HANCs pocházejí z epidermis hlavy a nejsou specifikovány v embryích s nedostatkem lb. (A–D) Konfokální mikroskopie v kombinaci s průchozím světle programy ukazující boční (A–C) a hřbetní (D) názory vedoucího WT (a) a šnečí enhancer trap N516 (B–D) embrya double-označen pro Lb (zelená) a β-galaktosidázy (červená). (A) v embryu 11. stupně několik buněk v epidermis hřbetní hlavy exprimuje lb (hrot šípu). Ve stadiu 14 (B) a stupni 16 (C) lb-pozitivní buňky koexpresují escargot (šipky) a lokalizují se na špičku invaginujícího čelního vaku. D) hřbetní pohled na embryo stupně 16 N516, ukazující koexpresi lb a LacZ v distální části čelního vaku (hrot šípu). (E a F) Nomarski mikroskopie představuje hřbetní výhled fázi 16 embryí a (G a H) dorzolaterální výhled fázi 14 embryí pro barevné šnečí přepisy. E A G) exprese esg u embryí WT. Šipka označuje HANCs. (F A H) u embryí s nedostatkem lb chybí exprese esg na špičce čelního vaku (*). Vzdálenost mezi nejvíce distální frontální sac buněk a žloutkový váček (zobrazení hnědá barva pozadí) je mnohem větší v lb-deficientních embryí (porovnat obousměrné šipky v G a H). (Zvětšení: a A B, ×300; C, ×350; D, ×600; E A F, ×100; G a H, ×350.společně tyto údaje naznačují, že buňky exprimující lb ležící bezprostředně před srdcem pocházejí z epidermis hlavy a migrují směrem ke špičce srdce během invaginace čelního vaku. Toto pozorování vyvolává další otázku týkající se role genů lb ve specifikaci této skupiny buněk. Dříve jsme ukázali, že lb geny hrají důležitou roli ve specifikaci podmnožiny srdečních a svalových prekurzorů (11, 19). Funkční analýza myšího genu lb ortholog Lbx1 (21, 22) také odhalila jeho dopad na kontrolu specifikace a řízené migrace prekurzorů apendikulárního svalu. Nejnovější údaje navíc naznačují, že Lbx1 u myší specifikuje subpopulaci buněk srdečního nervového hřebenu nezbytných pro normální vývoj srdce (23).

abychom otestovali, zda je Drosophila lb vyžadována pro specifikaci buněk spojených se srdcem, analyzovali jsme tvorbu hřbetního vaku u embryí s nedostatkem obou genů lb (viz materiály a metody). Pomocí sondy esg RNA jako markeru jsme prokázali, že u embryí lbdef chybí exprese esg v distální části čelního vaku nesoucího buňky spojené se srdcem (porovnejte obr. 2 E A G S F A H). Kromě toho, jak ukazuje dorsolaterální pohledy na embrya fáze 14 (obr. 2 g a H), vzdálenost mezi žloutkovým vakem a nejvíce distálními ESG pozitivními buňkami je významně zvětšena u embryí s nedostatkem lb. Toto zjištění, podporované Nomarski optika pozorování odhaluje, že zadní část čelní sac má změněné morfologie (data nejsou zobrazena), je uvedeno, že HANCs nejsou specifikovány nebo nemusí přenést správně v lbdef embryí. Protože analyzovaný nedostatek pokrývá také sousední geny bap a C15, Testovali jsme frontální tvorbu vaku v embryích mutovaných bap a Arm-GAL4>UAS-rnaic15 embrya. V obou bap208 a RNAiC15 embryí, esg-barevné čelní vak byl normální tvar (údaje nejsou uvedeny), což vylučuje vliv bap a C15 geny na diferenciaci nebo migraci srdce-související články. Tyto údaje silně naznačují, že abnormální vzor distální esg-pozitivní čelní sac buněk v lbdef embryí výsledky ze ztráty lb funkce.

mezodermální a Nemesodermální složky podílející se na vzorování oblasti srdečního odtoku. Naše imunostainingové experimenty ukázaly, že lb-pozitivní buňky ukotvující srdce leží velmi blízko kardioblastům exprimujícím lb (obr. 1). Protože většina přední cardioblasts express tin (5), dvakrát jsme označeny embryí s anti-Tin a anti-Lbe protilátky k vizualizaci příslušných pozic srdce tip a nejvíce distální část čelní sac. Překvapivě se tyto dvě struktury překrývají asi o tři délky buněk, když jsou pozorovány z dorzální strany(obr. 3A). Navíc boční konfokální pohled na přední oblast srdce(obr. 3B) jasně ukazuje, že špička čelního vaku, která se skládá z nemesodermálních buněk exprimujících lb, je přímo připojena k srdci. Přesněji jsme pozorovali, že přední část aorty (částečně překrývající se buňky lb spojené se srdcem) se ohýbá ventrálně a vytváří morfologicky odlišnou oblast odpovídající oblasti srdečního odtoku. Tato morfologie naznačuje, že by mohla existovat další buněčná složka podporující ventrální ohýbání srdce. Rozhodli jsme se hledat přítomnost ventrálně umístěného svalu připojeného ke špičce aorty. Boční pohled na embryo, dvojitě obarvený pro těžký řetězec myosin (Myo)a Lbe (obr. 3C), jasně ukazuje, že odtok srdce je skutečně připojen k hlavnímu svalu, který navrhujeme nazvat COM. Přesnější analýza konfokální úseků bylo zjištěno, že srdeční primordium je, ve skutečnosti, spojených dvěma úzce ležící COMs, které přesahují z jícnu a připevněte na obou stranách srdeční odliv regionu (otevřené šipky v Obr. 3D). Překvapivě tyto embryonální svaly hlavy nebyly dříve popsány podle našich znalostí. Nedostatek publikované dokumentace pro COMs je pravděpodobně proto, že morfologie a původ somatických svalů hlavy v embryu Drosophila nebyly systematicky analyzovány. Použití k dispozici pouze popis dospělých hlavu svalstvo provádí Miller (24), jsme byli schopni identifikovat dospělé hlavy svaly, které by mohly odpovídat embryonálních COMs zde prezentovány.

zajímavé je, že dvojité barvení Myo/Lbe také odhalilo, že nemesodermální HANCs jsou připojeny k oběma srdečním buňkám (obr. 3E) a COMs (obr. 3D). Protože HANCs exprimuje lb a selektivně se sdružuje s nejvíce předním lb pozitivním párem srdečních buněk(obr. 3e a 4 D–F), spekulujeme, že navázání tohoto kontaktu může zahrnovat buněčné interakce homofilního typu. Testování buněčné adheze molekul zapojených v mezibuněčné signalizaci mezi homotypic buňky (25, 26), pomůže v definování mechanizmy propojení mezi lb-vyjádření HANCs a srdečních buněk.

vizualizovat prostorové uspořádání tip aorty, COMs, a lb-vyjádření HANCs, použili jsme počítačové 3D analýzy a rekonstrukce konfokální skenování. Tento přístup plně potvrdil naše pozorování, které odhalily, že kromě Hancsu je oblast odtoku srdce pevně spojena s dvojicí com (obr. 3F). Tyto svaly překrývají špičku srdce z obou stran a přispívají k jeho ventrálnímu ohýbání.

abychom pochopili, jak je kontakt mezi srdcem, COMs a Hancsem navázán během vývoje, sledovali jsme tyto struktury v časném a pozdním stádiu 14 embryí (obr. 3 G A H). Naše data naznačují, že oba lb-pozitivní srdeční buňky a lb-vyjádření HANCs přilákat rozšíření Komunikace.

kontakt mezi COMs a HANCs zdá mírně předcházet COM upevnění na špičku aorty a je vidět na začátku fáze 14 (Obr. 3G). V té době se comova fillopodie rozšiřuje ve směru lb pozitivních srdečních buněk (obr. 3G) a definitivně se připojí k těmto buňkám v pozdním stádiu 14 na počátku fúze srdce (obr. 3H). Protože COMs přicházejí do styku se srdečními buňkami a HANCs předtím, než se HANCs připojí k srdci, spekulujeme, že COMs, kromě ohýbání špičky srdce, usnadňují jeho kontakt s HANCs. Navázání kontaktu mezi somatické svaly a jejich epidermální přípojná místa (šlachové buňky) byl rozsáhle studován (27), odhalující klíčovou roli zinek prst transkripční faktor Stripe (28) a RNA-vázající protein, Jak (29). Oba tyto markery jsme použili k testování, zda HANCs a srdeční buňky, ke kterým COMs připojují zobrazovací vlastnosti buněk podobných šlach. Dvojité označování provádí na WT embryí s anti-Lbe/anti-Pruhem a na tom, jak-lacZ embryí s anti-Lbe/anti-LacZ protilátek bylo zjištěno, že HANCs a COM-kontaktování srdeční buňky nemají express šlachy buněčné markery (údaje nejsou uvedeny). Toto zjištění naznačuje, že lb-pozitivní buňky přitahují COMs pomocí mechanismu odlišného od mechanismu používaného buňkami šlach. Nejzajímavější kandidáty pro vedení COMs jsou vylučovány bílkoviny Štěrbinou vlastnit více-protein vázající motivy a jeho receptory Robo a Robo2 (30). Slit a Robo se nedávno objevily jako klíčové složky ovládající procesy přitažlivosti a odpuzování během morfogeneze somatických svalů (31), což naznačuje, že by mohly být také zapojeny do přitažlivosti COM.

nejvíce přední lb exprimující srdeční buňky hrají ústřední roli v vzorování oblasti srdečního odtoku. Pozorování, které se COMs i HANCs rozhodli připojit k nejvíce předním lb pozitivním srdečním buňkám, nás přimělo k testování, zda deregulace exprese lb v srdci může ovlivnit vzorování oblasti srdečního odtoku. K provedení tohoto testu jsme použili expresní systém cílený na Gal4 / UAS (16). Byly použity dvě různé efektorové linie GAL4, 24B-GAL4 a Tin-GAL4 (obr. 4 A A C). Linka 24B-GAL4 umožňuje cílenou expresi ve všech srdečních a svalových buňkách (obr. 4A) s jednotnou a vysokou úrovní exprese v předních srdečních buňkách (šipka na obr. 4A). Linka Tin-GAL4 (laskavě poskytl R. Bodmer) indukuje UAS expresi transgenu selektivně ve čtyřech cardioblasts v každé hemisegment (patří mezi ně lb-pozitivní buňky), ale úroveň indukce v nejvíce přední srdeční buňky je nižší (šipka na Obr. 4C) než u linky 24B-GAL4. Pro rozšíření exprese srdeční lb byly obě efektorové linie GAL4 překročeny linií UAS-lbe. Mimoděložní lb srdeční výraz vedený Tin-GAL4 linie byla slabší než endogenní lb výraz v srdci, a žádné zjevné gain-of-function vyvolané změny ve vzorování srdeční odliv regionu byly pozorovány (údaje nejsou uvedeny). Naproti tomu embrya 24B-GAL4>UAS-lbe vykazovala výraznou expanzi exprese lb v srdci (obr. 4G), což vede k abnormálnímu kontaktu COMs se špičkou srdce. Přesněji jsme zjistili, že COMs se připojují přímo k předním srdečním buňkám, které tvoří srdeční výtok (hvězdička na obr. 4G) a ne na druhý pár srdečních buněk jako ve WT (obr. 4D). Změněné spojení COMs s největší pravděpodobností vyplývá z ektopických atraktivních signálů generovaných zvětšenou srdeční expresí lb. V důsledku toho bylo ventrální ohýbání nejvíce přední části srdce výraznější (porovnejte obr. 4 D A G). Také jsme si všimli změněné morfologie COMs (otevřená šipka na obr. 4 D A G), které by mohly být výsledkem mimoděložní svalové exprese lb řízené 24B-GAL4. Kontakt mezi Hancsem a srdečními buňkami nebyl ovlivněn experimentálními podmínkami nesprávné exprese. Otestovat, zda srdeční lb výraz je vyžadována pro přitažlivost COMs, využili jsme od dříve popsané negativní regulační vliv i-skipped (eve), který je schopen specificky potlačovat lb v srdečních buňkách (5). Opět platí, že efektorové linky 24B-GAL4 a TIN-GAL4 byly použity k pohonu výrazu Evy v srdci. Zjistili jsme, že oba tyto ovladače křížený s UAS-eva-line (Tin-GAL4 s nižší penetrancí) vedou k potlačení lb aktivita v srdci (Obr. 4 H A I). Navzdory chybným defektům se srdeční primordie tvoří normálně v UAS-Eve zisk funkčních embryí (ref . 5 a obr. 4B), což nám umožňuje sledovat COMs a HANCs v kontextu, ve kterém je srdeční exprese lb vyčerpána. Naše data ukazují, že u takových embryí s deplecí lb (viz absence exprese srdeční lb na obr. 4 H A I) COMs se nepřipojují ke špičce srdce. Pozorovali jsme, že COMs se rozšířily dopředu a připojily se k invaginujícím Hancům (obr. 4 H A I), které již nejsou schopny správně ukotvit špičku srdce. Hlavní větev COM, která se normálně váže na oblast odtoku srdce (porovnejte obr. 4 E A F S H A I) chyběly nebo se spojily s větví připojující HANC. Domníváme se tedy, že abnormální tvar COM a úplná ztráta jeho kontaktu se špičkou srdce jsou způsobeny vyčerpáním srdeční lb. Tento předpoklad je podporován skutečností, že stejné fenotypy byly pozorovány u embryí s ektopické srdeční (Tin-GAL4-driven) a srdeční plus svalové (24B-GAL4-driven) vyjádření evy (srovnej Obr. 4 H A I). Změněný kontakt a umístění COMs se objevily v pozdním stádiu 14 embryí, když těžký řetězec myosinu ještě není detekovatelný v kardioblastech (obr. 4 E A H). Analýza embryí ve stadiu 15 navíc odhalila, že ztráta srdeční exprese lb je doprovázena down-regulací β3-tubulinu(porovnejte obr. 4 F A I) v oblasti srdečního odtoku, což naznačuje, že exprese lb v srdci má důležitý dopad na konečnou srdeční morfogenezi. Tyto údaje doplňují nedávné zprávy popisující morfogenetickými role PŘEVRAT-TF receptor člena rodiny, Seven-up, vyjádřené v zadní pár cardioblasts v každém segmentu a potřebné pro tvorbu ostia v břišní segmenty A5–A7 (32, 33). V této souvislosti demonstrace role lb v vzorování oblasti srdečního odtoku zvyšuje možnost, že v břišních segmentech hraje lb podobnou roli při navazování kontaktu mezi srdečními buňkami a alarmujícími svaly srdce. Tato hypotéza je třeba prozkoumat.

navíc prezentované fenotypy (obr. 4) naznačují, že lb výraz experimentálně vyčerpány v srdci vlivy emisí nebo příjem atraktivní signálů srdečních buněk a v důsledku toho vede k narušení kontaktu s COMs. Stejný nebo podobný svalový atraktant bude pravděpodobně produkován nebo přijímán lb-pozitivními HANCs, což naznačuje, že lb reguluje expresi genů zapojených do kontaktu buňka–buňka. Je zajímavé, že v myši lb homolog, Lbx1 genu bylo zjištěno, že bude nutné pro řízené migrace podmnožinu svalové prekurzorů (21, 22), což naznačuje, že zachovaná buňka-pohyb mechanismů by mohly existovat, které jsou řízeny lb geny.

společně, a to prostřednictvím analýzy embryí, ve kterém srdeční lb výraz byl rozšířen nebo experimentálně vyčerpány, jsme prokázali, že lb je nutné pro správné upevnění HANCs a COMs, a v důsledku toho pro řádné vzorování srdeční odliv regionu. Toto zjištění poskytuje vhled do funkčního významu přední a zadní diverzifikace srdečních prekurzorů v každém segmentu srdce Drosophila.

může HANCs představovat Drosophila prototyp neurálních hřebenových buněk? Obratlovců srdce morfogeneze zahrnuje dva různé typy buněk, segmentovaného srdce nejprve a subpopulace buněk neurální lišty, které migrují z oblasti hlavy. V tomto článku jsme ukázali, že v Drosophila skupina nonmesodermal buňky pocházející z hlavy epidermis (který jsme pojmenovali HANCs) přispívá k závěrečné morfogeneze srdce. Stejně jako v obratlovců neurální buňky, HANCs podstoupit řídil pohyby, vstoupit v kontakt s srdeční buňky, a podílet se na vzorování srdeční odliv regionu. Prokázali jsme, že homeoboxové geny lb, o nichž je známo, že se podílejí na diverzifikaci srdečních prekurzorů (5, 11), jsou exprimovány v HANCs a jsou vyžadovány pro jejich specifikaci. Podobně, ortholog lb, Lbx1 genu, bylo nedávno zjištěno, že být požadovány pro specifikaci podmnožinu srdeční neurální buňky v myši (23), což naznačuje, že lb/Lbx1 geny hrají zachovány roli ve specifikaci nonmesodermal komponent srdce. Z tohoto pohledu by HANCs mohl být skutečně srovnáván s buňkami neurálních hřebenů obratlovců. Nicméně, naše údaje naznačují také, že HANCs zobrazit alespoň dva rysy, které jsou specifické pro Drosophila pouze: (i) se pohybují jako součást složit hlavu ectoderm a ne jako delaminované neurální buňky; a (ii) tvoří funkční komplex s COMs, které nemají homologických struktur u obratlovců. Tak, další analýzy jsou nutné k objasnění přesné role HANCs a jejich potenciál neurální buňky-jako funkce.