Abstrakt

přímý a vysoce specifické chemiluminiscenční enzyme-linked immunosorbent assay (CL-ELISA) metoda pro monitorování chloramfenikol (CAP) v kosmetice byl vyvinut. Anti-chloramfenikol protilátek (mAb), který přijala v této práci k přímé imunologické může vázat na SZP, konkrétně se zanedbatelnou cross-reaktivita (CR) (méně než 0,01%) s nejvíce CAP analogy, včetně strukturně příbuzných thiamfenikol (TAP) a florfenikol (FF). Limit detekce (LOD), měřený IC10, byl 0,0021 ng mL-1. Detekční rozsah (IC20-IC80)byl v rozmezí od 0,00979 do 0,12026 ng mL−1. Ve vzorcích kosmetiky s hroty se průměrná výtěžnost pohybovala od 82,7% do 99,6%, s intradenní a interdenní odchylkou menší než 9,8 a 8,2%. Navíc s pomocí anti-CAP mAb značeného HRP by metoda mohla být zpracována v režimu rychlé přímé imunoreakce. Tato metoda CL-ELISA by mohla být použita pro specifickou, rychlou, semikvantitativní a kvantitativní detekci CAP v kosmetice, což usnadňuje přesnou kontrolu kvality kontaminace CAP.

1. Úvod

Chloramfenikol (CAP) je členem amphenicol rodiny antibakteriální činidla, a byly vyráběny Venezuelskou streptococcus (struktura viz Obrázek 1) . Chloramfenikol se obvykle provádí jako širokospektrální antibiotikum s účinnou antimikrobiální aktivitou. Může být obvykle proti šíření různých grampozitivních a gramnegativních bakterií, včetně anaerobních organismů . Vzhledem k vysoké aktivitě, chloramfenikol má široké uplatnění v chovu hospodářských zvířat, aquiculture, a kosmetickém průmyslu pro prevenci a léčbu bakteriální infekce. V nedávných publikacích bylo hlášeno, že chloramfenikol se používá k léčbě epifolikulitidy, akné a dalších stavů kůže. Chloramfenikol byl také široce přijat v kosmetice jako antiseptikum k inhibici růstu mikroorganismů .

nedávné výzkumy však ukázaly, že amfenikolová antibiotika vykazovala potenciální nepříznivé účinky na lidské zdraví . Proto jsou aplikace chloramfenikolu zakázány v mnoha zemích, včetně členů EU, USA a Číny . Ačkoli tam jsou úřední předpisy pro tyto antibiotika, chloramfenikol je stále nelegálně přidán do kosmetiky, vzhledem k jeho nízké náklady a vynikající antibakteriální účinek. Za účelem zajištění bezpečnosti kosmetiky a udržení lidského zdraví je naléhavé vyvinout citlivé, spolehlivé a dostupné metody detekce chloramfenikolu na úrovních sledování ve vzorcích kosmetiky.

Tam byly četné analytické metody uvádí pro SZP a související antibiotika detekce, jako je vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) , plynová chromatografie (GC) a kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) . Tyto metody však vyžadují především drahé nástroje, komplikované postupy předúpravy a dobře vyškolené štáby a nebyly vhodné pro rychlé screening velkého počtu vzorků. Imunoanalýzy založené hlavně na specifickém rozpoznání protilátka-antigen byly přijaty pro vysoce výkonný a rychlý screening cílových analytů. Chemiluminiscenční substrát s vysoce citlivým charakterem by mohl být použit v přímé chemiluminiscenční enzymatické imunosorbentní analýze (Cl-ELISA). Ve srovnání s konvenčními kolorimetrickými protokoly by citlivost imunoanalýz mohla být zlepšena alespoň 2 až 3krát s chemiluminiscenčním substrátem.

Předchozí literatury o imunologické detekci CAP nelze rozlišit CAP od jeho analogy amphenicol rodiny (Obrázek 1), včetně thiamfenikol (TAP) a florfenikol (FF), protože vysoké-široké specifických protilátek . V těchto výzkumů, je obtížné určit, zda kontaminace čepice, jeho analogy, nebo součet z nich, když pozitivní výsledek. V tomto výzkumu jsme použili vysoce specifickou anti-CAP monoklonální protilátku (mAb), která se může vázat na specificitu CAP a zanedbatelné hodnoty CR pro většinu testovaných analogů. Na základě tohoto velmi mAb byla vyvinuta vysoce specifická a přímá metoda CL-ELISA pro stanovení stopových množství CAP v kosmetice. Tento vyvinutý protokol nepotřebuje komplexní nepřímou konjugační reakci se sekundární protilátkou značenou HRP. U chemiluminiscenčního substrátu by se citlivost mohla významně zlepšit (schematický diagram znázorněný na obrázku 2). Při použití anti-CAP mAb značeného HRP byl test proveden v režimu rychlé přímé imunoreakce bez komplexních imunoreakčních postupů. Tato metoda CL-ELISA může být použita pro specifickou, rychlou, semikvantitativní a kvantitativní detekci CAP v kosmetice a tato práce přispěje ke kontrole kvality a regulaci CAP.

2. Materiály a metody

2.1. Chemikálie a Činidla

Chloramfenikol (CAP), ciprofloxacin (CIP), florfenikol, (FF), penicilin (PEN), ractopaminu (RAC), salbutamol (SAL), solí (SUL), a thiamfenikol (TAP) standardy byly zakoupeny od Sigma Aldrich (99% čistoty, St. Louis, MO, USA). CAP-konjugovaný antigen a HRP značená CAP protilátka byly získány ze ZeYang Co. (Peking, Čína). Supersignální chemiluminiscenční substrátový roztok byl zakoupen od společnosti Thermo Fisher (USA). Systém syntézy Milli-Q byl získán z Millipore (Bedford, MA, USA) pro čištění vody. Další činidla (analytická třída) byla zakoupena od Beijing Reagent Corp. (Peking, Čína).

2.2. Zařízení a Přístroje

Partner bílé neprůhledné 96-polystyrenové mikrotitrační destičky (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) byly použity v této práci. Spectramax M5 microplate reader byl získán z Molecular Devices (CA, USA). Odstředivka MIKRO 22R byla získána z laboratoře Hettich (Tuttlingen, Německo).

2.3. Pufry a roztoky

pro tento vyvinutý test CL-ELISA byly připraveny různé pufry a roztoky pro imunotest.

fyziologický roztok fosfátového pufru (PBS, 0,01 M, pH 7,4): 8,0 g NaCl, 2,9 g NA2HPO4, 0,2 g KH2PO4 a 0,2 g KCL bylo rozpuštěno v 1 L deionizované vody.

blokující pufr (pH 7,4): 0,5% kaseinu v 0,01 M PBS.

potahový pufr (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3 a 2,93 g NaHCO3 byly rozpuštěny v 1 L deionizované vody.

pufr na ředění enzymů (pH 7.4): 5% fetální bovinní sérum v 0,01 M PBS.

mycí pufr (PBST): 0,01% Tween-20 v 0,01 M PBS.

2.4. Konkurenční Chemiluminiscenční ELISA (CL-ELISA) Řád

Partner bílé neprůhledné 96-polystyrenové mikrotitrační destičky byly přijaty pro imunologické reakce. 100 µL CAP-konjugovaný antigen byl rozpuštěn v uhličitanovém pufru na konečnou koncentraci v 0.00042 ng mL−1, který byl přidán a inkubovány při 4°C po dobu 20 h pro lakování. Po promytí promývacím pufrem třikrát, blokujícím pufru (150 µL na jamku) byl přidán do každé jamky a inkubuje se obsadit přebytek aktivních míst na 37°C po dobu 1,5 h. Potažené desky byly skladovány při 4°C před použitím.

Pro CAP analýzy, potažené mikrotitrační destičky byly stabilizovat při pokojové teplotě po dobu 30 min. Poté bylo do každé jamky postupně přidáno 30 µL zpracovaných vzorků nebo standardní CAP a 70 µL protilátky anti-CAP značené HRP (2,46 ng mL-1) zředěné enzymatickým ředicím pufrem. Destičky byly inkubovány při 37°C po dobu 30 minut pro přímou konkurenční reakci. Po umytí desky s promývacím pufrem pro pět krát, SuperSignal chemiluminescence roztoku substrátu (100 µL/jamku) byl přidán a intenzity chemiluminiscence každé jamky byla měřena pomocí SpectraMax M5 reader na mikrotitrační destičce.

2.5. Standardní křivka

pro vyhodnocení kalibračních křivek bylo testováno deset různých koncentrací. Nejvyšší koncentrace byla při 1000 ng mL-1 a následující koncentrace byly sériově zředěny jednou třetinou předchozí koncentrace. Každá koncentrace byla provedena třikrát podle protokolu CL-ELISA.

B / B0 je definován pro chemiluminiscenční poměr výsledků. Tady, B znamená chemiluminiscenční intenzitu různé standardní koncentrace CAP, a B0 znamená chemiluminiscenční intenzitu bez standardu CAP v každém testu.

Standardní křivky byly vyhodnoceny vynesením B/B0 v různých SZP standardní koncentrace a montážní data pro následující čtyři-parametr logistické rovnice pomocí Původu (verze 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA):V této rovnici, zkratka pro horní asymptotu (chemiluminiscence poměr B/B0 bez SZP standard). B je sklon křivky v inflexním bodě. C, představující 50% maximální absorbance, je hodnota X v inflexním bodě. A D je nižší asymptota (signál na pozadí).

2.6. Příprava vzorku pro analýzu cl-ELISA

vzorky kosmetiky (2,00 g ± 0,02 g) byly přesně zváženy a přeneseny do 50 mL polypropylenových odstředivkových zkumavek. Potom se přidá 20 mL PBS a vortexed po dobu 30 s, a pak ultra-sonikace po dobu 3 minut pro extrakci víčka. Každý vzorek byla centrifugována při 12000 g po dobu 10 min při 4°C a supernatant byl odebrán a filtrován přes 0,22 µm membránový. Třicet mikrolitrových alikvotů supernatantu každého vzorku bylo přidáno do potažené 96jamkové destičky pro analýzu podle vyvinutého postupu CL-ELISA.

2.7. Přesnost a přesnost

negativní vzorky kosmetiky primer lotion byly dříve potvrzeny analýzami UPLC-MS / ms. Pak byl každý vzorek špičatý standardem CAP ve třech různých koncentracích 5, 20 a 100 ng L-1. Analýza byla zpracována podle vyvinutého protokolu CL-ELISA s pěti replikacemi (N = 5). Koncentrace vzorků byly vypočteny podle kalibrační křivky, a správnost a přesnost byla hodnocena na základě výtěžnosti ze všech vzorků.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Specificita testu

specificita metody byla hodnocena hodnocením rozsahu zkřížené reaktivity (CR) se strukturně příbuznými sloučeninami CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL a TAP. Hodnoty CR byly vyhodnoceny pomocí následující rovnice:V této rovnici je IC50 poloviční maximální inhibiční koncentrace látky. Výsledky specifičnosti anti-CAP mAb byly uvedeny v tabulce 1. Z výsledků byly získány zanedbatelné hodnoty CR (méně než 0,01%) pro všechny analogy zkoumané v tomto výzkumu, včetně nejvíce strukturovaných TAP a FF. Lze konstatovat, že tento vyvinutý test CL-ELISA by mohl být použit pro specifickou detekci CAP.

3.2. Optimalizace postupu CL-ELISA

poměr antigenu k protilátce v kompetitivním reakčním systému významně ovlivňuje imunoreakci. V tomto protokolu CL-ELISA byl poměr antigenu k protilátce vyhodnocen a optimalizován. Poměr antigenu k protilátkám 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, a 30: 70 bylo vyšetřeno. Výsledky byly optimalizovány podle IC50 a RLUmax (maximální relativní světelné jednotky) a ukázaly se v tabulce 2. Hodnota IC50 se významně zvýšila se zvyšujícím se poměrem protilátek. Když byl poměr antigenu k protilátce 70: 30, byl získán nejcitlivější výsledek s nejnižší hodnotou IC50. Navíc vysoký podíl protilátek vedl k vysoké hodnotě Rlumaxu. Pro poměry testovaného antigenu a protilátky však byly všechny hodnoty RLU vhodné pro detekci CAP. Vzhledem k vysoké citlivosti chemiluminiscenčního substrátu nebyl zjevný rozdíl hodnoty Rlumaxu. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. Citlivost

IC50, LOD (měřeno IC10), a rozsah detekce (IC20−IC80) byly získány z esovitě kalibrační křivky pro vyhodnocení citlivosti navrhované CL-ELISA protokolu (Obrázek 3). V tomto výzkumu byla LOD 0,0021 ng mL-1, zatímco hodnota IC50 byla 0,016 ng mL-1 pro CAP. Detekční rozsah této metody byl 0,00979-0,12026 ng mL-1. Ve srovnání se zavedenými imunoanalýzami vykazovala tato metoda vyšší citlivost a nižší LOD pro CAP .

3.4. Přesnost a přesnost

pro přesnost a přesné vyšetřování byly nejprve vypočteny výtěžky CAP v obohacených vzorcích. A přesnost a přesnost byly vyhodnoceny s pěti replikuje každý na tři validační dny. Na tři opevněné úroveň 5, 20 a 100 ng L−1, průměrná výtěžnost pro SZP v obohacené primer krém kosmetika vzorků se pohybovala z 82,7% na 99.6%. Intradenní a interdenní variace byly menší než 9,8% a 8,2% (výsledky byly uvedeny v tabulce 3).

4. Závěry

v tomto výzkumu byla vyvinuta nová a vysoce citlivá metoda CL-ELISA pro detekci CAP v kosmetice. Mab použitý v testu vykazoval vysokou specificitu pro CAP se zanedbatelnými hodnotami CR vůči jeho analogům, zejména pro většinu TAP a FF souvisejících se strukturou. Na základě tohoto velmi mAb by navrhovaná metoda CL-ELISA mohla být použita pro detekci CAP specificky místo směsí CAP a jiných analogů. Toto je první zpráva CL-ELISA pro stanovení CAP v kosmetice. Metoda LOD byla 0,0021 ng mL-1, IC50 0,016 ng mL-1 a detekční rozsah byl 0,00979−0,12026 ng mL−1. Ve vzorcích kosmetiky s hroty se průměrná výtěžnost pohybovala od 82,7% do 99,6%, s intradenní a interdenní odchylkou menší než 9,8% a 8,2%. Test nabízí výhody vysoké specifičnosti, jednoduchosti, rychlých časů analýzy a efektivity nákladů. S ohledem na její citlivost a specifičnost, rozvinuté CL-ELISA metoda je lepší než většina hlášených imunotesty pro CAP detekce. Lze konstatovat, že tato vyvinutá metoda CL-ELISA by mohla být použita pro specifickou, rychlou, semikvantitativní a kvantitativní detekci CAP v kosmetice.

dostupnost dat

údaje použité na podporu zjištění této studie jsou k dispozici od příslušného autora na vyžádání.

Střet Zájmů

autoři prohlašují, že neexistují žádné střety zájmů týkající se zveřejnění této práce.

poděkování

děkujeme LetPub (www.letpub.com) za poskytnutí jazykové pomoci při přípravě tohoto rukopisu. Tato práce byla podpora Národní R&D Key Program z Číny (ne. 2017YFE0110800), Národní Přírodní Science Foundation Číny (ne. 31871718), a EU Horizont 2020 pro Výzkum a Inovace akce (ne. 727864-EU-Čína-Safe).