CPZ zmírňuje kolitida nezávisle na TRPV1
Na výzvu mechanismus, který CPZ klystýr zmírnit experimentální kolitidy, jsme vyvolané dextran sulfát sodný (DSS) kolitidy u wild-type (WT) a TRPV1-deficientní myši (v každé skupině n = 8). I když existují protichůdné zprávy, TRPV1-deficitní myší vyvinuté DSS kolitida a hubnutí ve stejné míře jako congenic WT myší v naší laboratoři, která je v souladu s našimi výsledky z modelu TNBS kolitida, že jsme měli dříve published7,8,9,10,11,12. Pro ošetření klystýru CPZ jsme použili stejnou koncentraci CPZ (531 µM), o které bylo dříve hlášeno, že zmírňuje DSS (5%) kolitidu u potkanů8. Průběh kolitidy byl denně sledován měřením tělesné hmotnosti a endoskopií. Dvakrát denně aplikace CPZ (531 µM) klystýr oslabené DSS kolitida ve stejné míře v obou WT a TRPV1−/− myší, což se projevilo tím, že lepší endoskopické skóre a snížení ztráty tělesné hmotnosti (Obr. 1A–C). H&E skvrny od distální tlustého střeva, na konci 7 den DSS experiment odhalil, zničil slizniční tkáň architektury s četnými infiltrující imunitní buňky v dvojtečky kontrol. To bylo v ostrém kontrastu se široce neporušené sliznice a absence významných imunitních buněk infiltrace v dvojtečky z CPZ léčených myší obou genotypů (Obr. 1D). V souladu s těmito nálezy bylo histologické skóre silně sníženo u myší léčených CPZ obou genotypů (obr. 1E).
CPZ aktivuje TRPA1
in vivo pozorování, že CPZ klystýr účinně inhibována kolitida v TRPV1 null mutantních myší uložené na otázku, na TRPV1-nezávislé neuronální účinky CPZ. Od TRPA1 bylo prokázáno, že být důležité v různých modelů zánětu včetně colitis6,12,14, testovali jsme, zda CPZ působí na TRPA1.
CPZ-indukované iontové proudy přes hTRPA1
Patch clamp experimenty byly prováděny v napětí svorky režimu na HEK293t buněk exprimujících rekombinantní hTRPA1 (hTRPA1-HEK293t buněk). V hospodářství potenciálu -60 mV, CPZ (10 µM) indukované vnitřní proud, který byl téměř kompletně inhibována (93% inhibice, n = 5) selektivní antagonista TRPA1 HC-030031 (HC, 10 µM) (Obr. 2A). Ve všech buňkách, v nichž CPZ-indukované vnitřní proud byl zaznamenán, karvakrol (100 µM) zavedený agonista TRPA1, také vyvolal velký vnitřní proudy ve stejné držení potenciál, což dokazuje funkční vyjádření hTRPA1. Tyto články hTRPA1-HEK293 byly také podrobeny napěťovým rampám od -100 do + 100 mV o délce 400 ms každé 4 s (obr. 2B). Vztah proud-napětí vyvolaný CPZ vykazoval mírně vnější rektifikaci a reverzní potenciál blízký 0 mV (obr. 2C). Proudy vyvolané CPZ (10 µM) byly inhibovány HC (10 µM). Efekt byl výraznější u negativních potenciálů (89% ± 5% inhibice při -80 mV, průměr ± SD, n = 7), než na pozitivní potenciály (80% ± 9% inhibice na +80 mV).
Capsazepine (CPZ) aktivuje heterologously vyjádřil lidský TRPA1.
(a) CPZ (10 µM) evokuje proudy zprostředkované hTRPA1 v transfekovaných buňkách HEK293t. Všimněte si úplné inhibice proudů selektivním antagonistou TRPA1 HC030031 (HC, 10 µM). (B) Reprezentativní rampa proudy vyvolané v hTRPA1-transfektovaly HEK293 buněk o 400 ms napětí rampy od -100 do +100 mV aplikuje se každé 4 s. Každý symbol představuje aktuální amplitudy na -80 mV (čtverce) a +80 mV (kruhy). Proud indukovaný CPZ byl silně inhibován HC. (C) Příklady jednotlivých ramp proudy odpovídající naplněné symboly a čísla v B. (D) CPZ (50 µM, 10 s) vyvolává velké vápníku přechodové jevy v hTRPA1-HEK293 buněk (černá stopa, n = 128). HC (20 µM; červená stopa, n = 209) a A-967079 (10 µM; modrá stopa, n = 140) zcela inhibovaly odpověď na CPZ. Data představují prostředky (přímky) ± SEMs (tečkované čáry). (E) aktivace hTRPA1 pomocí CPZ (10 µM) závisí na koncentraci. Černá stopa: buňky hTRPA1-HEK293 (n = 52) byly stimulovány zvýšením koncentrací CPZ po dobu 20 s ve 3 min intervalech. Šedá stopa: nepřenesené buňky HEK293 (n = 101) byly podrobeny stejným koncentracím CPZ. (F) aktivace hTRPA1 CPZ (1 µM) zahrnuje tři kritické cysteiny v n-konci kanálu. Černá stopa: odpovědi n = 123 HEK293 buněk exprimujících WT hTRPA1, aby po sobě následujících žádostí, z CPZ (1 µM), karvakrol (100 µM) a allylisothiokyanátu (AITC, 50 µM). Šedá stopa: odpověď n = 165 hek293 buněk exprimujících mutant hTRPA1-3C na stejnou sekvenci podnětů. Všimněte si podstatného snížení odpovědi mutantu hTRPA1-3C na CPZ a AITC, ale ne na carvacrol. G) rozdíl v citlivosti CPZ mezi genotypy byl zrušen při 100 µM CPZ. (H) aktivaci hTRPA1 pomocí CPZ lze zabránit vychytávačem N-acetylcysteinu (NAC). Černá stopa: v kontrolních experimentech byly buňky hTRPA1-HEK293 napadeny CPZ (50 µM; 60 s; n = 74). Červená stopa: v samostatném experimentu byly buňky nejprve vystaveny po dobu 30 s, aby kombinace CPZ (50 µM) a NAC (15 mM), okamžitě následuje CPZ sám za dalších 30 s (n = 83).
CPZ-indukované vápník-příliv přes hTRPA1
Selektivní působení CPZ na TRPA1 bylo potvrzeno tím, že zaměstná vápníku microfluorimetry technika. buňky hTRPA1-HEK293 byly stimulovány dvěma aplikacemi CPZ (50 µM)po dobu 10 s v 5minutových intervalech (obr. 2D). Selektivní antagonisté HC (20 µM) a A-967079 (10 µM) byli aplikováni po dobu 1 minuty před a během první výzvy CPZ. Reakce CPZ byla oběma antagonisty zcela zrušena. Stojí za zmínku, že odstranění HC vedlo k vápníku příliv, pravděpodobně v důsledku zbytkové CPZ akce, zatímco tento off efekt byl přítomen v případě-967079, které mohou oddělit pomaleji (Obr. 2D). Poté jsme analyzovali koncentrační závislost účinků CPZ. Zvyšující se koncentrace CPZ (100 nM, 500 nM, 5 µM a 50 µM) byly aplikovány na buňky hTRPA1-HEK293 po dobu 20 S v 3minutových intervalech. Počínaje 100 nM vyvolaly všechny koncentrace CPZ přechodné stavy vápníku se stále většími amplitudami (obr. 2E). Karvakrol (100 µM) byl aplikován na konci experimentu, aby ovládání pro funkční TRPA1 výraz, ale karvakrol reakce po 50 µM CPZ byl nápadně malý, což naznačuje, že cross-desenzibilizace. Nepřenesené buňky HEK293 byly podrobeny stejným aplikacím CPZ a pouze nejvyšší testovaná koncentrace (50 µM) vyvolala minimální zvýšení vápníku. Očekávali jsme, že CPZ zapojí tři kritické zbytky cysteinu do n-koncové domény kanálu, protože se jedná o elektrofilní sloučeninu. HEK293 buněk exprimujících WT hTRPA1 a buněk exprimujících triple cystein mutant hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) byly podrobeny CPZ aplikace (1 µM, 20 s), následovaný non-elektrofilní agonista karvakrol (100 µM, 20 s) a vysoce elektrofilní AITC (50 µM, 30 s). Ionomycin byl aplikován na konci experimentu jako pozitivní kontrola. Amplituda vápníku přechodné, vyvolané 1 µM CPZ byla podstatně snížena (>80%) v buňkách exprimujících hTRPA1-3C v porovnání s buněk exprimujících WT hTRPA1 (Obr. 2F), zatímco rozdíl v citlivosti CPZ mezi genotypy byl zrušen při koncentraci 100 µM CPZ (obr. 2G). Odpověď aitc byla snížena v mutantních buňkách, zatímco karvakrol evokoval velké přechodné ionty vápníku u mutantů WT i 3C. Dohromady tyto buněčné odpovědi naznačují, že relativně vysoká účinnost CPZ závisí na třech kritických cysteinech. Pokud je však koncentrace CPZ 100krát vyšší, aktivací hTRPA1 přebírají další vazebná místa. Tato vysoká koncentrace lipofilního CPZ by také mohla interagovat s buněčnou lipidovou membránou, nepřímo aktivující TRPA1, jak bylo dříve ukázáno pro lipidovou složku lipopolysacharidů16. Navíc, v přítomnosti elektrofilem scavenger N-acetyl cystein (NAC) při saturující koncentraci (15 mM) 50 µM CPZ byl schopen vyvolat žádnou reakci. Po odstranění NAC vyvolalo CPZ velké přechodné stavy vápníku v buňkách Htrpa1-transfekovaných hek293t (obr. 2H), což potvrzuje, že CPZ působí jako elektrofilní agonista pro hTRPA1.
CPZ aktivuje subpopulace AITC-citlivé dorsal root ganglion (DRG) neurony
DRG neurony byly udržovány v primární kultuře a vyšetřován vápníku microfluorimetry. Buňky byly stimulovány CPZ (50 µM, 20 s), následuje AITC (100 µM, 30 s), kapsaicin (CAP, 1 µM, 10 s) a KCl (60 mM, 30 s). Obrázek 3A ilustruje příklady neuronů DRG reagujících na všechny tyto čtyři podněty. Typická frakce neuronů DRG byla aktivována AITC (301 z 906 neuronů, 33%, N = 8 myší) indikující funkční expresi TRPA1. Subpopulace těchto neuronů citlivých na aitc byla také aktivována CPZ (185 z 301 neuronů, 61%). Citlivost na CPZ byla téměř úplně omezena na neurony reagující na aitc. Z celkem 200 neuronů citlivých na CPZ bylo 185 (93%) také aktivováno aitc, což naznačuje silnou shodu citlivosti na CPZ a AITC (obr. 3). Stejně jako v případě hTRPA1-vyjádření HEK293 buněk, vápník přechodové jevy vyvolané CPZ v DRG neuronech byla závislá na koncentraci s EC50 hodnota se odhaduje na 30 µM CPZ a malé AITC odpověď po 100 µM CPZ znovu navrhl, cross-desenzibilizace (Obr. 3B,C). Obrázek 3D ukazuje překrytí CPZ, ČEPICI a AITC-schopnost reagovat ve WT DRG neuronů v daných koncentracích: 14% DRG neuronů reagovalo na AITC, ale ne na CAP (125/906), 16% odpovědělo na ČEPICI, ale ne na AITC, vzhledem k tomu, že CPZ vyvolané vápníku přechodové jevy v 78% neuronů, které reagovaly jak na AITC a CAP (137 176). Pro prokázání specifičnosti pozorovaných účinků byly neurony TRPV1−/− a TRPA1−/− DRG vystaveny výše uvedenému protokolu. Asi 90% TRPV1-nedostatečné DRG neurony, které byly AITC-citlivé také reagoval na CPZ (509/572 buněk), zatímco žádný z 448 TRPA1-nedostatečné DRG neurony testovány ukázal, vápník příliv v reakci na CPZ (100 µM), jak dokládá reprezentativní příklady na Obr. 3E, F.
Capsazepine (CPZ) aktivuje myším TRPA1 v dorsal root ganglion neurons.
(a) CPZ (50 µM) aktivuje subpopulaci neuronů myšího dorzálního kořenového ganglionu (DRG) citlivých na aitc (100 µM). Individuální odpovědi ze tří různých neuronů DRG citlivých na AITC a kapsaicin (CAP, 1 µM), které byly aktivovány CPZ. CPZ byl aplikován po dobu 20 s, AITC po dobu 30 s a CAP po dobu 10 s v intervalech 4 min umožňující zotavení. KCl (60 mM) byl aplikován na konci experimentu k zajištění životaschopnosti kultivovaných neuronů. (B) Průměrná odpověď N = 135 neuronů citlivých na aitc na tři různé koncentrace CPZ (25, 50, 100 µM, každá po 20 s). Všimněte si závislosti na koncentraci amplitudy Ca2+ přechodů. Přímé stopy představují střední a tečkované stopy představují SEMs. (C) zvýšení I indukované CPZ v neuronech DRG citlivých na AITC se normalizovalo na depolarizační stimul s KCl (60 mM). EC50 ∼30 µM byl vypočítán přizpůsobením se funkci reakce na dávku. Data jsou reprezentativní pro dvě sady experimentů a ukazují prostředky ± SEM; pro CPZ 1, 10, 25 µM: n = 169, pro CPZ 25, 50, 100 µM: n = 138. D) ilustrující populace neuronů DRG citlivých na CPZ, AITC a CAP a jejich překrývání. V celkem 906 zobrazen neuronů (vybraných podle jejich reakce na KCl), 200 (22%) byly aktivovány CPZ (50 µM), 301 (33%) AITC (100 µM) a 323 (36%) ČEPICE (1 µM) (podrobná analýza frakce, SI Obrázek Legenda 3). (E) CPZ (100 µM, 20 s) aktivuje neurony DRG citlivé na AITC (100 µM, 20 s) od myší s deficitem TRPV1. Individuální odpovědi z různých neuronů citlivých na AITC, které byly aktivovány CPZ. Přibližně 90% (509/572 buněk) neuronů DRG s deficitem TRPV1, které byly citlivé na AITC, reagovalo na CPZ. CAP (1 µM, 10 s) neindukoval Ca2 + transienty v TRPV1 – / – neuronech. (F) nedostatek CPZ (100 µM) indukovaného přílivu Ca2+ v neuronech DRG s deficitem TRPA1. Individuální odpovědi z různých neuronů DRG citlivých na CAP (1 µM) (ze 448 testovaných neuronů), které nebyly aktivovány CPZ ani AITC (10 µM).
Systémové desenzibilizace prostřednictvím TRPA1 zmírňuje bolest
Poté, co jsme zjistili, že CPZ je silný agonista TRPA1, pochopili jsme, proč první CPZ klystýr (dvakrát denně), byly zřejmě bolestné ve WT myší. Pak jsme se kvantifikovat CPZ (531 µM) klystýr-indukované nocifensive chování u zdravých zvířat (každé n = 6) počítání svíjel reakce a nahrávání visceromotorické reflexní odpovědi (VMRs) přes integrované elektromyografie (EMG) svalové stěny břišní (Obr. 4A,B). V průběhu opakování léčby CPZ dvakrát denně jsme poznamenali, že vyřazování TRPA1 nevykazovalo chování související s bolestí. Kromě toho, WT myší, představila progresivní pokles zpočátku silná bolest reakce s prudkým poklesem kolem 3. den, což vedlo k nakonec úplné znecitlivění v obou nocifensive parametry. Tato ztráta tlustého střeva vnímání bolesti v jinak normálních myší zvýšila očekávání, že klystýr by dodali CPZ farmakodynamické množství dostatečné k vyvolání systémové hypoalgesia. Pro testování této hypotézy jsme použili test očního otření pomocí AITC (100 µM)a CAP (1 mM) (obr. 4c,D) (n = 6). Oba testy prokázaly zřetelný útlum počtu očního očištění u myší WT, které byly léčeny klystýry CPZ (do 12-16 hodin před testem). Tyto účinky jsou pravděpodobně zprostředkovány TRPA1 desenzibilizace, spíše než TRPV1 blok, protože TRPV1-deficientní myši byly necitlivé na hořčičný olej (AITC, 100 µM) nakapání do oka ve stejné míře jako WT myší (Obr. 4C). Naopak, klystýry CPZ byly neúčinné u myší TRPA1 -/ -, když byly tyto myši napadeny instilací čepice do oka (obr. 4D).
Capsazepine klystýr znecitlivění místní a vzdálené odpovědi bolesti.
(a) akutní svíjivé reakce v reakci na klystýry CPZ (531 µM) během prvních 5 minut po aplikaci. Opakované klystýry CPZ (dvakrát denně) vedly k postupnému poklesu svíjejících se odpovědí. Dramatické snížení kroku bylo pozorováno po 5 klystýrech u myší WT. Naopak, TRPA1−/− myší léčených s CPZ (531 µM) nebo WT myší léčených vozidla (PBS) klystýr zobrazí pouze několik svíjející se, že došlo během prvních 30 s (každé n = 6). (B) Visceromotorické odpovědi (VMRs) na klystýry CPZ. CPZ klystýry dvakrát denně vedly k kontinuálnímu poklesu VMRs u WT myší, podobně jako průběh svíjejících se reakcí. VMR v reakci na vehikulum se významně nelišily od těch, které se týkaly klystýrů CPZ u TRPA1−/− (oba n = 6). (A,B) skupina WT CPZ ve srovnání se skupinou vozidel. (C) opakované klystýry CPZ zmírňují chování otírání očí na AITC (100 µM). Oba WT a TRPV1−/− myší léčených s CPZ klystýry ukázaly hluboké snížení eye-wipe počítá ve srovnání s vozidla (oba n = 6). Kontroly byly myši WT bez klystýrů, které dostávaly kapky vehikula (PBS) do oka. (D) klystýry CPZ zmírňují chování očního stírání na čepici (1 mM). WT myší léčených vozidla a TRPA1−/− myší léčených s CPZ klystýr dvakrát denně po dobu 7 d ukázala řadu eye-wipe reakce na CAP nakapání do oka, testováno 12 h po poslední CPZ klystýr (oba n = 6). Myši WT léčené klystýry CPZ vykazovaly výrazné snížení počtu očních oček. (E) Tepelné a (F) mechanické odstoupení prahové hodnoty obou hindpaws během ústní CPZ (531 µM) nebo AITC (500 µM) léky prostřednictvím pitné vody. (E) CPZ a AITC přes 10 d ve srovnání s vozidla-skupina léčená vyvolané progresivní nárůst během 3-5 d v odstoupení latence na sálavé teplo stimulace, která normalizuje do 2 týdnů wash-out (každý n = 6). (F) Mechanické prahové hodnoty pro stimulaci elektrodynamická von Freyova vlákna ukázal, žádný systematický trend v obou sloučenin (každá n = 6). Všechna opakovaná opatření ANOVA a Dunnett post-test, s výjimkou (C,D) Mann Whitney U-test.
Vzhledem k tomu, opakované klystýry jsou nepříjemné podání, které jsme testovali pro případné anti-nociceptivní účinek perorální CPZ (531 µM) v pitné vodě. Pitný režim po dobu 10 dnů byl dobře snášen bez zjevných nežádoucích účinků. V průběhu kontinuálního perorálního podávání CPZ se latence stažení tlapky na stimulaci sálavým teplem (Hargreavesova metoda) postupně zvyšovala u obou zadních tlap (obr. 4E). Doba tolerance byla přibližně zdvojnásobena v den 7 a zůstala významně zvýšena od dne 2 do dne 10. Po 2 týdnech zotavení čistou pitnou vodou se abstinenční latence vrátily na výchozí úroveň. Mechanická citlivost na stimulaci lineárně rostoucí silou elektrodynamického von Freyova vlákna nebyla významně ovlivněna během deseti dnů pití CPZ(obr. 4F). Vyvstala otázka, zda tepelná a chemická hypoalgezie představovala třídní účinek desenzibilizujících TRPA1 agonistů nebo zda byla specifická pro CPZ. Proto jsme podávali aitc v podobné a dobře snášené koncentraci (500 µM) pitnou vodou. Stejný režim dávkování pro AITC, jak je popsáno na CPZ za následek postupné zvyšování tlapku-odstoupení latence sálavé teplo stimulace, který byl výrazně menší než ten, vyvolané CPZ (Obr. 4E). Mechanická odezva se v pitném režimu AITC nezměnila (obr. 4F).
CPZ způsobuje trvalé znecitlivění z TRPA1/TRPV1 vyjádření peptidergic smyslové neurony
pak se zeptal na otázku, zda desenzibilizace celých zvířat CPZ mohl být reprodukován na buněčné úrovni. Za tímto účelem jsme provedli vápník-zobrazovací experimenty s izolovanými DRG neurony, které byly získány z kontrolních myší a od zvířat léčených po dobu 7 dní dvakrát denně s CPZ klystýr. Tyto neurony byly nutně udržovány v kultuře po dobu 16 až 24 hodin v přítomnosti NGF. Celkem 399 neuronech z kontrolních myší a 584 neurony z klystýr léčených myší bylo naloženo s Fura-2 a vápníku přechodové jevy vyvolané AITC, karvakrol, ČEPICI a KCl-bohatý řešení byly zaznamenány. Odpovědi na tyto agonisty TRPA1 (AITC a carvacrol) a TRPV1 (CAP)se u neuronů DRG významně nelišily od kontrolních zvířat a zvířat léčených klystýrem (obr. S1). Avšak exprese TRPA1 mRNA (qPCR)byla asi dvakrát upregulována v lumbosakrálním DRG připraveném bezprostředně po konečném klystýru CPZ (obr. S2) vzhledem k tomu, že po uplynutí 24 hodin in vivo po konečném klystýru nebyla zjištěna žádná změna exprese TRPA1. MRNA TRPV1 se za obou okolností nezměnila. Proto došlo k transkripční upregulaci exprese genu TRPA1 v důsledku vícenásobných klystýrů CPZ, ale byla rychle obrácena, když byla dodávka CPZ přerušena. Podle DRG kultivace podmínky, stejné epigenetické zvrat měl pravděpodobně proběhlo a všechny zbytkové CPZ byl pravděpodobně prát-out, tak, že žádné zbytkové desenzibilizace může být ve skutečnosti očekává. Jako buněčné modely neodráží finiši CPZ-vyvolané znecitlivění celého zvířata in vivo, hledali jsme další silný indikátor překvapující systémový účinek. Většina nociceptivních neuronů je peptidergic, vyjadřující převážně kalcitonin gene-related peptid (CGRP) a substance P (SP)15,17. Na depolarizace, jako KCl a příliv vápníku v důsledku aktivace napěťově řízených kalciových kanálů, tyto neuropeptidy jsou uvolněny z nervových vláken v kvazi-eferentní funkce (neurogenní zánět). Na druhou stranu, aktivované TRP kanály jsou velmi dobré vápníku vodiče samy o sobě a nevyžadují podporu nějaké napěťově řízených sodíkových nebo vápníkových kanálů s cílem vyvolat vezikulární exocytóze CGRP18. Stimulované uvolňování CGRP tak může sloužit jako index (peptidergické) nociceptorové aktivace. Ze stejného důvodu mají vazoaktivní neuropeptidy různé účinky na zánětlivý proces sám o sobě a bylo prokázáno, že vyčerpání nebo desenzibilizace populace peptidergických senzorických neuronů tlumí kolitidu19,20,21. K určení, zda CPZ (531 µM) klystýr znecitlivění prostřednictvím TRPA1, lokálně a systémově, jsme použili izolované myš tlustého střeva a kožní přípravky. Dvojtečky zdravých myší c57bl / 6 (n = 8) byly vystaveny CPZ (100 µM), což vyvolalo masivní uvolňování CGRP (obr. 5); následné aplikace AITC (100 µM) 5 min nebo 15 min po CPZ (obr. 5A, B)již nemohlo indukovat uvolňování CGRP, což naznačuje hlubokou akutní funkční zkříženou desenzibilizaci na agonistu TRPA1. Tento účinek nemůže být způsoben deplecí, protože následná odpověď KCl (60 mM) byla normální. Dvojtečky z myší, které byly opakovaně léčeny klystýry CPZ (531 µM) in vivo, dvakrát denně po dobu 7 d, byly izolovány a testovány 12-16 hodin po posledním klystýru. CPZ (100 µM) ani AITC (100 µM) v tomto stavu neindukovaly žádné uvolnění CGRP (obr. 5C, D); zejména uvolňování CGRP vyvolané CAP (30 nM)bylo silně sníženo, ale nebylo zrušeno (obr. 5E). V kontrastu, KCl (60 mM)-vyvolaná CGRP vydání nekonkrétní depolarizace byl nejen nesnížené ale ve skutečnosti lepší, po CPZ klystýr. To naznačovalo, že vlákna tlustého střeva nebyla vyčerpána CGRP, ale spíše přeplněna, ale v podstatě trvale znecitlivěna na chemickou aktivaci prostřednictvím TRPA1 a TRPV1 (n = 6). Konečně, také přípravu kůže, izolované 12-16 h po poslední CPZ klystýr, ukázal, že AITC (100 µM) a VÍČKO (1 µM) indukované uvolnění CGRP byla silně snížena v souladu s tělem-široký desenzibilizace pozorován v behaviorální testy (Obr. 5F, G, viz obr. 4A-F) (n = 6).
Místní a systémové desenzibilizace z peptidergic senzorické nervy tím, capsazepine (CPZ) indikováno změněné vydání kalcitonin gene-related peptid (CGRP).
(A) Akutní CGRP propuštění z izolovaných tlustého střeva přípravky z WT myši vyvolané CPZ (100 µM); následné hořčice olej (AITC, 100 µM) expozice nepodaří vyvolat uvolnění CGRP, zatímco nespecifické depolarizace KCl (60 mM) je účinný jako normální. Data jsou prostředky + SEMs (n = 8). (B–D) CPZ (100 µM)- a AITC (100 µM) indukované střevní CGRP vydání byl zrušen v myší předléčených s dvakrát denně CPZ klystýr pro 7 d až den před vydáním experiment, vzhledem k tomu, že SZP (1 µM) indukované střevní CGRP-vydání byla silně snížena, ale ne zrušen v těchto myší v porovnání s kontrolami. (**P < 0.01, ***P < 0.001, Mann Whitney U-test, každý n = 6). (E) podobně bylo aitc (100 µM) indukované uvolňování CGRP zrušeno v izolovaných kožních přípravcích z zadních tlap myší předem ošetřených klystýry CPZ. (F) naproti tomu uvolňování CGRP vyvolané CAP (1 µM) bylo silně sníženo z kůže těchto myší ve srovnání s kontrolami. (**P < 0.01, ***P < 0.001, Mann Whitney U-test, každý n = 6). Všimněte si, že všechny KCl (60 mM) odpovědi následující znecitlivěné CPZ a AITC odpovědi byly normální (B,C,E), vzhledem k tomu, KCl odpovědi neúplně znecitlivěné CAP-stimulovány, neuron populace (D,F) byly mnohem menší, stejně jako ve všech kontrolních experimentů, což naznačuje, CGRP obchod vyčerpání, které je účinně zabráněno desenzibilizace z CPZ/AITC citlivé subpopulace neuronů.
