Výsledky

Identifikace IL-7 Receptoru α Řetězce (CD127) jako Marker pro Paměťové T Buňky. Při hledání nových markerů pro definování efektorových a paměťových T buněčných podmnožin v myši jsme analyzovali povrchovou expresi α-řetězce/CD127 receptoru IL-7 (obr. 1a). Během primárních odpovědí na Lm lze rozlišit odlišné subpopulace antigen-specifické populace splenických T buněk na základě hladin exprese CD127. CD127 nízko exprimující buňky (CD127low) převládají během akutní efektorové fáze. Během přechodu do fáze paměťových T buněk však Cd127nízké buňky postupně mizí, zatímco populace exprimující vysoké hladiny (CD127high) zůstávají v průběhu času pozoruhodně stabilní (obr. 1 a A c). Tyto odlišné kinetické hodnoty silně naznačují, že exprese CD127 je selektivní charakteristikou pro T buňky s dlouhou životností paměti. Během efektorové fáze cd127nízké CD8+ T buňky migrují přednostně do nonlymfoidních orgánů, zatímco v LN jsou detekovány pouze Cd127vysoké CD8+ T buňky (obr. 1b). Slezina představuje „přechodný orgán“, kde jsou všechny různé subpopulace nalezeny brzy po imunizaci (22, 23). Později během paměťové fáze jsou antigen-specifické T buňky ve všech orgánech charakterizovány Cd127vysoký fenotyp (obr. 1 b A c). Srovnání schopností CD127low a CD127high antigen-specifické T buňky proliferovat v reakci na stimulaci odhalily výrazné rozdíly mezi těmito dvěma podskupinami. Jak je znázorněno na obr. 1d, purifikované Cd127vysoké T buňky specifické pro Listerii proliferují rychle po stimulaci anti-CD3, zatímco Cd127nízké T buňky proliferují špatně. Je nepravděpodobné, že tyto rozdíly v šíření odrážet výhodou CD127-pozitivní buňky prostřednictvím Ab-mediated IL-7R stimulace, protože různé mAb klony se známou CD127 aktivace nebo blokování činnosti prokázaly stejný účinek v krátkodobých in vitro stimulace testy (údaje nejsou uvedeny).

Pro více přímo prokázat, že dlouho žijící paměťové T-buňky jsou výlučně přítomny v CD127 vysoká vyjádření prostoru brzy po in vivo připravovat, jsme provedli adoptivní transfer studie pomocí nedávno vyvinula reverzibilní MHC multimer-barvení technika (21) funkčně izolovat antigen-specifické T-buňky přímo ex vivo. Po adoptivním transferu CD127high LLO91–99-specifické T-buňky z myší infikovaných pro 10 dnů s Lm, převedeny buňky byly stále detekovatelné několik týdnů později ve slezině naivní příjemce myší (Obr. 2a), zatímco počty buněk po přenosu CD127low buněk byly na detekčním limitu. Toto pozorování nebylo způsobeno rozdíly in vivo migrace přenesených CD127 high a CD127low buněk, protože jsme našli podobné rozdíly pro plíce (obr. 2a) a dalších orgánů (LN a játra, údaje nejsou zobrazeny). Pro další podporu interpretace, že CD127high T buňky výhradně udržují paměťové buňky specifické pro antigen, byly myši příjemce napadeny po adoptivním přenosu infekcí listerií. Opět pouze u myší, které dostaly Cd127vysoké T buňky před infekcí, byla rychlá expanze přenesených llo91-99 specifických T buněk detekovatelných (obr. 2b). Tento výsledek opět nebyl způsoben rozdíly v migraci, protože údržba nebo expanze přenesených CD127low T buněk nebyla detekovatelná v žádném jiném orgánu (obr. 2b a údaje nejsou zobrazeny). I když tyto výsledky z adoptivní transfer studie silně podporují hypotézu, že dlouho žijící paměťové T-buňky jsou výlučně přítomny v CD127high T buňky prostoru, můžeme také pozorovat značné omezení tohoto experimentálního přístupu. Zejména, paměťových T-buněk s okamžitou efektorové funkce se zdají být velmi citlivé na adoptivní přenos experimentů a umírá rychle po čištění a já.v. aplikace, i když se jim přežít měsíce až roky, pokud jsou ponechány beze změny in vivo (11). Proto, i když naše výsledky z adoptivní transfer v souladu s výkladem, že CD127 je označení pro dlouho žijící paměťové T-buňky, nelze vyloučit, že vnitřní problémy týkající se přežití zřetelný T buněk subpopulace také přispět na výsledek těchto experimentů.

Costaining populací T buněk specifických pro Antigen s CD127 a CD62L umožňuje diskriminaci mezi Subpopulacemi paměťových T buněk. Další charakterizace populace CD127high T buněk ukázala, že ji lze rozdělit na subpopulace exprimující vysoké a nízké hladiny CD62L (obr. 3). Přímý ex vivo funkční analýza (21) přečištěné T buněk (10-12 dní po infekci, kdy všechny subpopulace jsou současně zjistitelná ve slezině) odhalili další funkční rozdíly. Zatímco podmnožiny CD62Llow T buněk vykazují intenzivní a okamžitou cytolytickou aktivitu ex vivo, CD127high / CD62Lhigh T buňky vykazují velmi špatnou lýzu cílových buněk potažených peptidem (obr. 3). Intracelulárních cytokinů barvení řazeny subpopulace ukázal, že CD127high/CD62Llow T buněk, jako CD127low/CD62Llow podmnožina, produkce efektorových cytokinů INF-γ a tumor nekrotizující faktor α; v kontrastu, CD127high/CD62Lhigh podmnožina produkuje IL-2, ale ne, IFN-γ a tumor nekrotizující faktor α. Markerová kombinace CD127 a CD62L tedy umožňuje identifikaci subpopulací T buněk s charakteristikami velmi podobnými charakteristikám popsaným dříve u lidí. CD127low/ CD62Llow T buněk prokázat všechny známé vlastnosti skutečného efektorové T-buněčné populace (TE, chudé proliferační aktivita, omezený in vivo přežití, a okamžité efektorové funkce). CD127high / CD62Lhigh podmnožina odpovídá charakteristikám TCM a CD127high / CD62Llow T buňky odpovídají popisu TEM.

generování odlišných subpopulací T buněk v paměti závisí na pomoci T buněk zprostředkované CD40L. Protože jsme cítili, že by to mohlo být problematické výhradně základní výklad, že CD127 výraz může být použit jako marker pro rozlišení mezi efektorové a dlouho žijící paměťové T-buňky na adoptivní mobilní přenos experimentů, rozhodli jsme se analyzovat myš mutantní linie s defekty v generaci T buněčné paměti. Pokud je CD127 skutečně markerem“ časných “ paměťových T buněk, měli bychom být schopni identifikovat rozdíly během časných a pozdních časových bodů v rámci CD127-pozitivních podmnožin u myší s vadami paměti.

Protože nedávné studie prokázaly význam T buňky pomáhají k vytváření dlouhodobé paměti odpovědi (2-4), jsme se rozhodli zjistit, zda přítomnost nebo nepřítomnost CD4+ T buňky, pomoc při CD8+ T buněk priming vede k rozdílům v antigen-specifické T buňky podmnožinou skladeb detekovány v časných posteffector fáze. Myši s deficitem MHC II, které postrádají konvenční CD4+ T buňky, mají vadnou paměťovou odezvu CD8+ a kvalita ochrany se časem snižuje (2-4). Barvení subpopulací T buněk 10 dní po primární infekci ukázalo, že podmnožina CD127high/CD62Llow u myší MHC II–/– téměř úplně chybí (obr. 4a); ostatní subpopulace jsou přítomny při frekvencích podobných těm u myší WT C57BL/6. Tato data ukazují, že absence pomoci T buněk brání efektivní generaci podskupiny T buněk s fenotypem efektorové paměti, což se zdá být zásadní pro rychlou expanzi in vivo a efektorovou funkci.

Protože důležité mechanismy CD4+ T buňky pomáhají, jsou zprostředkované prostřednictvím interakce CD40 a CD40L (24-26), jsme zkoumali, zda CD40L–/– myši vykazují fenotyp podobný MHC II–/– myší. V souladu s jinými nedávné studie (27), CD40L–/– myší prokázat žádné rozdíly v bakteriálním zatížení nebo bakteriální clearance po primární Listeria infekce (údaje nejsou uvedeny) a mají normální primární CD8+ T buněčné odpovědi na subletální dávka Lm (Obr. 4c). Jejich schopnost rychle vyčistit reinfekci vyšší dávkou Lm (≈10 × LD50) je však snížena (obr. 4b), korelující se zhoršenými odpověďmi CD8+ paměťových T buněk (obr. 4c) a mnohem redukovanou podmnožinu CD127high / CD62Llow (obr. 4 e A f) během rané postefektorové fáze. Během reinfekce listerií je proliferace reagujících T buněk u myší CD40L–/– ekvivalentní buněčné populaci u myší WT, což naznačuje, že fenotyp není způsoben obecným defektem proliferativní kapacity paměťových T buněk (obr. 4d), ale spíše na snížený počet paměťových T buněk schopných okamžitě reagovat na reencounter antigenu. Tento fenotyp byl prokázán in vivo-značkovacími experimenty, ve kterých byl brdurd začleněn během celé expanzní fáze (obr. 4d) a in vivo brdurd pulse–chase studiemi sledujícími ztrátu štítku na proliferaci (údaje nejsou uvedeny).

snížená generace podskupin T buněk s fenotypem efektorové paměti brzy po primingu je přenášena do fondu T buněk pozdní paměti. Naše data ukazují, že v nepřítomnosti CD4+ T buněk nebo CD40L je podmnožina CD127high / CD62Llow T buněk významně snížena brzy po základním nátěru. Dále jsme (obr. 4b ) a další (3-5) prokázala, že zhoršená T buňky, pomoc při T buněčné priming vede ke změnám v kvalitě ochrannou imunitu k reinfekci s Lm nebo lymfocytární choriomeningitida virus. Jasněji odkaz pozorovaný defekt v rané generace CD127high/ CD62Llow T buněk s kvalitou následné T-buňka paměti u těchto myší jsme analyzovali antigen-specifických T lymfocytů v paměťové fáze (5 wk po primární Listeria infekce) podrobněji. V tomto časovém bodě musí být analýza antigen-specifických T buněk provedena na buňkách odvozených z různých tkání kvůli jejich odlišnému migračnímu chování. Kromě sleziny jsme zvolili LN jako reprezentativní tkáň pro lymfoidní orgány a plíce jako typický periferní, nonlymfoidní kompartment. V tomto časovém bodě jsou antigen-specifické T buňky v těchto orgánech téměř všechny Cd127vysoké (obr. 1b); buňky v plicích jsou CD62Llow (data nejsou zobrazena), zatímco většina antigen-specifických paměťových T buněk v LN je CD62Lhigh (obr. 5b). Pro stanovení počtu paměťových T buněk specifických pro antigen s jasnou funkcí okamžitého efektoru v různých orgánech jsme provedli intracelulární barvení cytokiny pro IFN-γ. Jak je znázorněno na obr. 5a , CD40L–/– myši se vyznačují podstatně zmenšil počet antigen-specifických paměťových T buněk s okamžitou efektorové funkce v porovnání s WT myší. Tento výsledek platí na úrovni frekvencí (procento) v kompartmentu CD8+ T buněk a v absolutních číslech (obr. 5a). Nicméně, MHC tetramer barvení lymfocytů odvozených od LN (obr. 5b) odhalil téměř identický počet antigen-specifických T buněk s CD62Lhigh fenotypem. Některé T buňky specifické pro antigen CD62Llow jsou také detekovatelné v LNS myší WT, korelující s frekvencemi buněk produkujících IFN-γ (obr. 5a). Tato populace v LNs CD40L–/– myší v podstatě chybí; celá podmnožina CD8+ / CD62Llow je u myší CD40L–/– redukována, což naznačuje obecný defekt v generování této podmnožiny T buněk. Stručně řečeno, naše data ukazují, že absence CD40L závislé na CD4+ T buňky, pomoc při penetraci období výsledky v kvantitativní rozdíly v antigen-specifické CD8+ T buněčné subpopulace, se výrazně sníží počet buněk vystavujících efektoru paměti fenotyp (CD127high/CD62Llow). Tyto kvantitativní rozdíly v buňkách s okamžitou brzy efektorové funkce jsou přenášeny do paměti, fáze a vliv na kvalitu ochranné imunity.