose, baseret på morfologiske kriterier, herunder nuklear kondensation og DNA-fragmentering.

for at bestemme, om caspaser er aktiveret og ansvarlige for CPE observeret efter cvb3-infektion, HeLa-celler (American Type Culture Collection, Rockville, MD. 5 med CVB3 (generøst leveret af Charles Gauntt, University of Health Sciences Center, San Antonio) eller sham behandlet med minimum essential medium (MEM) mangler føtal bovint serum (FBS) i 45 minutter. Celler blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), og komplet MEM indeholdende 10% FBS blev derefter substitueret. En positiv apoptosekontrol bestod af HeLa-celler behandlet med fotosensibilisatoren monoacidring a (BPD-MA) i 1 time og derefter udsat for synligt lys som tidligere beskrevet (22, 23). Kulturer blev undersøgt og høstet på 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 timer efter infektion. Celler blev vasket to gange i koldt PBS og lyseret i 1 ml lysisbuffer (20 mM Tris , 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 0,15 e aprotinin pr.ml) pr. 75 cm2 dyrkningsområde. Efter en 20 minutters inkubation på IS blev supernatanter opsamlet efter centrifugering ved 10.000 liter g og opbevaret ved -20 liter C til yderligere biokemiske analyser.

det tidsmæssige mønster for produktion af cvb3 virale proteiner, afkom virus og udviklingen af hela celle degenerative morfologiske ændringer blev overvejet i forbindelse med en undersøgelse af værtscelledødsproteiner. Cellelysatprøver blev adskilt af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese. Proteiner blev overført til nitrocellulose (Hybond ECL nitrocellulose membraner; Amersham). Membranerne blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i blokerende buffer (PBS med 0,1% mellem 20 og 5% pulveriseret fedtfri mælk). Efter to vask i vaskebuffer (PBS med 0.1% mellem 20) blev membranerne inkuberet med antistof mod CVB3 (kanin polyklonal anti-CVB3, 1:1.000; nøjagtige kemikalier). Membranerne blev vasket tre gange i vaskebuffer og inkuberet med et æsel anti-kanin immunoglobulin sekundært antistof (Amersham). Det kan også være, at det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt, og om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt at tage hensyn til, om det er nødvendigt. Signifikante stigninger i viral proteinsyntese kunne påvises mellem 3 og 5 timer efter infektion (Fig.1B). De virale proteaser spalter virale såvel som værtsproteiner tidligt efter infektion. Ved immunoblotanalyse med monoklonal anti-eif4g i mus (1:1.000; Transduktionslaboratorier) blev det fundet, at eIF4G spaltes ved viral protease 2A, der begynder inden for 1 time postinfektion, med yderligere tab af påvisning af 220-kDa-proteinet ved 5 timer postinfektion (Fig. 1C). Mængden af CVB3 i cellesupernatanten (frigivet virus) blev bestemt på monolag af HeLa-celler ved hjælp af agar-overlay-plakassaymetoden som tidligere beskrevet (3). Kort fortalt blev prøvesupernatanten serielt fortyndet 10 gange, fortyndingerne blev overlejret på 90 til 95% sammenflydende monolag af HeLa-celler i seks-brøndsplader (Costar), og de overlejrede celler blev inkuberet i 1 time (5% CO2, 37 liter C). Medium indeholdende nonbound virus blev fjernet, og varm komplet MEM indeholdende 0,75% agar blev overlejret i hver brønd. Pladerne blev inkuberet 36 Til 48 timer (5% CO2, 37 liter C), fikseret med Carnoy ‘ s fikseringsmiddel (95% ethanol–eddikesyre) og farvet med 1% krystalviolet. Afkom virus var til stede i supernatanten ved basale niveauer mellem 1 og 5 timer. ved 6 timer efter infektion var der en påviselig stigning i supernatantvirusniveauer, og eksponentiel virusproduktion begyndte ved 9 timer efter infektion som bestemt ved plakassays (Fig. 1A). HeLa-celler udviste markante ændringer i morfologi, inklusive cellulær kondensation, afrunding og frigivelse fra kulturmonolaget, mellem 6 og 7 timer efter infektion, som bemærket ved kontrastmikroskopi (Fig. 1D).

iv=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1.

frigivelse af afkom CVB3-virus, værtscelleproduktion af cvb3 viralt protein, viral proteasespaltning af vært eIF4G og cellemorfologi ændringer efter infektion med CVB3. (A) kulturmedium blev opsamlet og analyseret for infektiøs virus ved hjælp af agar-overlejringsplakassemetoden. Der var en stigning i mængden af infektiøs virus (i PFU pr. Cellulært lysat blev opsamlet fra CVB3-inficerede HeLa-celler, og immunoblotanalyse med et cvb3 polyklonalt antistof, der genkender større virale proteiner, blev udført. (C) cytosolisk ekstrakt blev derefter analyseret for tilstedeværelsen af 220-kDa eIF4G-komponenten i translationsinitieringskomplekset. (D) kontrastmikroskopi af HeLa-celler ved 1, 6, 7 og 12 timer efter infektion blev udført. Bemærk de omfattende cytopatiske ændringer, der opstod mellem 6 og 7 timer efter infektion.

for at bestemme, om værtscelledødsmaskineriet er aktiveret efter cvb3-infektion, blev immunoblotanalyse af lysat opsamlet på bestemte tidspunkter udført. Caspase 3, som er til stede i celler som et precursorprotein med en molekylvægt på 32 kDa, er et primært molekyle involveret i udførelsen af celledød. Ved anvendelse af monoklonale anti-caspase 3 (1: 1.000; Transduktionslaboratorier) blev det bestemt, at uinficerede celler indeholdt 32-kDa precursorproteinet. Efter cvb3-infektion begyndte niveauet af 32-kDa-precursorproteinet at falde mellem 7 og 8 h postinfektion, og det var næsten fuldstændigt ikke detekterbart ved 12 h postinfektion (Fig.2). For at bestemme, om den udtømte pro-caspase 3 var blevet behandlet proteolytisk fra et enkeltkædetsymogen til dets aktive to-kædede, blev HeLa-cellelysater inkuberet med caspase 3 fluorescerende substrater som tidligere beskrevet (23). Kort fortalt blev cellelysater inkuberet med reaktionsbuffer (20 mM Tris , 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% glycerol) indeholdende 100 liter caspase 3 substrat acetyl-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-methylcoumarin (Ac-DEVD-AMC) (Calbiochem, Cambridge, Mass.) eller A-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-trifluormethylcoumarin (a-DEVD-AFC) (produkter fra Livermore, Calif.). Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 liter C i 2 timer, og fluorescensekspression af AMC eller AFC ved henholdsvis 380 eller 400 nm blev målt ved henholdsvis 460 eller 505 nm med et CytoFluor 2350 cytofluorometer (Perseptive Biosystems, Burlington, Ontario, Canada). Ved anvendelse af denne fremgangsmåde var caspase 3-aktivitet tydelig ved 5 timers postinfektion. Stigningen i caspase 3-aktivitet fra 7 til 10 h postinfektion, når det maksimale aktiveringsniveau blev nået, blev opretholdt til 12 h postinfektion (Fig. 2). Denne proteaseassay viste, at caspase 3 var i en aktiv form i inficerede celler, og at den var i stand til proteolytisk behandling af andre caspaser og substrater.

Fig. 2.

caspase 3-Aktivering og spaltning af 32-kDa-proformen efter cvb3-infektion i HeLa-celler. (A) ti mikrogram cellelysat blev inkuberet i 150 liter reaktionsbuffer indeholdende det caspase 3-specifikke substrat Ac-DEVD-AMC. Efter inkubation ved 37 liter C i 1 time blev fluorescensniveauer bestemt med en eksitationsbølgelængde på 380 nm og en emissionsbølgelængde på 460 nm. Bemærk stigningen i fluorescens, der repræsenterer caspaseaktivitet, begyndende efter 7 timer efter infektion og stigende til maksimale niveauer med 10 timer efter infektion. (B) HeLa-cellelysater blev adskilt af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og overført til nitrocellulose. Immunoblotting for tilstedeværelsen af 32-kDa proformen af caspase 3 viser, at dette protein behandles mellem 7 og 12 timer efter infektion.

Caspase 3 spalter specifikke substrater ved asparaginsyrerester (42). PARP, et nukleart protein involveret i DNA-reparation (13, 69), har vist sig at være et substrat for aktiveret caspase 3 såvel som andre caspaser (35). I apoptotiske celler spaltes PARP fra et 116-kDa-protein, hvilket giver fragmenter på 85 og 25 kDa, bestemt med antistoffer for henholdsvis amino-og carboksyl-termini af proteinet. I cvb3-inficerede HeLa-celler kunne PARP-nedbrydning med udseendet af et 85-kDa-fragment påvises ved 9 h postinfektion med yderligere reduktion af niveauerne af 116-kDa-peptidet med 10 og 12 h postinfektion, som bestemt ved immunoblotanalyse med monoklonal anti-PARP (1:2.000; Biomol) (Fig. 3).

Fig. 3.

specifik spaltning af PARP-og DFF-substrater med caspase 3 efter cvb3-infektion. (A) cellulært lysat blev opsamlet fra CVB3-inficerede HeLa-celler, og immunoblotanalyse blev udført med et anti-PARP-antistof, der genkender et 85-kDa-spaltningsfragment. Bemærk, at spaltning af PARP begyndte ved 9 timer efter infektion, med et markant tab af det 116-kDa native protein, der forekom ved 10 timer efter infektion. (B) cellulært lysat blev ligeledes analyseret for dff-spaltning ved immunoblotting efter cvb3-infektion. Bemærk ændringen i dff-status, der begynder ved 9 timer efter infektion, med udseendet af et 30-kDa-fragment.

DFF er et cytosolisk protein, som kan spaltes af caspase 3 (37). Når det er spaltet, frigiver dette protein en endonuklease, der migrerer til kernen, hvor det kan spalte DNA på internukleosomale steder, hvilket resulterer i DNA-fragmentering (16). Det er tidligere blevet påvist, at internukleosomal DNA-nedbrydning er et cellulært træk ved picornavirusinfektion (32). Dff spaltes fra et 45-kDa-protein, der producerer et 30-kDa-fragment, der begynder ved 9 timer efter infektion, med fortsat behandling og tab af 45-kDa-proteinet mellem 10 og 12 timer efter infektion (Fig. 3).for at bestemme, om caspaser direkte producerer den karakteristiske CPE, der forekommer efter picornavirusinfektion eller aktiveres efter de morfologiske ændringer, blev celler behandlet med den generelle caspasehæmmer.fmk). En stamopløsning (100 mM i dimethylsulfoksid).fmk (Bachem) blev fortyndet i komplet MEM til koncentrationer i området fra 0 til 200 liter, og fortyndingerne blev inkuberet med celler i 30 minutter før infektion eller lysbehandling. Efter cvb3-infektion blev cellerne vasket med PBS og komplet MEM indeholdende 10% FBS og frisk vad.fmk (0 til 200 liter) blev derefter erstattet. Dette peptid har vist sig at hæmme induktionen af morfologiske ændringer ved multiple apoptotiske stimuli (46, 54). Svad.fmk i koncentrationer på 50, 100 og 200 liter blokerede både caspaseaktivitet og spaltning af PARP og DFF i BPD-MA – og lysbehandlede HeLa-celler (positiv kontrol for apoptose) (Fig. 4). I cvb3-inficerede HeLa-celler blev spaltningen af PARP og DFF delvist forhindret af inhibitoren i koncentrationer på 50 og 100 liter (Fig. 4). Ved den højeste koncentration af inhibitoren (200 liter) var der ingen tegn på PARP-eller dff-spaltningsfragmenter i cvb3-behandlede celler ved 10 timer efter infektion. Caspase spaltning af strukturelle proteiner såsom actin, gelsolin, lamin B og fokal adhæsion kinase er ansvarlig for de morfologiske ændringer observeret efter induktion af apoptose (42, 45). Ved 2 timer efter fotoaktivering af BPD-MA blev HeLa-celler kondenseret, havde omfattende membranblebbing og frigjort fra monolaget (Fig.5). Ved stigende koncentrationer af VVAD.FMK, denne apoptotiske fænotype var ikke synlig, idet cellerne opretholdt en morfologi svarende til kontrolcellerne (Fig. 5). CVB3-inficerede HeLa-celler blev kondenseret og frigjort fra monolaget, men udviste ingen membranblebbing ved 10 timer efter infektion (Fig. 5). Blokade af caspaseaktivitet af VVAD.fmk i koncentrationer op til 200 liter ændrede ikke den cytopatiske fænotype, selvom spaltning af substrater (DFF og PARP) blev hæmmet.

Fig. 4. efter cvb3-infektion eller induktion af apoptose ved behandling af HeLa-celler med BPD-MA og lys. (A) Cellelysat blev inkuberet i reaktionsbuffer indeholdende det caspase 3-specifikke substrat Ac-DEVD-AFC. Efter inkubation ved 37 liter C i 1 time blev fluorescensniveauer bestemt med en eksitationsbølgelængde på 400 nm og en emissionsbølgelængde på 505 nm. Bemærk manglen på caspaseaktivering i HeLa-celler (50 til 200 liter) behandlet ved 10 timer efter cvb3-infektion og ved 2 timer efter behandling med BPD-MA og lys. (B) cellulært lysat blev opsamlet fra behandlede HeLa-celler, og immunoblotanalyse blev udført med et anti-PARP-antistof. Bemærk den tilsvarende spaltning af PARP i de cvb3-inficerede HeLa-celler uden CVAD.fmk og BPD – MA-og lysbehandlede HeLa-celler uden vad.fmk. Svad.fmk-behandling (50 til 200 liter) af HeLa-celler forhindrede PARP – behandling i BPD-MA-og lysbehandlede HeLa-celler, mens PARP-behandlingen i Cvb3-behandlede HeLa-celler var begrænset, men ikke fuldstændigt hæmmet, ved behandling med CVAD.fmk ved 50 eller 100 liter. (C) Immunoblotanalyse af DFF-spaltning ved 10 timer efter cvb3-infektion og ved 2 timer efter behandling med BPD-MA og lys viste, at spaltningsmønsteret svarede til PARP. Sham-inficerede kulturer blev behandlet på samme måde som inficerede kulturer uden virus.

Fig. 5.

effekter af VVAD.fmk-behandling på cellemorfologiske ændringer efter cvb3-infektion eller BPD-MA og let behandling af HeLa-celler. HeLa-celler blev behandlet med VVAD.fmk ved 0 til 200 liter og derefter inficeret med CVB3 eller behandlet med BPD-MA og lys. Ved 10 timer efter infektion blev caspaser behandlet, og substrater blev spaltet i virusinficerede celler, og ved 2 timer efter lysbehandling blev caspaser behandlet, og substrater blev spaltet i BPD-MA-behandlede celler. Bemærk forskellen i de morfologiske udseende af de CVB3-inficerede og fotodynamisk behandlede HeLa-celler. Cvb3-inficerede HeLa-celler optrådte afrundede med glatte celleoverflader, mens HeLa-cellerne behandlet med BPD-MA og lys udviste omfattende membranblebbing og krympning med cellulær heterogenitet. De morfologiske ændringer produceret af BPD-MA og lysbehandling blev hæmmet, og cellens udseende svarede til kontrolhelacellerne (BPD-MA behandlet plus intet lys). I Cvb3-inficerede HeLa-celler blev de morfologiske ændringer ikke hæmmet med stigende koncentrationer af VVAD.FMK, hvilket antyder, at de morfologiske ændringer var uafhængige af caspase-behandling og spaltning af substrater.

et klassisk træk ved vira af familien Picornaviridae er den cellulære CPE efter infektion. Siden opdagelsen af en ekstraneural cellekulturteknik til multiplikation af poliovirus (17) er degenerative ændringer i cellemorfologi blevet noteret. Først beskrevet af Robbins et al. (48) i 1950 inkluderer disse cytopatiske ændringer nuklear krympning, kondensering af kromatin, celleafrunding og frigivelse fra monolaget med eventuel progression til acidofil cytoplasma, nuklear pyknoseog fragmentering af det nukleare kromatin (karyorrheksis) (47).

den nylige forståelse af celledødsmekanismer sætter scenen for undersøgelse af værtscelledødsproteiner og deres mulige rolle i CPE for cvb3-infektion. Mange vira hæmmer eller aktiverer celledød, strategier, der formidler karakteristiske aspekter af celleskade, inflammatoriske reaktioner eller viral persistens. Som nævnt ovenfor har tidligere picornavirus-undersøgelser afsløret de morfologiske træk ved apoptotisk celledød, herunder cellekrympning, DNA-fragmentering og nuklear kondensation (21, 32, 47).

Caspase 3, en cysteinprotease med homologi tilcaenorhabditis elegans protein Ced-3 (77), betragtes som et af de vigtigste proteiner involveret i udførelsesfasen af celledød. Apoptose induceret af flere stimuli, herunder Fas, TNF, etoposid, staurosporin, fotodynamisk terapi, ioniserende stråling og tilbagetrækning af vækstfaktor involverer Pro-caspase 3-behandling og efterfølgende aktivering (15, 23, 30, 33, 51). Begyndende ved 7 til 8 timer efter infektion med CVB3 er pro-caspase 3 udtømt, og caspase-aktiveringsanalyser har vist, at dette protein spaltes i dets aktive form. Flere proteiner kan aktivere caspase 3, herunder caspase 8 (via signalering via TNF-eller Fas-receptorer) (55), gransym B fra cytotoksiske lymfocytter (62) og caspase 9 (via frigivelse af mitokondrie-cytokrom c og samling af apoptotiske proteaseaktiveringsfaktorer) (36). Når den er aktiveret, kan caspase 3 nedbryde specifikke substrater, hvilket igen resulterer i strukturelle ændringer og tab af homeostatisk regulering af cellulære processer. Talrige proteiner har vist sig at blive spaltet af aktiverede caspaser. I overensstemmelse med aktiveringen af caspase 3 spaltes både PARP og DFF efter cvb3-infektion. Caspase-aktivering og DNA-fragmentering er direkte forbundet gennem spaltning af DFF (37). DFF er en human cytosolisk faktor bestående af to underenheder på 45 og 40 kDa, hvoraf den største nedbrydes til mindre polypeptider af caspase 3. I nylige undersøgelser af enari et al. (16) ved anvendelse af murine lymfomceller blev en endonuklease, caspase-aktiveret DNase (CAD) isoleret. Den murine ækvivalent af DFF-protein blev isoleret og betegnet hæmmer af CAD (50). Caspase 3 spaltning af hæmmer af CAD (DFF) tillader CAD-nuklear translokation og DNA-nedbrydning. DFF spaltes begyndende ved 9 timer efter infektion, hvilket resulterer i et 30-kDa fragment (Fig. 3) som kan viderebehandles til et 11-kDa fragment (37). PARP er placeret i kernen og er involveret i DNA-reparation. Spaltning af PARP begynder ved 9 timer efter infektion, hvilket antyder, at når caspaser først er aktiveret i cytosolen, er de i stand til at få adgang til kernelokaliserede substrater.

Bemærk, caspasehæmning med den generelle caspasehæmmer.fmk forhindrede ikke CPE induceret af CVB3 efter infektion. Ved mellem 6 og 7 timer efter infektion blev CPE tydelig ved kontrastmikroskopi i vores cvb3-infektionsmodel. Tiden mellem infektion og udseende af CPE, som observeret ved kontrastmikroskopi, var konsistent.FMK koncentrationer på fra 50 til 200 liter. Ud over at ikke påvirke tiden til CPE, er det nødvendigt.fmk-behandling resulterede i celler med et morfologisk udseende svarende til ubehandlet, inficerede celler (Fig. 5). Vi brugte behandling med BPD-MA og light som en alternativ metode til at inducere apoptose i HeLa-celler (22, 23). Hæmning af caspaseaktivering med inhibitoren vad.fmk forhindrede den apoptotiske fænotype (Fig. 5). Ud fra disse resultater konkluderer vi, at caspaseaktivitet og spaltning af substrater ikke tager højde for den karakteristiske CPE forbundet med picornavirusinfektion, men i stedet aktiveres efter de morfologiske ændringer.

skæringspunktet for den virale replikative cyklus og aktivering af værtscelledødsvejen skal stadig bestemmes. Picornavirus-infektion resulterer snart i hæmning af cellulært RNA og proteinsyntese (19, 74). Tidlige undersøgelser af forholdet mellem picornavirus-inducerede metaboliske ændringer og virusinduceret CPE indikerede, at inhiberingen af protein-og RNA-syntese ikke var direkte relateret til cellemorfologiske ændringer (4). Protein-og RNA-syntesehæmmere forsinkede celledød, men cellerne viste færre morfologiske ændringer end picornavirus-inficerede celler (5). Inhibering af protein-og RNA-syntese med et hvilket som helst af flere midler, såsom actinomycin D, puromycin og difteritoksin, resulterer i apoptose (39). Tidlige undersøgelser udført i poliovirusinfektionssystemer viste, at puromycin, en hæmmer af translationen af virale såvel som værtsproteiner, forsinker begyndelsen af cytopatiske ændringer, hvilket antyder, at visse virale proteiner kan være direkte cytotoksiske (4). Forøgelse af MOI fører til en hurtigere indtræden af CPE (upublicerede observationer), selvom næsten al værtsproteinoversættelse lukkes inden for 3 timer ved en relativt lav MOI (25) som den, der blev brugt i denne undersøgelse (MOI = 5). For nylig er det blevet vist, at 2B-proteinet kodet af coksackivirus og poliovirus associerer med cellulære membranfraktioner, herunder plasmalemma og endoplasmatisk retikulum, og forstyrrer ionbevægelsen, herunder bevægelsen af Ca2+ til cytosolen (1, 67). Ca2 + tilstrømning forekommer i apoptose (7, 44), men det er ikke klart, om tilstrømningen sker før eller efter caspase-aktivering. Ved undersøgelse af de ioniske krav til caspaser er det blevet bestemt, at calciumionkoncentrationen har ringe effekt på caspaseaktivitet (56). 2B-proteinets indflydelse på membranpermeabilitet, og den store sene calciumtilstrømning bemærkede (>6 h postinfektion) (67) kunne være en nedstrøms effekt af caspase-aktivering.

i de tidlige faser af infektion ville det være fordelagtigt for virussen at hæmme værtscelledød og derved muliggøre maksimal produktion af viral afkom. I sene stadier af den virale livscyklus ville det også være gavnligt for virussen at inducere apoptose snarere end nekrose. En sådan dødsmekanisme er et potentielt middel til værtsimmunsystemunddragelse af virussen under dens frigivelse til det omgivende væv. Apoptose er karakteriseret ved den hurtige fagocytose af berørte celler uden frigivelse af proinflammatoriske cytokiner (53).

vira har vist sig at interagere på forskellige niveauer af den apoptotiske vej. Flere gammaherpesvirus (inklusive Kaposis sarkomassocieret humant herpesvirus 8) såvel som den tumorigeniske molluscum contagiosumvirus indeholder FLICE-hæmmende proteiner, der interagerer med Fas-adapterproteinet FADD og konkurrerer om at hæmme rekruttering af caspase 8 og efterfølgende aktivering (61). Ekspression af koppevirus serpin CrmA blokerer caspase 8-medieret aktivering af nedstrøms caspaser, såsom caspase 1 og caspase 3 (55). IAP (for inhibitorer af apoptose) proteiner udgør en familie af proteiner, udtrykt af baculovirus, der blokerer apoptose induceret af virusinfektion eller ved caspase 1 (78). Desuden er flere virale homologer af Bcl-2-familien af proteiner blevet opdaget (2, 8, 20, 70). Adenovirus (9, 20, 57), afrikansk svinepestvirus (41) og Epstein-Barr-virus (26, 41, 59) koder for proteiner (henholdsvis E1B-19k, LMV-HL og BHRF1), der udviser sekvenshomologi til Pro-overlevelsesgener fra Bcl-2-familien.

identifikationen af virale proteiner, der direkte inducerer apoptose, er ikke så omfattende dokumenteret som for virale proteiner, der hæmmer celledød. Lentiviruserne human immunodeficiency virus og human T-celle leukæmi virus type 1 koder transkriptionsregulatorerne Tat og skat, som har vist sig at øge ekspressionen af Fas ligand, samtidig med at ekspressionen af Bcl-2 familiemedlemmer (79, 80) reduceres. De humane adenovirus-kodede E1A -, E3-og E4-genprodukter forårsager celledød efter ekspression i cellekultur. De adenovirus-dødsfremkaldende gener udtrykkes sent i infektionscyklussen og overvælder i sidste ende de viruskodede dødshæmmende gener (38).

vores data viser, at caspase 3-Aktivering følger, snarere end forud for, cvb3-inducerede degenerative morfologiske ændringer i inficerede HeLa-celler. Aktiverede caspaser behandler specifikke substrater, herunder PARP og DFF. Inhibering af caspaseaktivitet eliminerer imidlertid ikke det morfologiske udseende (CPE) af virusinficerede celler som bestemt ved kontrastmikroskopi. Caspase-behandling og spaltning af substrater kan være vigtig i den ultimative ændring af normale homeostatiske processer i inficerede celler og kan lette den endelige clearance af virusinficerede celler. De virale proteaser 2A, 3C og 3CD kan spalte specifikke strukturelle proteiner, hvilket resulterer i morfologiske ændringer i overensstemmelse med CPE på en måde, der er analog med virkningen af caspaser, som spalter separate substrater for at opnå en tydelig apoptotisk fænotype.

anerkendelser

Vi sætter stor pris på den tekniske support fra Lubos Bohunek. Vi takker dff antistof for den generøse gave af DFF antistof.

disse undersøgelser er blevet støttet af Heart and Stroke Foundation of British Columbia og Yukon (B. M. M., C. M. C., D. J. G. og K. A.), Medical Research Council of Canada (D. Y. og B. M. M.) og B. C. Health Research Foundation (D. Y.)

fodnoter

      “> modtaget 9.januar 1998.i:HVP=”http://schema.highwire.org/Journal accepteret 21.maj 1998.
  • Copyright 1998 American Society for Microbiology
  1. 1.Aldabe R., Carrasco L.

Poliovirus protein 2BC øger cytosoliske frie calciumkoncentrationer.J. Ferrule.71199762146217

  • 2.Ambrosini G., Adidas C., Altieri D. C.

    • det nye anti-apoptosegen, survivin, udtrykt i kræft og lymfom.Nat. Middelhavs.31997917921

  • 3.L. A. Andersen D. R. Carthy C. M.,
  • Yang D.,
  • Kandolf R.,
  • McManus B. M.

    • direkte interaktioner af coksackivirus B3 med immunceller i miltrummet hos mus, der er modtagelige eller resistente over for myocarditis.J. Virol.70199646324645

  • 4.pri
    1. Bablanian R.,
    2. Eggers H.,
    3. Tamm I.

    undersøgelser af mekanismen for poliovirus-induceret celleskade. I. forholdet mellem poliovirus-induceret metabolisk og morfologiske ændringer i dyrkede celler.Virologi261965100113

  • 5.pri
    1. Bablanian R.,
    2. Eggers H. J.,
    3. Tamm I.

    undersøgelser af mekanismen for poliovirus-induceret celleskade. II. forholdet mellem poliovirusvækst og virusinducerede morfologiske ændringer i celler.Virologi261965114121

  • 6.krit-Jones E. A.,
  • Hong J. S.,
  • Cunningham J. A.,
  • Droguett G.,
  • Kurt-Jones E. A.,
  • Krithivas A.,
  • Hong J. S.,

    • finberg R. V. isolering af en fælles receptor for coksackie B-virus og adenovirus 2 og 5.Science275199713201323

  • 7.Hughes F. M. Jr.,
  • Huang Y.,
  • Huang Y.,
  • Cidlovski J. A.,
  • Putney J. U. Jr.

    • roller af cytoplasmatisk Ca2+ og intracellulær Ca2 + butikker i induktion og undertrykkelse af apoptose i S49 cells.Am. J. Physiol.2721997C1241C1249

  • 8.Cheng E. H.,
  • Nicholas J.,
  • bælge D. S.,
  • H. S.,
  • Guo H. G. en Bcl – 2 homolog kodet af Kaposi sarkom-associeret virus, humant herpesvirus 8, hæmmer apoptose, men ikke heterodimeriserer med Baks eller Bak.Proc. Natl. Acad. Sci. USA941997690694
  • 9.Chiou S.-K.,
  • Tseng C.-C.,
  • Rao L.,
  • hvid E.

    • funktionel komplementering af adenovirus E1B 19-kilodaltonproteinet med Bcl-2 i inhiberingen af apoptose i inficerede celler.J. Virol.68199465536566

  • 10.Larsen
    1. Clark M. E.,
    2. Hammerle T.,
    3. Vimmer E.,
    4. Dasgupta A.

    Poliovirusproteinase 3c konverterer en aktiv form for transkriptionsfaktor IIIC til en inaktiv form: en mekanisme til inhibering af værtscellepolymerase III-transkription af poliovirus.EMBO J. 10199129412947

  • 11.Clark M. E.,
  • Lieberman P. M.,
  • Berk A. J.,
  • Dasgupta A.

    • direkte spaltning af humant TATA-bindende protein ved poliovirus protease 3C in vivo og in vitro.Mol. Celle. Biol.13199312321237

  • 12.Cryns V. L.,
  • Bergeron L.,
  • Hu H.,
  • Li H.,
  • Yuan J.

    • specifik spaltning af Kurt-fodrin under Fas – og tumornekrosefaktorinduceret apoptose medieres af en interleukin-1 Kurt-konverterende ensym/Ced-3 protease, der adskiller sig fra poly(ADP-ribose) polymeraseprotease.J. Biol. Chem.27119963127731282

  • 13.de Murcia J. M.,
  • Niedergang C.,
  • Trucco C.,
  • Ricoul M.,
  • Dutrillauks B.,
  • Mark M.,
  • Oliver F. J.,
  • Masson M.,
  • Dierich A.,
  • LeMeur M.,
  • Chambon P.,
  • De Murcia G.

    • krav til poly(ADP-ribose) polymerase ved genopretning fra DNA-beskadigelse hos mus og i celler.Proc. Natl. Acad. Sci. USA94199773037307

  • 14.
    1. Doedens J. R.,
    2. Kirkegaard K.

    inhibering af cellulær proteinsekretion af poliovirusproteiner 2b og 3A.EMBO J. 141994894907

  • 15.enari M.,
  • Hug H.,
  • Nagata S.

    • inddragelse af en ISLIGNENDE protease i Fas-medieret apoptose.Nature37519957881

  • 16.enari M.,
  • Sakahira H.,
  • Yokoyama H.,
  • Oka K.,
  • Ivamatsu A.,
  • Nagata S.

    • en caspase-aktiveret DNase, der nedbryder DNA under apoptose og dets hæmmer ICAD.Nature39119984350

  • 17.Larsen
    1. Enders J. F.,
    2. Veller T. H.,
    3. Robbins R. C.

    dyrkning af Lansing-stammen af poliomyelitisvirus i kulturer af forskellige humane embryonale væv.Videnskab10919498587

  • 18.Erhardt P.,
  • Tomaselli K. J.,
  • Cooper G. M.

    • identifikation af mdm2-oncoproteinet som substrat for cpp32-lignende apoptotiske proteaser.J. Biol. Chem.27219971504915052

  • 19.Etchison D.,
  • Milburn S. C.,
  • Edery I.,
  • Sonenberg N.,
  • Hershey J. V.

    • hæmning af HeLa-celleproteinsyntese efter poliovirusinfektion korrelerer med proteolysen af et 220.000-Dalton-polypeptid associeret med eukaryot initieringsfaktor 3 og et cap-bindende proteinkompleks.J. Biol. Chem.25719821480614810

  • 20.li>
  • Martinou I.,
  • Raven T.,
  • pun K. T.,
  • Grinham C. J.,
  • Martinou J. C.,
  • brun R.

    • kloning af en bcl-2 homolog ved interaktion med adenovirus E1B 19k.Nature3741995731733

  • 21.Godman G. C.

    • cytopatologien af enteroviral infektioninternational gennemgang af eksperimentel patologirichter G. V., Epstein M. A. 5196667110akademisk Presseny York, N. Y

  • 22.J. J., M. T., M. T., Levy J. G., McManus B. M.,
  • Hunt D. V.

    • overekspression af Bcl(L) forhindrer caspase-3-medieret aktivering af DNA-fragmenteringsfaktor (DFF) produceret ved behandling med det fotokemoterapeutiske middel BPD-MA.FEBS Lett.4221998151154

  • 23.lyri
    1. Granville D. J.,
    2. Levy J. G.,
    3. Hunt D. H.

    fotodynamisk terapi inducerer caspase-3-aktivering i HL-60-celler.Celledød Er Forskellig.41997623629

  • 24.Larsen
    1. Guinea R.,
    2. Lopes-Rivas A.,
    3. Carrasco L.

    modifikation af phospholipase C og phospholipase A2 aktiviteter under poliovirusinfektion.J. Biol. Chem.26419892192321927

  • 25.helentjaris T.,
  • Ehrenfeld E.

    • inhibering af værtscelleproteinsyntese ved UV-inaktiveret poliovirus.J. Virol.211977259267

  • 26.Henri
    1. Henderson S.,
    2. Huen D.,
    3. Rovi M.,
    4. Dayson C.,
    5. Johnson G.,
    6. Rickinson A.Epstein-Barr-viruskodet BHRF1-protein, en viral homolog af Bcl-2, beskytter humane B-celler mod programmeret celledød.Proc. Natl. Acad. Sci. USA90199384798483
  • 27.Huber M.,
  • Selinka H.-C.,
  • Kandolf R.

    • tyrosinphosphoryleringshændelser under kossackievirus B3-replikation.J. Virol.711997595600

  • 28.Carrasco L.

    • forbedret intracellulær calciumkoncentration under poliovirusinfektion.J. Ferrule.69199551425146

  • 29.L., Carrasco L.

    • forbedring af phospholipaseaktivitet under poliovirusinfektion.J. Gen. Ferrule.74199310631071

  • 30.Jacobsen M. D., Raff M. C.

    • rolle CED-3/ICE-familie proteaser i staurosporin-induceret programmeret celledød.J. Cell Biol.133199610411051

  • 31.Jang S. K., Davies M. V., Kaufman R. J. initiering af proteinsyntese ved intern indtræden af ribosomer i den 5′ ikke-translaterede region af encephalomyocarditis virus RNA in vivo.J. Virol.63198916511660
  • 32.jelachich M. L.,
  • Lipton H. L.

    • Theiler ‘ s murine encephalomyelitis virus dræber restriktive, men ikke tilladte celler ved apoptose.J. Virol.70199668566861

  • 33.Larsen
    1. Kaufmann S. H.,
    2. Desnoyers S.,
    3. Ottaviano Y.,
    4. Davidson N. E.,
    5. Poirier G. G.

    specifik proteolytisk spaltning af Poly (ADP-ribose) polymerase: en tidlig markør for kemoterapiinduceret apoptose.Kræftres. 53199339763985

  • 34.chu K.,
  • McGarry T. J.,
  • Reinhard C.,
  • Klippel A.,
  • Tang J.,
  • Chu K.,
  • McGarry T. J.,
  • Kirschner M. V.,
  • Koths K., caspase-3-genereret fragment af gelsolin: effektor af morfologisk ændring i apoptose.Science2781997294298
  • 35.det er en af de mest populære måder at gøre dette på, og det er en af de bedste måder at gøre det på.Nature3711994346347
  • 36.P., Budihardjo I., Srinivasula S. M.,
  • Ahmad M., Alnemri E. S.,
  • Srinivasula S. M.,
  • Ahmad M., Alnemri E. S.cytokrom C og dATP-afhængig dannelse af apaf-1 / caspase-9-kompleks initierer og apoptotisk proteasekaskade.Cell911997479489
  • 37.dff, et heterodimerisk protein, der fungerer nedstrøms for caspase-3 for at udløse DNA-fragmentering under apoptose.Cell891997175184
  • 38.
    1. Liu Y.,
    2. Kitsis R. N.

    induktion af DNA-syntese og apoptose i hjertemyocytter af E1A oncoprotein.J. Cell Biol.1331996325334

  • 39.Martin S. J.,
  • Lennon S. V.,
  • Bonham A. M.,
  • Cotter T. G.

    • induktion af apoptose (programmeret celledød) i humane leukæmiske HL-60-celler ved inhibering af RNA eller proteinsyntese.J. Immunol.145199018591867

  • 40.Larra
    1. Nair C. N.

    monovalent kationmetabolisme og cytopatiske virkninger af poliovirus-inficerede HeLa-celler.J. Virol.371981268273

  • 41.neilan J. G.,
  • Lu S.,
  • Afonso C. L., Kutish G. F., Sussman M. D., Rock D. L.

    • det afrikanske svinepestvirusgen med lighed med proto-onkogen bcl-2 og Epstein-Barr-virusgenet BHRF1.J. Ferrule.67199343914394

  • 42.det er en af de mest populære måder at gøre det på.Tendenser Biochem. Sci.221997299306
  • 43.ohlmann T., Rau M.,
  • smerte V., Morley S.

    • det C-terminale domæne for eukaryot proteinsyntese initieringsfaktor (eIF) 4G er tilstrækkeligt til at understøtte cap-uafhængig oversættelse i fravær af eIF4E.EMBO J. 15199613711382

  • 44.
    1. Orrenius S.,
    2. Nicotera P.

    calciumion og celledød.J. Neural Transm. Suppl.431994111

  • 45.
    1. Porter A. G.,
    2. Ng P.,
    3. Janicke R. U.

    dødssubstrater kommer til live.Bioessays191997501507

  • 46.Larsen
    1. Pronk G. J.,
    2. Ramer K.,
    3. Amiri P.,
    4. krav til en islignende protease til induktion af apoptose og ceramidgenerering ved REAPER.Science2711996808810
  • 47.af morfologiske ændringer i epitelcellekulturer inficeret med poliovirus.J. Eksp. Middelhavs.1041956289309
  • 48.Larsen
    1. Robbins F. C.,
    2. Enders J. F.,
    3. V. H.

    Cytopatogen virkning af poliomyelitis vira” in vitro ” på humane embryonale væv.Proc. Soc. Eksp. Biol. Middelhavs.751950370

  • 49.Rudin C. M.,
  • Thompson C. B.

    • apoptose og sygdom: regulering og klinisk relevans af programmeret celledød.Annu. Pastor Med.481997267281

  • 50.sakahira H.,
  • Enari M.,
  • Nagata S.

    • spaltning af CAD-hæmmer ved CAD-aktivering og DNA-nedbrydning under apoptose.Nature39119989699

  • 51.Sarin A.,
  • Henkart P. A.

    • forskellige interleukin-1 beta-konverteringskrav til apoptotisk død af T-lymfocytter udløst af forskellige stimuli.J. Eksp. Middelhavs.184199624452450

  • 52.Schaefer A.,
  • k Larshne J.,
  • Sibirre R.,
  • Koch G.

    • Poliovirus-inducerede ændringer i HeLa-cellemembranfunktioner.J. Virol.441982444449

  • 53.J. A.,
  • J. A.,
  • J. A.

    • apoptose: biokemi og molekylærbiologi af programmeret celledød.Endocr. Rev. 141993133151

  • 54.li> li> li> MacFarlane M.,
  • Cohen G. M.
  • Chu H.,
  • MacFarlane M.,

  • Nicholson D. V.,
  • Cohen G. M.

    • fluoromethylketon (OME) vad.FMK) hæmmer apoptose ved at blokere behandlingen af CPP32.Biochem. J. 31519962124

  • 55.Larsen
    1. Srinivasula S. M.,
    2. Ahmad M.,
    3. Fernandes-Alnemri T.,
    4. Litak G.,
    5. Alnemri E. S.

    Molekylær bestilling af Fas-apoptotisk vej: Fas/APO-1 protease Mch5 er en CrmA-hæmmende protease, der aktiverer flere Ced-3 / ISLIGNENDE cysteinproteaser.Proc. Natl. Acad. Sci. USA9319961448614491

  • 56.stennicke H. R.,
  • Salvesen G. S.

    • biokemiske egenskaber ved caspase-3, -6, -7 og -8.J. Biol. Chem.27219972571915723

  • 57.Larsen
    1. Subramanian T.,
    2. Tarodi B.,
    3. Chinnadurai G.

    funktionel lighed mellem adenovirus E1B 19-kDa protein og proteiner kodet af Bcl-2 proto-onkogen og Epstein-Barr virus BHRF1 gen.Curr. Top. Mikrobiol. Immunol.1991995153161

  • 58.Takahashi A.,
  • Alnemri E. S.,
  • Lasebnik Y. A.,
  • Fernandes-Alnemri T.,
  • Litak G.,
  • Moir R. D.,
  • Goldman R. D.,
  • Poirier G. G.,
  • Moir R. D.,
  • Goldman R. D.,
  • Poirier G. G.,
  • / li>
  • Kaufmann S. H.,
  • earnshav H. C.

    • spaltning af Lamin A ved Mch2 Alpha men ikke Cpp32: flere interleukin 1 beta-konverterende proteaser med forskellige substratgenkendelsesegenskaber er aktive i apoptose.Proc. Natl. Acad. Sci. USA93199683958400

  • 59.tarodi B.,
  • Subramanian T.,
  • Chinnadurai G.

    • Epstein-Barr virus BHRF1 protein beskytter mod celledød induceret af DNA-skadelige stoffer og heterolog virusinfektion.Virologi2011994404407

  • 60.af viral genprodukter.
    1. Teodoro J. G.,
    2. Branton P. E.

    regulering af apoptose ved virale genprodukter.Vir71199717391746

  • 61.
    1. Thome M.,
    2. Schneider P.,
    3. Hofmann K.,
    4. Fickenscher H.,
    5. Meinl E.,
    6. Neipel F.,
    7. Mattmann C.,
    8. Burns K.,
    9. Bodmer bod Schroter M.,

      10. /li>

    10. Scaffidi C.,
    11. krammer P.,
    12. Peter M. E.,
    13. Tschopp.Nature3861997517521
  • 62. Larsen
    1. Thornberry,
    2. Peterson E. P.,
    3. Rasper D. M.,
    4. Timkey T.,
    5. Garcia-Calvo M.,
    6. Houtsager V. M.,
    7. Nordstrom P. A.,
    8. Roy S.,
    9. Vaillancourt J. P.,
    10. Chapman K. T.,
    11. Nicholson D. V.

    en kombinatorisk tilgang definerer specificiteter af medlemmer af Capsasefamilien og gransym B. funktionelle relationer etableret for centrale mediatorer af apoptose.J. Biol. Chem.27219971790717911

  • 63.Larsen
    1. Tolskaya E. A.,
    2. Romanova L. I.,
    3. Kolesnikova M. S.,
    4. Ivannikova T. A.,
    5. E. Smirnova A.,
    6. Raikhlin N. T.,
    7. Agol V. I.

    apoptose-inducerende og apoptose-forebyggende funktioner af poliovirus.J. Virol.69199511811189

  • 64.R. Tomko P.,
  • Philipson L.

    • HCAR og MCAR: de humane og musecellulære receptorer for undergruppe C adenovirus og gruppe B.Proc. Natl. Acad. Sci. USA94199733523356

  • 65.Tsunoda I.,
  • C. Kurts I.,
  • Fujinami R. S.

    • apoptose ved akut og kronisk sygdom i centralnervesystemet induceret af Theiler ‘ s murine encephalomyelitis virus.Virologi2281997388393

  • 66.vanags D. M.,
  • Pron-Ares M. I.,
  • Coppola S.,
  • Burgess D. H.,
  • Orrenius S.

    • Protease involvering i fodrin spaltning og phosphatidylserin eksponering i apoptose.J. Biol. Chem.27119963107531085

  • 67.Larsen
    1. van Kuppeveld F. J.,
    2. Hoenderop J. G.,
    3. Smeets R. L.,
    4. Vilems P. H.,
    5. Dijkman H. B.,
    6. Galama J. M.,
    7. Melchers H. J.

    Kosackievirus protein 2B modificerer endoplasmatisk retikulummembran og plasmamembranpermeabilitet og letter virusfrigivelse.EMBO J. 16199735193532

  • 68.N. G.,
  • Yang J.,
  • Sakai J.,
  • brun ms,
  • Goldstein J. L.

    • spaltning af sterolregulerende elementbindende proteiner (SREBPs) ved cpp32 under apoptose.EMBO J. 15199610121020

  • 69.Stingl L., Morrison C., Jantsch M.,
  • Los M., Schulse-Osthoff K., PARP er vigtig for Genomisk stabilitet, men kan dispenseres ved apoptose.Gener Dev.11199723472358
  • 70.Bert V., Hober D.

    • apoptose og humane virusinfektioner.Ann. Biol. Blinke.541996189197

  • 71.L. P., Fahrni J. A., Troie S., Guan J. L.,
  • Orth K.,
  • Rosen G. D.

    • spaltning af fokal adhæsionskinase ved caspaser under apoptose.J. Biol. Chem.27219972605626061

  • 72.Yalamanchili P.,
  • Banerjee R.,
  • Dasgupta A.

    • Poliovirus-kodet protease 2apro spalter det TATA-bindende protein, men hæmmer ikke værtscelle-RNA-polymerase II-transkription in vitro.J. Virol.71199768816886

  • 73.Larsen
    1. Yalamanchili P.,
    2. Datta U.,
    3. Dasgupta A.

    inhibering af værtscelletranskription ved poliovirus: spaltning af transkriptionsfaktor CREB ved poliovirus-kodet protease 3cpro.J. Virol.71199712201226

  • 74.Yalamanchili P.,
  • Harris K.,
  • Vimmer E.,
  • Dasgupta A.

    • inhibering af basal transkription ved poliovirus: en viruskodet protease (3cpro) hæmmer dannelsen af TBP-TATA-bokskompleks in vitro.J. Virol.70199629222929

  • 75.Yalamanchili P.,
  • V. K.,
  • Dasgupta A.

    • spaltning af transkriptionsaktivator Oct-1 af poliovirus kodet protease 3cpro.Virologi2391997176185

  • 76.
    1. Yang D.,
    2. Anderson D. R.,
    3. Bohunek L.,
    4. Cordeiro C.,
    5. Kandolf R.,
    6. McManus B. M.

    in vitro mutations-og hæmmende analyse af de cis-virkende translationelle elementer inden for 5′ B3: potentielle mål for antiviral virkning af antigener oligomerer.Virologi22819976373

  • 77.yuan J.

    • evolutionær bevarelse af en genetisk vej til en programmeret celledød.J. Cell Biochem.601996411

  • 78.yuan J.

    • Transducerende signaler om liv og død.Curr. Opin. Celle Biol.91997247251

  • 79.Gibellini D.

    • den humane immundefektvirus type-1 (HIV-1) tat-protein og Bcl-2-genekspression.Leuk. Lymfom231996551560

  • 80.Larsen
    1. G.,
    2. Gibellini D.,
    3. Caputo A.,
    4. Bassini A.,
    5. Negrini M.,
    6. Monne M.,
    7. Capitani S.
    8. det humane immundefektvirus type-1 tat-protein opregulerer Bcl-2-genekspression i Jurkat T-cellelinjer og primære mononukleære celler i perifert blod.Blod86199538233834

    • Skriv et svar

    Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.