Mrkev (Daucus carota) je zimní ostřílený dvouletá rostlina, která se pěstuje pro své jedlé kořen. To je jeden z nejvíce spotřebovaného a vyrobeného zeleniny, protože jeho dietní rozmanitost v barvě, chuti, vlákninu a vitamin A, stejně jako jeho spotřeba jak v syrové a vařené formulář. Více než 20 milionů tun se ročně vyrobí pro lidskou spotřebu.

postupy tkáňové kultury byly velmi populární při klonování rostlin. První studie kultury mrkvové tkáně byla hlášena v roce 1939 Gautheretem a Nobecourtem. Steward a kol. a Reinert hlásil první studii „embryogeneze mrkve“; pokusili se pěstovat kořeny pomocí buněčné suspenze a kalusových kultur.

somatická embryogeneze je účinná metoda pro pochopení a zkoumání biochemických, fyziologických a genetických aspektů kultury rostlinných buněk.

mnoho studií o kultuře mrkvové tkáně vedlo k vývoji jednoduché metody embryogeneze v mrkvi. Podle metody může být růst mrkvových kultur indukován pouhým odstraněním hormonu 2,4-D z buněčných suspenzních kultur. Nyní se mrkev často používá jako experimentální model pro analýzu somatické embryogeneze v různých laboratořích po celém světě.

Materiál a Vybavení Potřebné pro Založení Kultury

Sterilizovaných Materiálů

• 5 Drobivý kultury kalus mrkve, neznečištěné, a udržována na 25 ℃.
• 5 erlenmeyerových lahví (250 ml), obsahující kultivační médium s 5 x 10-8 g / ml 2, 4-D.
• 5 odměrných lahví (100 ml) s víčky fólie.
• 2 špachtle.
• 25 listů hliníkové fólie (100 x 100 mm).
• 2 kusy nylonových nebo nerezových sítů s pórovitostí 250 µm, které lze vložit do otvoru měřicích válců.
• 5 Petriho misky.

Non-sterilizované materiály

• Vodotěsné označení pero
• Rotační třepačce
• hořák
• 1 Erlenmeyerovy baňky (150 ml) obsahující 95 % ethanol
• Parafilm

Postup pro Zahájení a Vytvoření Kultury

1. Vzít trubky kalusu kultury, sterilní ústa všech 5 trubek a přenos mozol na Petriho misky zvlášť (5 kalusů v 5 Petriho misek).
2. vezměte 250 ml kanonické baňky obsahující kultivační médium a 2, 4-D.
3. přeneste všech 5 calli z Petriho misky na 5 kanonických baněk, Samostatně.
4. plamen / sterilní ústa baněk a zakryjte je víčkem. Zajistěte uzávěr pomocí parafilmu.
5. umístěte všechny baňky obsahující kulturu na rotační třepací stroj v tmavé nebo nízké intenzitě světla při 25 ℃.
6. po 7 dnech přeneste baňky z třepačky do sterilní místnosti.
7. odstraňte parafilm a fóliový uzávěr z každé baňky a plamen/sterilní Ústí baňky.
8. přeneste suspenzi každé baňky do sterilního 100 ml válce odděleně průchodem sítem.
9. nechte obsah usadit po dobu 10 minut a potom supernatant zlikvidujte.
10. přeneste zbytky buněk ponechaných v odměrce do 250 ml baňky obsahující 60 ml čerstvého média.
11. opakujte krok 10 pro každou kultivační baňku.
12. znovu vložte všech pět baněk na třepačku.
13. po 7 dnech opakujte postup, který jste provedli dříve (od kroku 6-10). Tentokrát však vezměte pouze 1/5 zbytkových buněk jako inokulum.
14. opakujte postup asi 3-4krát. Tímto způsobem zůstanou v suspenzi mrkve pouze jednotlivé buňky nebo malé agregáty.
15. Pro mrkev buněčné suspenze, počtu vhodných buněk se pohybuje mezi 105 a 3 x 105 buněk/ml nebo 100 a 300 mg (čerstvé hmotnosti) inokula v objemu 60 ml čerstvého média obsahující média a 5×10-8 g/ml, 2,4-D.
16. převod dobu 7 dní, je vhodné pro mrkev, aby se jednotlivé buňky v suspenzi kultury.

Approximate Schedule of the Culture

Event	Timing (approximate)
Initiation of cell suspension and determination of total cell number and PCV (packed cell volume)	Day 0
First transfer of cultures	Day 8
Fourth transfer of cultures	Day 29

Result

What should you observe while experimenting? Zde je několik bodů, které si musíte pamatovat při zaznamenávání výsledků.

• datum a doba trvání experimentu.
• počet použitých kultur a ošetření.
• Zaznamenejte morfologii a počet infikovaných kultur v intervalu tří týdnů.
• Určete PCV (balený objem buněk) na začátku a na konci přenosu kultury.
• Odhadnout celkový počet buněk po 3 subkultur, ve dnech 1, 2, 4, a 7, a do grafu proti času.
• studujte vztah mezi hustotou inokula a vzorem růstu.

suspenzní kultura poskytuje výhodu oproti jiným kulturám, protože umožňuje pohyb tkáně v kultivačním médiu, který usnadňuje výměnu plynů. Kromě toho odstraňuje jakoukoli polaritu gradientu tkáně a živin uvnitř a v médiu.

Aplikace Tkáňové Kultury pro Mrkev

1. klonovat taproots.
2. studovat mutantní formu mrkve.
3. studovat fyziologické reakce mrkve, které mohou usnadnit porozumění i jiným rostlinám.
4. studovat růst a vývoj mrkve z jedné buňky.
5. studovat stresovou reakci mrkve, která poskytuje vhled do reakcí jiných rostlin.
6. generovat stovky transgenních rostlin ze suspenze jednotlivých buněk pro jakékoli experimentální účely.

1. Reinert J.and Yeoman M. M. (1982). Rostlinná Buněčná a tkáňová kultura: laboratorní příručka. Springer-Verlag, Berlín Heidelberg, Newyork.
2. Hardegger m., Shakya R. (2004) transformace mrkve. In: Curtis i. s. (eds) transgenní plodiny světa. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-2333-0_22.
3. růst a dělení mrkvových buněk v suspenzní kultuře. (1970). Fyziologie rostlin a buněk. DOI: 10.1093 / oxfordjournals.pcp.a074564.
4. https://www.atzlabs.com/prodcut-info/C1955-Carrot -…