Výsledky

Modulace Buněčné p107 Úrovně Řízené Proteolýzy. Již dříve jsme ukázali, že endogenní p107, člen RB rodiny proteinů, který není přirozený substrát SCFßTrCP, mohou být odstraněny v C33A cervikální karcinom buněk pomocí ektopické exprese chimerického ßTrCP ubiquitin–protein ligase (ßTrCP-E7N), který nese p107-vázající peptid odvozený z N-terminální 35-aa zbytků HPV onkoproteinu, E7 (E7N) (1). Funkce mnoha buněčných proteinů jsou však diktovány jejich intracelulárním množstvím, a nikoli pouze jejich přítomností nebo nepřítomností. Dosud neexistovala spolehlivá metoda pro přesnou modulaci hladin intracelulárních proteinů v savčích buňkách.

nejprve Jsme zkoumali, zda p107 úrovní by mohlo být systematicky snížena prostřednictvím kontrolované vyjádření různé množství ßTrCP-E7N. Lidské C33A cervikální karcinom buňky byly infikovány s rostoucími dávkami rekombinantní adenovirus nesoucí ßTrCP-E7N nebo kontrola adenovirus pro 24 h. Infekce byla 100%, a to i při nejnižší použité dávce, jak bylo posouzeno expresí GFP neseného adenovirem ve všech přijímajících buňkách (údaje nejsou zobrazeny). Jak je znázorněno na obr. 1 (Horní), endogenní p107 úrovně byly systematicky snížena na 78%, 25%, a 5% v ustáleném stavu úrovně, když C33A buňky jsou transduced s rekombinantní ßTrCP-E7N adenovirus na mois 10, 35 a 80, ale ne stejné dávky Ad1 kontrolu virus. Proto inženýrství SCFßTrCP-BP nabízí jednoduché a reprodukovatelné prostředky na snížení celkové částky cílových proteinů v definovaných úrovní pro prubířství dávkování účinky na biologické činnosti.

P107 stabilně společníci s cyklin a, Cdk2 přes vysokou afinitu vazebného místa v proliferujících buněk (13-15). Zkoumat, zda tyto p107-asociovaných proteinů jsou také podrobeny cílené degradaci ßTrCP-E7N, imunoblotingu bylo provedeno v C33A buňky infikované Ad-F-TrCP-E7N virus. Jak je znázorněno na obr. 1, hladiny endogenního cyklinu a a Cdk2 zůstaly nezměněny, zatímco p107 byl dramaticky snížen. Kromě toho nebyly hladiny necíleného β-aktinu ovlivněny F-TrCP-E7N (obr. 1). Tento výsledek poskytl silný důkaz, že upravená ßTrCP-E7N ubiquitin-proteinová ligáza specificky degraduje cílený substrát p107, ale ne jeho přidružené proteiny.

selektivní degradace specifické Posttranslačně modifikované subpopulace cílového proteinu. Modifikace buněčných bílkovin na posttranslační úrovni, jako je fosforylace, je základním prostředkem buňky využívat k regulaci funkce nebo poskytují nové aktivity proteinu. Experimentální nástroje pro pitvu funkce spojené s konkrétní událostí posttranslační modifikace jsou v současné době omezené. Protože bílkoviny knockout působí na posttranslační úrovni, které přímo rozpoznává cílové proteiny, jedna aplikace je inženýr konkrétní E3, který je schopen výběru subpopulace posttranslationally modifikované proteiny pro degradaci, místo toho, aby zničení celé populace.

bylo zjištěno, že HPV16 E7 se selektivně váže na hypofosforylovanou formu RB (16). Zkoumali jsme, zda je chimerická ßTrCP-E7N ubiquitin–protein ligase mohl rozlišit hypo – a hyperphosphorylated RB a vyberte pouze hypoform pro degradaci. Lidského osteosarkomu U2OS buňky vyjádřit obě formy RB, které mohou být snadno identifikovány na základě jejich rozdílné elektroforetické mobility na SDS/PAGE (Obr. 2A, pruh 1) (17). Identita těchto dvou druhů RB byla dále ověřena imunoblotováním pomocí protilátek specifických buď pro hypo – nebo hyperfosforylované formy RB (obr. 2A, pruhy 2 a 3). U2OS buňky byly infikovány rekombinantním Ad-F-TrCP-E7N nebo kontrolní Ad1 adenoviry pro 48 h, a v ustáleném stavu hladiny RB-P a RB byly analyzovány současně pomocí Western blotting, pomocí anti-RB monoklonální protilátka, která rozpoznává obě formy. V souladu s preferenční vazbou E7N na hypofosforylovaný RB vedla ektopická exprese F-TrCP-E7N k eliminaci hypofosforylovaného RB, zatímco hyperfosforylovaný RB-P zůstal neporušený (obr. 2b Horní, porovnat pruhy 4-6 s pruhy 1-3). Tento výsledek poukazuje na schopnost modifikovaných F-TrCP-E7N ubiquitin–protein ligase při výběru konkrétní subpopulace RB pro rozklad, který byl založen na stavu některých posttranslační modifikace cílových proteinů.

Full-délka HPV16 E7 mohl komunikovat s cyklin-dependentní kinázy inhibitory p21Waf1 a p27Kip1, ale vazebné domény je umístněna na C-terminální doména (zbytky 40-98), místo E7N fragment (zbytky 18-20). Dále zkoumat specifičnost F-TrCP-E7N, stejné U2OS buňky extrakty byly také sondoval s protilátkami proti p21Waf1 a p27Kip1. Jak je vidět na obr. 2B (Střední), ustálené hladiny p21waf1 a p27Kip1 zůstaly nezměněny. Celkově vzato, inženýrství F-TrCP-E7N prokázána specifita proteolytické k RB rodiny proteinů, ale ne jiné buněčného cyklu regulační orgány jako Cdk2, cyklin A, p21Waf1, a p27Kip1.

strukturní mutageneze za vzniku vysoce specifické ßTrCP-E7N Ubiquitin-proteinové ligázy. Chimérický ßTrCP-E7N je stále schopen vázat endogenní substráty ßTrCP, včetně IkB, β-kateninu a ATF4 (3-7). Nadměrná exprese ßTrCP-E7N může interferovat s degradací těchto původních substrátů. Naopak, vazba na endogenní substrát ßTrCP-E7N by mohly narušit správné umístění na určený substrát přijmout ubiquitin z ubiquitin-conjugating enzyme, a proto snížit účinnost cílené degradace (Obr. 3). Kromě toho, ßTrCP interaguje s pseudo substrátu hnRNP-U, který postrojů ßTrCP a jeho deriváty v jádře a brání jejich interakci se substráty (21). Zavedením specifických mutací aminokyselinových zbytků na ßTrCP odstranit jeho vazbu na β-catenin, IkB, nebo hnRNP-U, očekáváme, že ke zlepšení specifičnosti, ale také dostupnost inženýrství ßTrCP-E7N rekrutovat určena substrátu (Obr. 3. nižší).

substrát-vazebné domény ßTrCP obsahuje sedm WD40 repetic v C-terminální oblasti, které se skládají do typické sedm čepelí β-vrtule struktura zachována mezi WD40 proteinů (3-7). Protože celkové integrity β-vrtule struktura WD40 proteinů je rozhodující pro jejich funkce, standardní mazání mutageneze přístup bude pravděpodobně vyvolat hrubé strukturální změny, a tudíž není použitelná pro stanovení substrát-vazebná místa na ßTrCP. Známá krystalová struktura proteinů WD40 však může být využita k identifikaci povrchových zbytků zapojených do vazebných substrátů ßTrCP. Struktury založené na mutageneze přístup byl navržen tak, aby identifikovat a mutovat pět kladně nabité zbytky (R285, K365, R474, R521, a R524), předpověděl pobývat na horní povrch WD40 β-vrtuli, která se účastní vazby na WD40-asociovaných proteinů (Obr. 3B) (22). Tento přístup byl podrobně popsán v podpůrných metodách, které jsou zveřejněny jako podpůrné informace na webových stránkách PNAS. Také viz obr. 6, která je zveřejněna jako podpůrná informace na webových stránkách PNAS. Kromě toho substituce těchto reziduí Lys / Arg pravděpodobně nezmění celkovou strukturu ßTrCP.

Použitím quikchange multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene) jsme současně mutovali tyto zbytky na Glu. Tato sloučenina označená vlajkou, označená F-TrCP (m1) – E7N, byla testována na jeho vazbu jak na endogenní (IkB), tak na zamýšlené (p107) vyřazovací cíle. HeLa buňky byly přechodně transfektovaly s F-TrCP(m1)-E7N nebo F-TrCP-E7N, a jejich interakce s IkB a p107 byly určeny coimmunoprecipitation. F-TrCP-E7N A F-TrCP vykazovaly podobné afinity k fosforylovanému proteinu IkB, zatímco mutace sloučeniny m1 zrušily vazbu F-TrCP(m1) – E7N (obr. 3C uprostřed). Naproti tomu podobné hladiny p107 byly detekovány v imunokomplexech F-TrCP-E7N nebo F-TrCP (m1) – E7N (obr. 3C Nižší), což naznačuje, že upravená F-TrCP(m1)-E7N ubiquitin–protein ligase je plně funkční v náboru určených cílových buněk. Tyto výsledky jsou v souladu se strukturálními předpovědi na obr. 3B, a dále definovat aminokyselinové zbytky na ßTrCP kritické pro rozpoznávání endogenního substrátu.

navržen F-TrCP(m1)-E7N byl dále analyzovány pro jeho účinnost v ponižující endogenní p107. Buňky C33A byly kotransfektovány pomocí F-TrCP, F-TrCP-E7N nebo F-TrCP(m1) – E7N spolu s exprese CD19 plazmidu. Čtyřicet osm hodin po transfekci byly buňky sklizeny a obohacené pro ty obdržení transfektovaly plazmidů pomocí immunomagnetic korálky konjugované anti-CD19 monoklonální protilátka. Endogenní hladiny p107 byly následně stanoveny imunoblotováním. Jak je znázorněno na obr. 3D ektopická exprese F-TrCP(m1) – E7N vedla k 95% snížení endogenních hladin p107, zatímco u F-TrCP-E7N byla pozorována 82% down-regulace p107 (obr. 3D Horní, porovnat pruhy 4 a 3). Dále, vyjádření F-TrCP(m1)-E7N nemělo žádný zaznamenatelný vliv na tumor nekrotizující faktor (TNF)-α indukované degradaci IkB nativní SCFßTrCP, nebo na zničení p27kip1, které SCFSkp2 ubiquitin–protein ligázy (údaje nejsou uvedeny). Proto, ektopické expresi modifikovaných F-TrCP(m1)-E7N není v rozporu s celkovým SCF ubikvitinace činnosti umlčet základní SCF komponenty (Skp1, CUL-1, a Rbx1/Roc1) sdílí endogenní F-box bílkovin.

cílená degradace p107 byla dále hodnocena v jednotlivých buňkách C33A nepřímým imunofluorescenčním testem. Důsledně byl p107 do značné míry eradikován v buňkách C33A exprimujících F-TrCP-E7N nebo F-TrCP(m1)-E7N, ale ne samotný F-TrCP (obr. 3E). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že odstraňováním vazebných míst pro endogenní ßTrCP substráty, inženýrství F-TrCP(m1)-E7N ubiquitin–protein ligase prokázala zvýšení specifičnosti a robustní proteolytické aktivity směrem k zamýšlenému cíli.

minimální vazebná doména jako cílený peptid pro efektivní nábor substrátů. Pro dosažení vysoké specifičnosti podkladu nábor a minimalizovat nespecifické zaměření se na jiné buněčné proteiny, které jsme testovali, zda minimální p107/RB interakce domény E7N (určené E7m), který zahrnuje zbytky 21-29 z E7 zahrnující LXCXE motiv (23), mohl dosáhnout efektivní vazby a degradace p107. Chimérická ubiquitin–protein ligase byla postavena v němž ßTrCP a E7m byly kovalentně spojeny flexibilní 20-aa distanční skládá z 10 kopií Gly-Ser opakuje (určené 10GS). F-TrCP-E7N nebo F-TrCP-10GS-E7m byly přechodně transfektovaly do C33A buňky a jejich vazba na endogenní p107 byla hodnocena immunoprecipitation v extrakty připravené po léčbě s proteazomový inhibitor MG132 k inhibici degradace jako důsledek této interakce. Jak je znázorněno na obr. 4A (dráhy 2 a 3), F-TrCP-10GS-E7m měl mírně zvýšenou afinitu k p107 než původní F-TrCP-E7N. F-TrCP-E7N a F-TrCP-10GS-E7m byly dále hodnoceny pro jejich účinnost v p107 degradace transientní transfekci v C33A buňky jako na Obr. 3D. jak je znázorněno na obr. 4B, F-TrCP-E7N a F-TrCP-10GS-E7m vyvolané až 92% a 95% down-regulaci p107, což naznačuje, že upravená ßTrCP nesoucí minimální p107-vazebné domény funguje stejně účinně jako původní F-TrCP-E7N v ponižující cílové proteiny.

Retrovirální-Zprostředkované Dodání Inženýrství ßTrCP pro Trvalé Degradaci Endogenních Cíle. Dále jsme zkoumali, zda inženýrství ubiquitin–protein ligázy mohl být stabilně vyjádřil k dosažení trvalé degradaci zamýšlený cíl. HL-60 promyelocytární leukemické buňky jsou transduced s rekombinantní retroviry vyjádření PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N, nebo ovládání F-TrCP-E7N(ΔDLYC), ve kterém RB/p107-vazebné místo bylo zrušeno (1). Infikované buňky s chromozomálně integrovaný chimerická F-TrCP transgeny byly izolovány pomocí FACS sorting, na základě exprese GFP z virů, a degradaci endogenních p107 byla hodnocena z infikovaných HL-60 buněk, a to buď okamžitě po infekci (Obr. 5A), nebo po 3 měsících kultivace v růstovém médiu (obr. 5B). Kromě toho, protože dva další členové RB rodiny proteinů, RB a p130, jsou také vyjádřeny v HL-60 buňkách jsme zkoumali, zda jeden F-TrCP-E7N může současně cíl degradace celého RB rodiny proteinů, které interagují se stejnými LXCXE motiv E7N. Ektopické exprese retrovirally transduced F-TrCP-E7N vyvolané dramatickým down-regulace hypophosphorylated podobě RB, stejně jako p107 (Obr. 5A) a p130 (údaje nejsou zobrazeny) v buňkách HL-60, buď bezprostředně po infekci a třídění FACS (obr. 5A), nebo 3 měsíce po infekci a kontinuální kultivaci (obr. 5B, pruh 3). Naproti tomu stabilní exprese F-TrCP-E7N (ΔDLYC)v buňkách HL-60 neměla žádný vliv na změnu p107, RB (obr. Úrovně 5A, lane 3) a P130 (údaje nejsou zobrazeny). V souladu s pozorováním, že F-TrCP-E7N přednostně degraduje hypofosforylovaný RB v buňkách U2OS (obr. 2), redukce hyperfosforylovaných druhů RB stabilní expresí F-TrCP-E7N byla méně výrazná ve srovnání s redukcí hypofosforylované formy v buňkách HL-60 (obr. 5A, porovnat pruh 2 pRB a pRB-P).

Na zacházení s all-trans retinová kyselina (ATRA), HL-60 buněk ukončení buněčného cyklu a podstoupit terminální diferenciaci. Byla pozorována akumulace hypofosforylovaného RB, o které se dříve uvádělo, že přispívá k ATRA-indukované zástavě růstu, zatímco hyperfosforylovaný RB nebyl detekovatelný (24, 25). Zkoumat, zda SCFßTrCP strojní zařízení může být také využita během buněčného cyklu exit, HL-60 buněk stabilně exprimujících F-TrCP-E7N nebo F-TrCP(m1)-E7N byli léčeni 1 µM ATRA pro 72 h a degradace RB rodiny proteinů byly hodnoceny. HL-60 buněk stabilně exprimujících F-TrCP-E7N mělo za následek 95%, 98%, a 85% snížení RB, p107 a p130 úrovní, respektive, ve srovnání s buňkami infikovanými s kontrolou pBMN-GFP virus (Obr. 5B, pruh 2). Protože ATRA také aktivuje transkripci genů pod kontrolou Moloney murine leukemia virus LTR z pBMN-GFP (26), zvýšená exprese F-TrCP-E7N na ATRA léčba pravděpodobně dále přispěl k efektivní down-regulaci p107, p130, a hypophosphorylated RB (Obr. 5B).

účinek RB rodiny proteinů na normální buňky-cyklus progrese byla zkoumána u myší embryonální fibroblasty s narušením v RB, p107 a p130 geny, a zjistil, nereaguje na signály, které indukují G1 zatčení, jako je růstový faktor odstoupit nebo poškození DNA (27, 28). Kolektivní účinky členů rodiny RB na proliferaci nádorových buněk však nebyly studovány kvůli nedostatku účinných reverzních genetických nástrojů. Stabilní HL-60 buněk exprimujících F-TrCP(m1)-E7N z této studie nám umožnila posoudit, jak nádorové buňky deficientní pro všechny tři RB rodiny proteinů reagoval na G1-zatčení signály. V exponenciálně rostoucí HL-60 buněk exprimujících F-TrCP(m1)-E7N, že indukované konstitutivní degradace RB rodiny proteinů, výrazné zrychlení buněčného cyklu progrese byla pozorována ve srovnání s těmi, infikované kontrolním pBMN-GFP virus (Obr. 5c vlevo). Tento výsledek je v souladu se zhoršenou kontrolou přechodů G1– S pozorovaných u fibroblastů embryí RB–/–, p107–/– a P130–/ – triple knockout myších embryí (27, 28).

léčba ATRA inhibovala přechod fáze G1 na S v buňkách HL-60 infikovaných kontrolním pBMN-GFP (obr. 5C) nebo F-TrCP-E7N(ΔDLYC) virus (údaje nejsou zobrazeny), což je v souladu s tím, co bylo hlášeno pro neinfikované buňky HL-60 (obr. 5C) (24). Počáteční zpoždění přechodu G1-S bylo také pozorováno u buněk pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 po 48 hodinách po ATRA. Úplné zástavy G1 však nebylo možné dosáhnout v pozdějším stádiu (72-96 h) a buňky pokračovaly v průběhu progrese buněčného cyklu (obr. 5C). V kontrastu, ovládání pBMN-GFP/HL-60 buňky byly blokovány v G1 mezi 72 a 96 h. Tato pozorování naznačují, že F-TrCP(m1)-E7N-zprostředkovaná degradace RB členy rodiny, narušuje pozdní ATRA-odpověď událost, nezbytné pro dokončení růstu zatčení, vzhledem k tomu, že brzy útlum G1–S vývoj byl do značné míry ovlivněn. Dále bylo pozorováno dramatické snížení počtu buněk mezi 72 a 96 h po léčbě ATRA v důsledku masivní buněčné smrti během výstupu a diferenciace buněčného cyklu indukovaného ATRA (29). Nápadně, HL-60 buněk exprimujících F-TrCP(m1)-E7N vykazoval průměrný nárůst o 2 – až 3-krát v subG1 populace ve srovnání s kontrolní infikovaných HL-60 buněk (údaje nejsou uvedeny), což je v souladu se zvýšenou buněčnou smrt v RB–/–, p107–/–, p130–/– triple knockout myších embryonálních fibroblastů, buněk, pod růstu-inhibiční podmínky (28). Kolektivně, konstitutivní expresi F-TrCP(m1)-E7N vyvolané down-regulace celého RB rodiny proteinů, což vede k inhibici růstu zatčení a zvýšení buněčné smrti na ATRA léčby.

ATRA-indukované G1 zatčení zahrnuje koordinované regulace více buněčných signálů/složek, které negativně kontrolu buněčného cyklu (přezkoumána v ref. 30). Dimberg a kol. (31) uvádí, že ATRA spouští sekvenci událostí v myeloidních buňkách zahrnující časné zvýšení exprese p21waf1, stabilizaci p27kip1 a později defosforylaci RB na počátku zástavy G1. Protože ßTrCP(m1)-E7N degraduje jen RB členy rodiny a nemá žádný vliv na stabilitu p21waf1 a p27kip1, je pravděpodobné, že pouze pozdě, RB-závislé ATRA reakce je ovlivněna, což je v souladu s odporem pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 buněk k dokončení G1 arrestat72–96 h (Obr. 5C). Pozorovaná časná inhibice růstu ATRA při 48 hodinách (obr. 5C) lze alespoň částečně přičíst up-regulaci p21waf1 a p27kip1, jejichž stabilita není ovlivněna konstitutivní expresí F-TrCP (m1) – E7N (obr. 2 a 5).