houba Candida guilliermondii je široce distribuován v přírodě, včetně lidské mikroflóry kůže a slizniční povrchy.22 ačkoli tento druh vykazuje sníženou virulenci ve srovnání s jinými druhy Candida, 3 v současné době je považován za vznikající patogen s velkým výskytem v Latinské Americe.18C. guilliermondii byla uznána jako etiologickým agens širokou škálu klinických infekcí, včetně šířeny ty, které jsou především u pacientů s oslabenou imunitou,22 a nozokomiální epidemie u chirurgických pacientů s intravaskulární zařízení.13 v Současné době, doporučené léčby invazivní kandidózy u pacientů s neutropenií zahrnuje kaspofungin (CFG) nebo mikafungin (MFG) jako první linie terapie, liposomální amfotericin B (JEHNĚČÍ) a anidulafungin (AFG), že alternativy, zatímco flukonazol (FLC) je doporučeno pouze v případě, citlivost na tento lék je potvrzena.23 Nicméně, několik studií ukázalo, že C. guilliermondii se sníženou citlivostí na FLC8,15,19, a terapeutické selhání spojené s izoláty s vysokou amfotericin B (AMB) minimální inhibiční koncentrace (Mic) byly hlášeny.9,12,24 i když téměř 90% izolátů ukazuje, echinokandiny Mikrofony stejnou nebo nižší, než klinické breakpointy (CBP) citlivost (2 µg/ml),17 podobná jako u jiných druhů Candida, jako je C. parapsilosis, některé izoláty C. guilliermondii show Mikrofony značně vysoká.8,15 dostupné údaje týkající se účinnosti AFG u invazivní kandidózy jsou omezené a potenciální úloha tohoto léčiva v klinické praxi je málo známa.23 v této souvislosti mohou studie na zvířatech hrát důležitou roli pro lepší pochopení korelace in vitro-in vivo.11 proto bylo naším hlavním cílem vyhodnotit in vitro a in vivo aktivity AFG proti různým izolátům C. guilliermondii, porovnáním výsledků s výsledky AMB a FLC.
materiály a metodyhoubové izoláty
čtyři klinické izoláty C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 a UTHSC 10-3207) byly použity v in vitro studii a dva z nich (UTHSC 11-685 a UTHSC 11-142) byly vybrány na myším modelu na základě jejich různých in vitro citlivostí. Izoláty byly identifikovány sekvenováním vnitřní transkribované distanční (ITS) oblasti a D1-D2 domén rRNA, porovnáním sekvencí s sekvencemi typového kmene tohoto druhu.
In vitro studie
in vitro citlivosti čtyři kmeny AMB, FLC a AFG byla hodnocena pomocí referenčního vývar microdilution metoda,6Candida parapsilosis ATCC 22019 a Candida krusei ATCC 6258 jsou zahrnuty kontroly kvality.
křivky Time-kill byly vyvinuty pro všechny kmeny podle předchozích studií.5,20 Stručně řečeno, byl připraven zásobní roztok každého antimykotika, AMB (Sigma–Aldrich Co., St. Louis, USA) a AFG (Pfizer Inc., Madrid, Španělsko) byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu a FLC (Pfizer Inc., Madrid, Španělsko) v destilované vodě. Dále, drog ředění byly připraveny v 9ml standardním RPMI 1640 médiu k získání koncentrace 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 a 32µg/ml každého léku. Izoláty byly subkulturovány při 35°C po dobu 24 hodin na destičkách bramborového dextrózového agaru (PDA). Kultury C. guilliermondii byly suspendovány ve sterilním fyziologickém roztoku a výsledná suspenze byla upravena na 5×106 jednotek tvořících kolonie (CFU)/ml haemocytometer počítá a podle sériového pokovování na PDA potvrdit životaschopnost. Ředění a ovládací prvky (bez drog) bylo naočkováno 1 ml houbové suspenze, což má za následek počáteční inokulum 5×105CFU/ml a inkubovány při 35°C. objem 100 ul z každé zkumavky bylo odebráno v 0, 2, 4, 6, 8, 24, a 48 hodin po očkování a naředěn v destilované vodě; 30 µl z nich byly kultivovány na PDA destičky a inkubovány při 35°C po dobu 48 hodin pro CFU/ml stanovení. Na CFU pokles o ≥99.9% nebo 3 log10 jednotky ve srovnání s výchozí inokulum bylo považováno za fungicidní, zatímco snížení
log10 jednotky, byl považován za fungistatické. Limit detekce byl 50CFU / ml. All time-kill curve studie byly provedeny v duplikátu.In vivo studie
Samec-1 myší (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Španělsko) s průměrnou hmotností 30g byly použity v experimentu. Myši byly umístěny ve standardních krabicích s volným přístupem k jídlu a vodě. Všechny postupy pro zvířata byly pod dohledem a schváleny Výborem pro dobré životní podmínky a etiku Universitat Rovira i Virgili Animal.
Myši byly poskytnuté neutropenických jeden den před infekcí tím, intraperitoneální (i.p.) injekce 200 mg/kg cyklofosfamidu (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Španělsko) a intravenózní (i.v.) injekce 5-fluorouracilu (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Španělsko) v dávce 150 mg / kg.10,14 den infekci byly myši vyzval jsem.v. s 1×108CFU/zvíře z každého ze dvou kmenů C. guilliermondii, UTHSC 11-685 a UTHSC 11-142, v 0,2 ml sterilního fyziologického roztoku do postranní ocasní žíly.3,4
skupiny osmi zvířat byly náhodně stanoveny pro každý kmen a léčivo. Skupiny byly léčeny následovně: amfotericin B deoxycholát (AMBd) (Xalabarder Lékárna, Barcelona, Španělsko) v dávce 0,8 mg/kg i.v. jednou denně (QD); lipozomální amfotericin B (JEHNĚČÍ) (Gilead Sciences S. a., Madrid, Španělsko) při 10 mg / kg i. v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Španělsko) v dávce 25 mg/kg perorálně (p. o.) sondou, dvakrát denně (BID); A AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Spojené království) v dávce 10 mg / kg tělesné hmotnosti / dávky i. p., QD. Všechna ošetření začala 24 hodin po výzvě a trvala 7 dní. Kontroly nebyly ošetřeny. Aby se zabránilo bakteriální infekce, všechny myši obdržel 5 mg/kg den ceftazidim subkutánně dnů od 1 do 7 po infekci. Myši byly denně kontrolovány a byly utraceny 8. den po infekci ANOXIÍ CO2. Účinnost každého léčiva byla hodnocena snížením tkáňové zátěže a histopatologickými studiemi. Ledviny byly asepticky odstraněny a jeden z nich byl zvážen a homogenizován ve 2 ml sterilního fyziologického roztoku. Sériová 10násobná ředění homogenátů byla nanesena na PDA a inkubována po dobu 48 hodin při 35°C pro výpočet CFU / g. Pro histopatologickou studii, zbývající ledvina byla stanovena s 10% pufrovaným formalínem, dehydratovaná, paraffin embedded, a nakrájené na 2 um sekcí, které byly obarveny hematoxylinem–eosinem (He) a pravidelné acid-Schiff (PAS) barvení na vyšetření pomocí světelné mikroskopie.
statistiky
počty kolonií z tkáně byly analyzovány pomocí Mann-Whitney U-testu pomocí Graph Pad Prism 4.0 pro Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Pokud byly hodnoty P nižší než 0,05, byly rozdíly považovány za statisticky významné.
Výsledkyin vitro studie
Mic AMB byly 0,25-1µg / ml, 0,06–0,25 µg/ml pro AFG a 0,5-1µg / ml pro FLC. Po ukončení citlivosti na AMB, FLC a AFG proti C. guilliermondii bylo 16 všech izolátů citlivých na tyto tři léky. Citlivost kmenů kontroly kvality byla v přijatých rozmezích.6
kinetika zabíjení AMB vykazovala rychlou fungicidní aktivitu, která se zvyšovala s koncentrací léčiva. V koncentracích ekvivalentních MIC vykazovalo toto léčivo fungicidní účinek proti třem ze čtyř testovaných izolátů (obr. 1). Tato činnost zahájena ihned po inokulaci v koncentraci vyšší než 1µg/ml, fungicidní endpoint být dosaženo po 4h na 32µg/ml. AFG při koncentracích nad 0,5 µg/ml vykazovala fungicidní aktivitu počínaje 4h inkubace. Fungicidního cílového parametru bylo dosaženo při 12-24h inkubace při 32 µg / ml (obr. 2). FLC vykazoval fungistatickou aktivitu proti všem čtyřem izolátům (obr. 3).
testy kinetiky zabíjení času AMB proti čtyřem kmenům C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg / ml, ( ▴ ) 0,12 µg / ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, (Δ) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, (Δ) 8 µg/ml, ( ♦ ) 32 µg/ml, ( ● ) kontrola. Přerušované čáry představují pokles CFU o 3log10 jednotek růstu ve srovnání s počátečním inokulem (fungicidní aktivita), tečkované čáry označují kvantifikační limit testu.
testy kinetiky zabíjení času AFG proti čtyřem kmenům C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg / ml, ( ▴ ) 0,12 µg / ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, (Δ) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, (Δ) 8 µg/ml, ( ♦ ) 32 µg/ml, ( ● ) kontrola. Přerušované čáry představují pokles CFU o 3 log10 jednotek růstu ve srovnání s počátečním inokulem (fungicidní aktivita), tečkované čáry označují kvantifikační limit testu.
testy kinetiky zabíjení času FLC proti čtyřem kmenům C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg / mL, ( ▴ ) 0,12 µg / ml, ( □ ) 0,5 µg / ml, ( ● ) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, (Δ)8 µg / ml, ( ♦ ) 32 µg/ ml, ( ● ) kontrola. Přerušované čáry představují pokles CFU o 3log10 jednotek růstu ve srovnání s počátečním inokulem (fungicidní aktivita), tečkované čáry označují kvantifikační limit testu.
In vivo studie
JEHNĚČÍ na 10mg/kg byl jediný lék, který je schopen snížit plísňové zátěže v ledvinách myší infikovaných každého ze dvou kmenů, snížení výrazně vyšší než u ostatních terapií (P≤0.04). AMBd a FLC byli schopni snížit tkáně zátěž u myší infikovaných kmenem, který ukázal nejnižší Mikrofony pro tyto dva léky, tj. 0,25 µg/ml AMB a 0,5 µg/ml pro FLC (P≤0.008). V případě AFG houbové snížení zatížení byl skromný a nižší, než pro AMBd, a to výrazně snižuje tkáně zátěž v ledvinách, pouze s ohledem na kontrolní skupinu pro kmen UTHSC 11-685 (P=0.002) (Obr. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 a FLC 50; cP0. 05 versus AFG 10 a FLC 50.
histologické studie ukázaly, fokální infiltrace houbových buněk v ledvinách neléčených zvířat a u myší léčených AMBd, FLC nebo AFG. Ledviny myší ošetřených jehněčím vykazovaly pouze mírnou houbovou invazi. Známky nekrózy, zánětlivé odpovědi nebo změny parenchymu nebyly pozorovány ani u kontrol ani u léčených zvířat (obr. 5).
Přítomnost houbových infiltrace (černá šipka) v ledvinách část ovládání myši infikované C. guilliermondii, na 8 dní po infekci (periodic acid Schiff barvení, zvětšení 1000×). Tyč=10 µm.
Diskuse
in vitro studie neprokázaly sníženou citlivostí C. guilliermondii izoláty FLC nebo AFG. Ve shodě s předchozí studií, čas-zabít křivky AMB ukázal závislá na koncentraci fungicidní aktivitu proti všem izolátů,4,5,7 a FLC ukázal fungistatický účinek bez ohledu na koncentraci testované.7 je známo, že AMBd vykazuje vyšší účinnost než jeho lipidic formulace, zejména v ledvinách, při podávání obou ve stejných dávkách.1 Nicméně farmakokinetické studie ukázaly, že po podání 0,75 mg/kg AMBd Cmax AMB dosaženo u myší sérum bylo 0,30 µg/ml.25 amb MIC jednoho ze dvou testovaných izolátů je však vyšší než tato hodnota; proto jsme použili vysokou dávku jehněčího masa, abychom dosáhli vyšších koncentrací.1 podávání jehněčího masa v dávce 10 mg / kg bylo skutečně účinné při snižování houbové zátěže obou kmenů. Tato skutečnost korelovala s křivkami zabíjení, kde AMB dosáhl své fungicidní aktivity proti dvěma izolátům testovaným in vivo, v koncentracích 1 µg / ml. Pokud je nám známo, toto je první studie, která se snažila navázat vztah mezi zabíjení kinetika a in vivo experimentálních účinnost AFG a FLC proti klinických izolátů C. guilliermondii. Existuje pouze předchozí studie o echinokandinech, zejména o kaspofunginu (CFG) u diseminované infekce C. guilliermondii. CFG na 1 mg/kg byla účinná ve snížení ledvin, plísňové zátěže u myší infikovaných jeden kmen C. guilliermondii s MIC 8µg/ml, zatímco zabíjení času se ukázalo, že nikdo fungicidní aktivity bylo dosaženo v koncentraci 64µg/ml.4 Naopak, naše studie ukázala na koncentraci závislé činnosti AFG, který v 32µg/ml působící fungicidní aktivitu, jak již bylo dříve oznámeno,17 na 24 hodin a na 8µg/ml. Předchozí studie uváděly koncentrace AFG v séru a ledvinách přibližně 13 µg / ml po 7 dnech léčby v dávkách 10 mg / kg.21, AFG podařilo snížit jen mírně plísňové zátěže v ledvinách neutropenických myší infikovaných s jedním ze dvou testovaných kmenů, což se nezdá být v souvislosti s nízkým AFG Mikrofony rozdíl mezi oběma kmeny testovány (1 ředění), což naznačuje, že reakce na AFG léčba je napětí závislé. Podobně, FLC byl také schopen jen mírně snížit houbovou zátěž v ledvinách myší napadených jedním ze dvou kmenů navzdory podané dávce, která dosahuje sérových koncentrací nad mic, 2 což také nebylo překvapivé kvůli jeho fungistatické aktivitě.
závěrem naše studie ukázala vyšší aktivitu a účinnost LAMB proti dvěma kmenům C. guilliermondii, na rozdíl od špatného účinku FLC a AFG. Nicméně, další studie s více izolátů C. guilliermondii představuje širší škálu AFG Mikrofony by měly být prováděny posoudit, zda nějaký vztah mezi hodnotami MIC a AFG účinnosti existuje.
střet zájmů
Žádný k vyhlášení.
