studiedesign

VH-765-undersøgelse: fem måneder gammelt VEHIKELINJICERET vægt (vægt + vehikel; n = 18) og J20-mus (J20 + vehikel: n = 14) og vehikelinjiceret vægt (vægt + vehikel; N = 18) og J20-mus (J20 + vehikel: n = 14) 765-injicerede J20-mus (J20 + 765: N = 13) mus blev vurderet i længderetningen på fem forskellige tidspunkter: baseline før behandling (baseline ubehandlet J20 blev grupperet sammen; n = 19), efter tre IP-injektioner om ugen med Vk-765 eller vehikel (behandling 1), Efter seks yderligere injektioner over 2 uger (behandling 2), efter 4 ugers udvaskningsperiode (VO) og efter yderligere tre injektioner på 1 uge (behandling 3) (Fig. 1a). Alle testede dyr blev inkluderet i analyserne, medmindre (a) dyret døde under forsøget, eller (b) dyret ikke reagerede adfærdsmæssigt. I alt 25 kuld, fordelt på fire forskellige kohorter og testet på forskellige tidspunkter, blev brugt. Tre af disse kohorter gennemgik Nor og open field test, mens kohorte 4 blev brugt til Barnes labyrint. Efter at dyrene var blevet testet ved baseline for at bekræfte, at J20-dyr var behaviorally deficit, blev J20-dyr tilfældigt tildelt enten vehikel-eller VH-765-behandling uafhængig af adfærdsmæssige præstationer. Af alle anvendte dyr viste fire J20-mus ingen adfærdsunderskud i begyndelsen af eksperimentet og blev ikke brugt. To J20 + – køretøjsmus bevægede sig slet ikke under eksperimentet, og deres adfærdsmæssige data blev udelukket; imidlertid blev disse dyr holdt og blev stadig brugt til analyse efter slagtning.casp1 valideringsundersøgelse: for at validere Casp1-specifikke effekter af 765 blev J20-mus genereret på en Casp1 – / – baggrund. Treoghalvfjerds mus blev anvendt (n = 12-13 pr.genotype, seks forskellige genotyper), som alle blev opdrættet gennem in vitro befrugtning (IVF) fra 35 donorhunner. Avlsdetaljer er beskrevet i afsnittet dyreforsøg nedenfor. Alle mus blev vurderet adfærdsmæssigt mellem 7 og 8 måneder, og ingen dyr blev ekskluderet fra dette studie.

alle mus blev ofret og behandlet ved 8 måneders alderen. Adfærdsscore blev blindet for musens genotype og behandling, og alle dyr blev tilfældigt tildelt til enten biokemisk eller histologisk analyse og blindt analyseret.

765, VRT-043198 IC50-analyser af rekombinante caspaser

dyreforsøg

alle dyreprocedurer fulgte det canadiske råd om retningslinjer for dyrepleje og blev godkendt af McGill University Animal Care committee. J20 transgen muselinje (jak lager nr. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) udtrykker de svenske (670 / 671km liter NL) og Indiana (717V liter F) humane app-mutationer under PDGF-pripromoter. Mandlige J20-mus blev brugt som opdrættere, og deres sæd blev brugt til IVF-koloniudvidelse.

genotyper blev bestemt ved halebiopsi og RT-PCR. Mus var gruppeindbyggede (2-4 dyr pr.bur) i standard macrolonbure under en 12-h omvendt lys/mørk cyklus og kontrollerede miljøforhold. Mad og vand var til rådighed ad libitum.765 blev opløst i 20% cremophor i dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) og administreret intraperitonealt. Vehikelbehandlede J20-og VÆGTMUS modtog kun cremophor.

analyse af blod–hjerne-barrierepermeabilitet

fem måneder gamle J20-og VÆGTMUS blev anæstetiseret med isofluran, og den højre carotisarterie blev adskilt. Et lille snit blev lavet langs halspulsvæggen, og et mikrokateter blev indsat i indgangen til den indre halspulsårer. Kateteret blev fastgjort på plads ved hjælp af suturtråd. 765 (50 mg kg−1) blev infunderet ved 50 liter min−1 (90-120 liter Totalvolumen). Mikrokateteret blev efterladt yderligere 5 minutter for at tillade diffusion, hvorefter blod blev opsamlet ved intrahjertepunktur. Musen blev transkardielt perfunderet med iskold saltvand, og hippocampus og bark blev dissekeret ud. Prøver blev sendt til Biofarmaci-platformen (Universit Kurt de Montreal) til væskekromatografi og tandem-massespektrometrianalyse.

adfærdsanalyse

åbent felt: lokomotorisk aktivitet blev målt ved hjælp af et HVS2100 automatiseret sporingssystem (HVS Image, Hamptom, UK). Mus blev anbragt i det åbne feltkammer (40 liter 40 cm Pleksiglas kasse, intet loft og hvidt gulv) og fik lov til at udforske i 5 min.

ny objektgenkendelse (NOR): mus blev præeksponeret for to identiske objekter i det åbne feltkammer i 5 minutter. To timer efter præeksponering blev mus anbragt tilbage i kammeret og udsat for et velkendt objekt og et nyt objekt i 5 minutter. Mus blev kun udsat for et specifikt objekt en gang på tværs af forskellige testsessioner, og ny objektplacering blev opvejet inden for hver behandlingsgruppe. Procentvise berøringer af det nye objekt i testfasen og diskriminationsindekset ((# touches roman − # touches familiar)/total touches) blev vurderet.Barnes labyrint: Barnes labyrintplatformen (91 cm i diameter, forhøjet 90 cm fra gulvet) bestod af 20 huller (hver 5 cm i diameter). Alle huller blev blokeret bortset fra et målhul, der førte til en forsænket flugtboks. Rumlige signaler, stærkt lys og hvid støj blev brugt til at motivere musene til at finde flugten under hver session. I tilpasningsfasen udforskede hver mus platformen i 60 s. enhver mus, der ikke fandt flugtboksen, blev guidet til den og forblev der i 90 s. i erhvervelsesfasen fulgte hvert forsøg den samme protokol med det mål at træne hver mus for at finde målet og komme ind i flugtboksen inden for 180 s. mus forblev i kassen i yderligere 60 s.fire forsøg om dagen, cirka 15 min fra hinanden, blev udført i 4 på hinanden følgende dage. I sondetesten (dag 5) udførte hver mus et 90 s forsøg. Målet var stadig placeret i samme position, men flugtboksen blev blokeret. Latenstiden og fejlene for at nå målet plus antallet af musepokker til hvert af hullerne (målpræference) blev målt. Y-labyrinten var sammensat af en symmetrisk Y-formet labyrint med tre arme 120 liter fra hinanden, betegnet A, B og C. dyr blev placeret i den distale ende af arm A og fik lov til at udforske labyrinten i 5 minutter. Samlede armindgange og spontan veksling, defineret som fortløbende poster i tre forskellige arme, blev registreret. Procentvis veksling blev bestemt.

vævsbehandling

til immunhistokemi blev mus (n = 4-6 pr.gruppe) anæstetiseret med isofluoran og transkardielt perfunderet med iskold saltvand efterfulgt af iskold 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i 0,1 M fosfatbufret saltvand. Hjerner blev postfastgjort i 10% neutral-bufret formalin (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada) i 16 timer og overført til 70% ethanol. Hjerner blev paraffin indlejret og sektioneret på 4 liter.

for vestlige blot Og ELISA (n = 4-8 pr.gruppe) blev anæstetiserede mus cervic dislokeret, hippocampus og bark dissekeret ud og straks frosset på tøris. Proteiner blev ekstraheret i 5 liter volumen/vægt med radioimmunopræcipitationsassay (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Na-deoksicholat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 liter ml−1 af proteasehæmmere Cocktail (Sigma-Aldrich)) på is med en vævshomogenisator (Omni International, g, GA, USA). Prøver blev centrifugeret (20.000 liter g, 4 liter C) i 20 minutter, supernatanten genvundet og protein kvantificeret ved hjælp af BCA-metoden. Den RIPA-uopløselige pellet blev yderligere ekstraheret i 70% myresyre i dH2O, inddampet og opløst i 200 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Immunhistologisk farvning

epitoper blev demaskeret i enten citrat (10 mM Tris-Na Citrat, pH 6,0) eller EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% mellem 20, pH 9.0) antigen hentning buffer, og immunforstærket ved hjælp af Dako Autostainer Plus automatiseret slide processor og EnVision Flekssystem (Dako, Burlington, ON, Canada). Efter deparaffinisering og rehydrering blev sektioner behandlet, blokeret i serumfri proteinblok og immuniseret med følgende antistoffer fortyndet i EnVision Fleksantistoffortyndingsmiddel: 1:2000 rabbit anti-Iba1 (vako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 rabbit anti-GFAP (Dako a-0334), 1:2000 rabbit anti-A Larp1-40 (F25276, laboratorium udviklet), og 1:1000 mus antisynaptophysin (Sigma-Aldrich s5768). Sektioner blev behandlet med det medfølgende passende mus eller kanin HRP-konjugeret sekundært antistof og visualiseret med DAB. Sektioner blev modfarvet, dehydreret og dækket med Permount (Fisher Scientific). Sektioner blev digitalt scannet med MIRAKSSCANNING til analyse (Seiss, Don Mills, on, Canada). Efter deparaffinisering og rehydrering blev dias farvet med filtreret 1% vandig Thioflavin-s (Sigma-Aldrich).

kvantitativ immunhistologisk analyse

Iba1-positive celler i barken og den forreste del af CA1-regionen i hippocampus blev kvantificeret under anvendelse af en modificeret version af arealtællingsrammen48. Kort sagt blev hvert femte dias kvantificeret (hvilket resulterede i fire sektioner pr. Der blev taget flere 80 billeder med MIRAKSSCANNINGEN inden for interesseområdet, og antallet af Iba1-positive celler blev manuelt talt. Den numeriske tæthed (antal celler mm-3) i den forreste CA1-region og hjernebarken blev estimeret. Et minimum antal på 150 hits pr.område var nødvendigt for at foretage et pålideligt skøn. Yderligere sektioner blev talt, hvis vi ikke kunne nå vores mindste antal. Kvantificering blev udført blindet for behandling og genotype. ImageJ-programmet (NIH, Bethesda, MD, USA) blev brugt til at måle en Immunopositiv farvning i CA1-regionen og hjernebarken. Hjerne blev analyseret, og der blev taget flere billeder inden for hvert afsnit for at dække CA1-regionen og hjernebarken. Tærsklen blev justeret på tværs af alle hjerner for at fremhæve det farvede område, og partikler blev analyseret for at bestemme det samlede farvningsareal. Resultaterne udtrykkes som det samlede areal, der er farvet pr. analyseret samlet areal (liter 2 mm−2). Repræsentative billeder er kun beskåret for at overholde størrelsesbegrænsninger og har ikke gennemgået nogen efterbehandling.

vestlig blotting

Museproteinprøver (25-100 liter) blev fremstillet i Laemmli (5% 2-Kurt-mercaptoethanol, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 liter ml−1 af proteasehæmmere Cocktail (Sigma-Aldrich)), kogt i 5 minutter og adskilt af polyacrylamidgelelektroforese (side). Prøver blev undersøgt med følgende primære antistoffer, fortyndet i enten 5% fedtfri tør mælk i Tris-bufret saltvand og 0,1% mellem-20 eller PBS-blokerende buffer (Termovidenskabelig): 1:1000 mus anti-human a Larr1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 kanin anti-APP C-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 kanin anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 kanin anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 kanin anti-Caspase-3 (celle signalering 9665), 1:1000 mus antiaktiv Caspase-8 (celle signalering 8592), 1:1000 kanin anti-Caspase-3 (celle signalering 9665), 1:1000 mus antiaktiv Caspase-8 (celle signalering 8592), 1: 1000 kanin anti-Caspase caspase-9 (cellesignalering 9504) og 1: 5000 mus Anti-Kris-actin (Sigma-Aldrich a5441). Blots blev påvist med 1:5000 HRP-bundet anti-mus (GE Amersham NA9310, Montreal, KK, CA) eller 1: 5000 anti-kanin (Dako P0217) sekundært antistof efterfulgt af ECL (GE Amersham). Immunreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af billeddannelsessystem LAS 4000 (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA), og densitometriske analyser blev udført med billedmåleranalyseprogram (Fujifilm USA). Lysstyrke / kontrast af rå blots blev lige justeret på tværs af hele billedet med Adobe Photoshop CS5-programmer (Adobe Systems, on, CA) for at generere repræsentative billeder. Der blev ikke foretaget yderligere ændringer. ACD system, Plantation, FL, USA) blev brugt til at skabe endelige tal. Rå blots for vestlige blots er tilgængelige i supplerende Figur 11.

ELISA

Pro – og anti-inflammatoriske cytokiner, og A-niveauer i musens hjerne blev bestemt ved hjælp af elektrokemiluminescens immunassay kits fra Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA). Standarder og prøver blev udarbejdet i henhold til producentens protokoller og kørt i to eksemplarer. Ti-pleks mus proinflammatorisk panel blev brugt til mus hippocampal og kortikal og prøver. Et enkelt Il-1 liter-sæt blev brugt til at måle museplasma. Det fire-pleks humane proinflammatoriske panel blev brugt til HPN-prøver (se nedenfor). Den fire-panel menneske en Karrus 6e10 kit blev brugt til mus hippocampus og bark, og HPN prøver.

RNA-ekstraktion og cDNA-syntese

Total RNA blev ekstraheret fra musens hippocampus og hjernebark (n = 3 pr.gruppe) med Chiasol (Chiagen, Valencia, CA, USA) efterfulgt af homogenisering med en 20-gauge nål. MiRNeasy mini kit, inklusive DNase – behandlingstrin på kolonne, blev brugt til at rense total RNA (Chiagen). RNA-kvalitet og-kvantitet blev bestemt ved hjælp af et spektrofotometer (DS-11). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Produkter blev visualiseret på RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canada) farvede 2% agarosegeler. PCR-eksperimenter i realtid blev udført med SYBR Green Tak Mastermiks (kvanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) på en Applied Biosystems 7500 hurtig PCR-SYSTEMMASKINE i realtid (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genforstærkning blev udført med følgende primere: (18S) 5 ‘- GTAACCCCGTTGAACCCCAT-3’ og 5 ‘- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5′- ACTAACCTGGTGGTGAAG-3′ og 5′- GGTCTGGGTATGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ og 5′- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3’. Resultaterne udtrykkes som fold-induktionsværdier normaliseret til at betyde HPRT og 18S referencegener ved hjælp af Pfaffls metode.

Musesynaptisk plasticitet RT2-Profiler PCR-array

musens synaptiske plasticitet RT2 Profiler PCR-Array (PAMM-126S, Chiagen) profilerer ekspressionen af 84 gener involveret i synaptiske ændringer under læring og hukommelse og fem husholdningsgener (Kurt-actin; Kurt-2-mikroglobulin; glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase, GAPDH; Kurt-glucuronidase, Gusb; HL-actin; HL-2-mikroglobulin; glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase, GAPDH; Kurt-glucuronidase, Gusb; Heat shock protein 90 alpha (cytosolic), Hsp90ab1) med real-time PCR. Total RNA (465 ng for hver prøve) blev omvendt transkriberet (som omfattede et genomisk DNA-elimineringstrin) efter producentens protokol (First streng cDNA Synthesis Kit, Chiagen). Realtids-PCR-reaktionen blev udført i en realtidscykler ABI 7500 (hurtig blok) (Applied Biosystems) ved hjælp af RT2 SYBR Green/ROKS PCR-Masterblanding (Chiagen). Cykelforholdene var som følger: 2 minutter ved 50 liter C, 10 minutter ved 95 liter C, 40 cyklusser, 15 sekunder hver ved 95 liter C og 1 minut ved 60 liter C. Tærskelværdi og baseline blev indstillet manuelt i henhold til producentens anvisninger. Data blev normaliseret til det geometriske gennemsnit af de fem husholdningsgener og analyseret ved hjælp af den sammenlignende Ct-metode (2−KRISTCT).

Neuronal cellekultur og aksonal degenerationsassay

tolv til seksten uger gammelt føtal kortikalt væv blev opnået fra Fødselsdefektforskningslaboratoriet (University of Seattle, USA) i overensstemmelse med en godkendt protokol af McGill institutionel gennemgangsudvalg. HPN blev dyrket fra hjerner, der blev dissocieret med trypsin, behandlet med deoksyribonuklease I og filtreret gennem 130, 70 og 30 liter nylon mesh21. Dissocierede celler blev centrifugeret i 10 minutter ved 300 liter g og resuspenderet i minimalt essentielt medium (MEM) med Earles salte og suppleret med 5% dekomplementeret BCS, 1 liter Penicillin-Streptomycin, 1 mM natriumpyruvat og 2 mM L-glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler blev podet med en densitet på 3 liter 106 celler ml−1 på 5 liter mL-1 poly-l-lysinbelagte seks-brønds vævskulturplader (Sigma-Aldrich). Mem-medium blev ændret hver 2.dag, og astrocytproliferation var begrænset med fluoroksyuridince (FdU) antimitotisk behandling (1 mM, Sigma) i de første 4 dage. Neuronale kulturer blev dyrket 7-10 dage før forsøg. Fire forskellige neuronpræparater på forskellige tidspunkter blev testet. Et af neuronpræparaterne var ikke stabilt, og kulturen, inklusive Serum + – kontrollen, der ikke modtog noget lægemiddel, døde midt i eksperimentet. Derfor blev der anvendt tre forskellige neuronpræparater fra tre genetisk forskellige donorer.765 toksicitet blev vurderet med 3-(4,5-dimethylthiasol-2-yl)-2,5-DIPHENYLTETRASOLIUMBROMID (MTT). Neuroner blev behandlet med 25-200 g-765 eller 0,1% DMSO (højeste anvendte DMSO−koncentration) i 72 timer. neuroner blev derefter inkuberet med 0,5 g ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) i 4 timer ved 37 g c (5% CO2). Formasankrystallerne blev opløst i 100 liter DMSO i 30 minutter. Absorbansen blev målt ved 560 og 670 nm ved hjælp af Synergy H4 pladelæser.

aksonal degeneration blev induceret enten ved appvt-transfektion eller serumberøvelsesstress. 765 blev administreret enten som en forbehandlingsstrategi (1 time før stressor) eller som en postbeading behandlingsstrategi (48 timer efter stressor). Neuroner blev transficeret af Genpistol (BioRad, Mississauga, ON, Canada) med guldperler belagt med pBudCE41-eGFP til fluorescensvisualisering. Neuroner, der blev stresset, blev transficeret med pBudCE41-eGFP/APPVT. Kort fortalt blev neuroner behandlet med et medium suppleret med 25 eller 50 g-765, 5 g-Yvad-FMK eller DMSO. Fluorescensbilleder blev taget hver 24. time (op til 72 timer efter behandling) med et Nikon Eclipse ti-mikroskop (Nikon, Mississauga, ON, CA) og fotometri coolSNAP CCD-kamera (Photometrics, Tucson, USA) ved hjælp af NIS Elements AR 3.10-program (Nikon). Procent neuronal beading blev målt ved at tælle antallet af beaded eGFP-positive neuroner over det samlede antal eGFP-positive neuroner på hvert tidspunkt. Mindst 150 eGFP-positive neuroner blev talt for hver tilstand. Konditioneret medium blev udtaget (suppleret med 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 liter ml−1 af proteasehæmmere Cocktail (Sigma-Aldrich)), og neuroner blev høstet i cellelysbuffer (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) til analyse.

statistiske analyser

antallet af dyr eller uafhængige forsøg og anvendt statistisk analyse (ANOVA og post-hoc sammenligninger) er alle angivet i figurens legender. Alle værdier udtrykkes som middelværdien af s. e. m., med F-og p-værdier angivet i figurens legender. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 7-programmer (GraphPad-programmer, La Jolla, CA, USA).