Příprava proteinových komponent pro rekonstituci

Součástí E. coli překlad přístroje, včetně překladu faktory a výročních zpráv o činnosti, byly připraveny jako dříve described46. Příprava složek RNaseP, M1 RNA a C5 proteinu byla také připravena, jak bylo popsáno dříve29. Jsme modifikovali protokol pro C5 protein urychlující to s 80% nasyceného síranu amonného a rozpuštěním tím, dialyzing proti pufru (50 mM octan sodný pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl, a 7 mM 2-merkaptoethanolu). Výsledná sraženina byla získána odstředěním a rozpustí dialyzing proti pufru B obsahující 50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 100 mM NH4Cl, 6 M močoviny a 10 mM dithiothreitolu (DTT). Rozpuštěné proteiny byly aplikovány na 5 mL HiTrap SP HP sloupec (#17115101, GE Healthcare, USA), promyty pufrem B obsahující 7 mM 2-merkaptoethanolu jako náhrada pro 10 mM DTT, a eluována pomocí lineárního gradientu od 100 mM do 2 M NH4Cl v pufru B. C5 Frakce obsahující protein byly analyzovány pomocí SDS-PAGE, zpět, dialyzed proti pufru D (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 0,8 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, 2 M močoviny, 7 mM 2-merkaptoethanolu), pak další dialyzed proti pufru D bez močoviny. Výsledné roztoky byly koncentrovány za použití Amicon Ultra 3 kDa (#ufc800324, Merck Millipore, USA) a dialyzovány proti pufru D bez močoviny obsahující 50% glycerolu. Čištěný protein C5 byl uložen při -30 °C. bereme na vědomí, že můžeme sdílet všechny plazmidy na vyžádání.

Příprava modifikačních enzymů pro ivttrna

modifikační enzymy pro ivttrna byly připraveny následujícím způsobem. E. coli geny TsaB, TsaC, Tbdd, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE, a GidA byly amplifikovány z bakterie E. coli A19 genomu pomocí vhodných primerů (Doplňující Údaje 5). Amplifikované geny pro TsaC, Tbdd, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE, a GidA byly klonovány do pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) jako small ubiquitin-like modifier (SUMO) proteinové syntézy proteinů, kde je Jeho-tag, SUMO protein, a modifikační enzymy byly tandemly uspořádány. Geny pro TsaB a TrmD byly klonovány do pET15b jako fúzní protein His-tag. Všechny geny byly klonovány technikou Gibsonovy montáže (#E2611, New England Biolabs, USA). Výsledné plazmidy byly transformovány na kmen E. coli BL21 (DE3) a pěstovány v 1 L LB médiu na OD660 0,6-1,0 při 37 °C. Zvýšená exprese byla indukována přídavkem IPTG na finální koncentraci 1 mM pro TsaB, TsaC, Tbdd, TsaE, a TrmD, nebo 0,1 mM pro GlyA, MnmC, MnmE, a GidA. Po 3 hodinách kultivace při 37°C byly buňky sklizeny. TsaB, TsaC, TsaE, TrmD, a MnmE-nadměrně exprimován buňky byly resuspendovány ve 40 mL Lyzačního pufru (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, a 7 mM 2-merkaptoethanolu) a narušena ultrazvuku. Výsledné lyzátu byla odstředěna a supernatant byl obnoven a smísí se s 5 mL kompletní His-tag Čištění Pryskyřice (#05893801001, Roche, Švýcarsko) po dobu 1 h s rotátoru. Pryskyřice byla promyta 100 mL Lyzačního pufru a pak protein byl eluován s 25 mL Elučního pufru (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazol, a 7 mM 2-merkaptoethanolu). TsaB a TrmD byly soustředěny do Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) a pak dialyzed proti Akciové pufru (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6 500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-merkaptoethanol a 30% glycerol). Byli flash zmrazené tekutým dusíkem a uložen při -80°C. Pro TsaC, TsaE, a MnmE, Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) bylo přidáno do získané frakce do konečné koncentrace 23 µg/ml k odstranění His-tagged SUMO protein. Frakce byly dialyzed proti Štěpení pufru (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 100 mM KCl, a 7 mM 2-merkaptoethanolu) přes noc při Restrikčním pufru obsahovala 500 mM KCl pro MnmE přípravy. Dialyzované vzorky byly opět smíchány s 5 mL kompletní čisticí pryskyřice His-tag s rotátorem. Poté byly shromážděny průtokové frakce, které obsahují modifikační enzymy. Zotavil vzorky byly soustředěny do Amicon Ultra 3 kDa pro TsaE nebo Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) pro TsaC a MnmE. Byli dialyzed proti Akciové vyrovnávací paměti, flash zmrazené tekutým dusíkem a uložen při -80 °C. Pro GlyA příprava, všechny pufr obsahoval 10% Glycerol a další postupy jsou stejné jako MnmE přípravy. Bylo zjištěno, že TsaD je po sonikaci nerozpustný. Proto proteinu byla peletována centrifugací na 20,400 × g a při 4 °C po dobu 45 min a to bylo resuspendované v Lýza tlumivý roztok s 4% Triton X-100. Suspenze byla opět peletována centrifugací při 20,400 × g po dobu 45 minut. Peleta byla rozpuštěna lýzním pufrem doplněným 6 M močovinou. Druhý postup byl stejný jako příprava MnmE s tím rozdílem, že všechny pufry obsahovaly 2 M močoviny. Pro přípravu MnmC byly všechny kroky až do odstranění jeho značeného sumo proteinu stejné jako u přípravku GlyA. Protože se MnmC nespecificky váže na purifikační pryskyřici His-tag, bylo zvoleno čištění pomocí aniontoměničové chromatografie. Řešení po Ulp1 léčba byla dialyzed proti IEX pufru (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, a 7 mM 2-merkaptoethanolu) a pak byly aplikovány na 5 mL HiTrap Q HP sloupec (#17115401, GE Healthcare, USA). Kolona se promyje 25 mL pufru IEX a potom se MnmC eluuje gradientem vložky od 100 mM do 1 M KCl v pufru IEX. Frakce obsahující MnmC byly soustředěny do Amicon Ultra-30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA), dialyzed proti Akciové vyrovnávací paměti, flash zmrazené tekutým dusíkem a uložen při -80°C. bereme na vědomí, že můžeme sdílet všechny plasmidy v žádosti.

Příprava iVTtRNA

Geny pro každou iVTtRNA (Doplňující Údaje 1) byly klonovány do pGEMEX-1 vektor (#P2211, Promega, USA) mezi XbaI a BamHI restrikčních míst. Pomocí výsledné plasmidy jako šablony, DNA šablony pro in vitro transkripci byly pomocí PCR amplifikovány pomocí T7 promoter primer jako forward primer a vhodné reverzní primery pro každý iVTtRNA (Doplňující Údaje 1). Každý reverzní primer obsahoval 2′-methoxy modifikaci na druhém nukleotidu z 5 ‚ – konce, aby se zabránilo přidání extra nukleotidu nezávislého na šabloně.28. Produkty byly čištěny extrakcí fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1), následované srážením ethanolem a sraženiny byly rozpuštěny ve vodě. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). RNase P komponenty složené z C5 bílkovin a M1 RNA, následně byly přidány do reakční směsi na 150 nM pro odstranění 27 extra nukleotidů, a reakce byly inkubovány po dobu 1 h při 37 °C. Přepisována iVTtRNAs byly pak zpracovány s kyselé fenolové extrakce následuje chloroform/isoamyl alcohol (10:1) extrakce, pak čištění aniontovou-výměnnou chromatografií. Vzorky obsahující ivttrna byly vloženy do 10 mL kolon HiTrap Q HP (#17115401, GE Healthcare, USA) a promyty Q pufrem (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 A 200 mM KCl). ivttrna byly eluovány s lineárním gradientem od 200 mM do 1 M KCl v Q pufru. Frakce obsahující cílové ivttrna, stanovené močovinou, byly získány precipitací isopropanolu a vysrážené ivttrna byly rozpuštěny ve vodě a skladovány při -80°C až do použití. Bereme na vědomí, že můžeme sdílet všechny plazmidy na žádosti.

modifikace iVTtRNA

modifikace t6A37 byla provedena v reakční směsi obsahující 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pyridoxal-5′-fosfát, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36.4 µM SAM, o 0,1 jednotky/µL rekombinantní RNase inhibitor (#2313, TaKaRa, Japonsko), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2.5 µM MnmC, 6 A260 jednotku/mL tRNAGluUUC nebo tRNAGluCUC. Po inkubaci při 37°C po dobu 2 h pro t6A37 a m1G37 modifikace nebo 4 h pro mnm5U34 modifikace, tRNAs byly zpracovány s kyselé fenolové extrakce následuje chloroform/isoamyl alcohol (10:1) extrakce a zpět isopropanol srážek. Vysrážené tRNA byly rozpuštěny ve vodě a skladovány při -80 °C. Pro modifikaci mnm5U34 byla reakce opět provedena s obnovenými tRNA. Byly zpracovány s kyselé fenolové extrakce následuje chloroform/isoamyl alcohol (10:1) extrakce, odsolený tím, MicroSpin G-25 Sloupce (#27532501, GE Healthcare, USA), a vymáhá isopropanol srážek. Vysráží tRNAs byly rozpuštěny ve vodě a uloženy při teplotě -80 °C. Pro kvantifikaci modifikace účinnost, 57.1 µM Thr byl použit místo 1 mM Thr a směsi bez Tbdd byl použit jako kontrola pro t6A37 modifikace. 36.4 µM S — byl použit adenosyl-methionin a směs bez TrmD byla použita jako kontrola pro modifikaci m1G a bez GidA byla použita jako kontrola pro modifikaci mnm5U34. Po inkubaci při 37 °C byly alikvoty (10 µL) odebrány a spatřeny na filtračních discích Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filtrační kotouče byly dvakrát promyty 10% TCA, poté ethanolem, následovalo měření radioaktivity scintilačním počítadlem kapaliny. Pro kvantifikaci modifikace mnm5U byly tRNA vyčištěny jak je uvedeno výše a pak byla na filtračních discích místo toho spatřena jednotka 0,02 a260.

Aminoacylace

Aminoacylační experimenty byly provedeny podle předchozí zprávy47. Reakční směsi (10 µL) obsahovala 100 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 jednotka/µL rekombinantní RNase inhibitor (#2313, TaKaRa, Japonsko), 50 nM nebo 1,5 µM výročních zprávách o činnosti odpovídající každé aminokyseliny, 20 µM -aminokyselin nebo 68 µM Asn pro asparagin aminoacylation, a 2 A260 jednotku/mL tRNA. Pro měření methylace byla místo toho použita směs 0,6 µM Met a 3,4 µM studeného L-methioninu. Cys byla získána redukcí-cystinu s 50 mM DTT při 37 °C po dobu 15 minut. Pro měření cysteinylation, DTT koncentrace byla 5 mM. Když nativní tRNA směsí byly použity, 40 A260 jednotku/mL tRNA směsí (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) byly přidány místo. Po inkubaci při 37°C po dobu 30 minut byly alikvoty (8 µL) odebrány a spatřeny na filtračních kotoučích Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filtrační kotouče byly dvakrát promyty 10% TCA, poté ethanolem, následovalo měření radioaktivity scintilačním počítadlem kapaliny.

Oktapeptidový syntézu s ČISTÝM systému

DNA šablon kódování octapeptides byly pomocí PCR amplifikovány s vhodnými primery (Doplňující Údaje 2) pomocí pURE1 vektor (#PUREV001, BioComber, Japonsko), který obsahuje T7 promotor, sekvence a ribozom vazebné místo (Shine-Dalgarno sekvence) jako šablonu. Amplifikované šablony DNA byly čištěny pomocí sady pro čištění PCR QIAquick (#28104, QIAGEN, Německo). Reakce syntézy oktapeptidů obsahovaly 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM draselný glutamát, 13 mM, hořčík, acetát, 2 mM spermidinu, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM kreatin fosfát, 10 µg/mL 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrolistové, 0,2 µM ribozom, 4 nM templátu DNA, bílkovinné ČISTÉ komponenty systému včetně překladu faktory a enzymy, aminokyseliny, a tRNAs. Koncentrace proteinových složek čistého systému byly popsány v předchozím protokolu46. Všimli jsme si, že do tohoto experimentu bylo zahrnuto všech 20 aaRSs, bez ohledu na šablony DNA a testovací kodony. Složení a koncentrace aminokyselin, které závisí na testovaných kodonech, jsou uvedeny v doplňkových údajích 2. Složení iVTtRNAs závisí na šabloně, a reakce byly provedeny pomocí bazální iVTtRNAs (Doplňující Údaje 2) v přítomnosti nebo nepřítomnosti test iVTtRNAs (Doplňující Údaje 2). Koncentrace každé iVTtRNA byla stanovena na 6 µM. Při použití nativních směsí tRNA bylo místo toho přidáno 56 směsí A260 jednotek/mL tRNA (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Reakce byly prováděny po dobu 60 min při 37 °C a alikvoty byly staženy, spatřen na Whatman 3 MM filtrační papíry (#1822-025, GE Healthcare, USA), vařené v 10% TCA na 90 °C po dobu 30 min na deacylate aminoacyl-RNAs. Radioaktivita v 10% nerozpustné frakci TCA byla měřena pomocí scintilačního čítače kapaliny.

syntéza Bílkovin s ČISTÝM systému

syntéza Bílkovin experimenty byly provedeny s PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japonsko) bez tRNA směsi v Roztoku (Pufr mix). Navíc jsme přidali 0.2 µM Met, 4 nM PCR-amplifikovaná dna šablona pro expresi DHFR nebo sfGFP (doplňující údaje 3) a specifikované množství směsi iVTtRNA nebo nativní směsi tRNA. Reakce byly prováděny při 30 nebo 37 °C po dobu 12 hodin a byly analyzovány syntetizované proteiny.

Analýzu syntetizovaných bílkovin

Syntetizován DHFR a sfGFP obsahující radioaktivní Splněny byly analyzovány pomocí 15% SDS-PAGE a gel byl obraz vizualizované pomocí BAS-5000 bio-imaging analyzer (GE Healthcare, USA). Časový průběh analýzy sfGFP exprese byla provedena pomocí měření sfGFP fluorescence každé 3 min pomocí první krok zásahovou jednotku-PCR systému (#4376373, Applied Biosystems, USA). Fluorescenční obrazy syntetizovaných sfGFP v reakčních směsích byly získány pomocí přístroje LAS-4000 (GE Healthcare, USA). Aktivita syntetizovaného DHFR byla měřena, jak bylo popsáno dříve44. Reakční směsi (2 mL) obsahovaly 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM ethanolamin, 100 mM NaCl, 10 mM 2-merkaptoethanol, 0.1 mM EDTA, 100 µM kyseliny dihydrofolové a 10 µL alikvotu čisté reakční směsi a byly inkubovány při 37°C po dobu 15 minut. Dále bylo přidáno 20 mM NADPH ke konečné koncentraci 200 µM a pokles absorbance při 340 nm byl měřen po dobu 10 minut spektrofotometrem v-550 (Jasco, Japonsko). Jedna jednotka DHFR byla definována jako množství enzymu, potřebné k procesu 1 µmol dihydrofolic za 1 min při 37 °C.

LC-MS analýzu syntetizovaných bílkovin

DHFR s VLAJKOU sekvence na svém konci (Doplňující Údaje 3) byl syntetizován s PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japonsko) bez směsí tRNA v roztoku I (Pufrová směs). Navíc jsme přidali 4 nM PCR amplifikované DNA šablony pro DHFR označené s VLAJKOU sekvenci na svém C-konci (Doplňující Údaje 3) a určené množství iVTtRNA směsi nebo nativní tRNA směsi. Reakce byly prováděny při 30 °C po dobu 12 h. syntetizovaný DHFR byl čištěn magnetickými kuličkami proti vlajce M2 (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Alikvoty (55 µL) reakčních směsí byly smíchány s 245 µL pufru pro praní vlajky (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg(OAc)2), a dále ve směsi s 30 µL kuliček za 1 h. Korálky se promyjí 210 µL VLAJKY promývacího pufru s následným promytím s vyrovnávací paměti, aniž Mg(OAc)2 dvakrát (210 µL 180 µL). Pak, DHFR byla eluována 50 µL VLAJKY promývacího pufru bez Mg(OAc)2, ale doplněn 100 µg/mL 3xFLAG peptid (#F4799, Sigma-aldrich, USA) po jemně míchání po dobu 1 h. Příprava vzorků pro LC-MS analýza byla prováděna podle fáze přenosu povrchově aktivní látky (PTS)-aided protocol48. 4 µL husté PT pufru (100 mM deoxycholát sodný, 100 mM roztokem N-lauroylsarcosinate a 500 mM NH4HCO3) bylo přidáno 40 µl eluované vzorky. Byly redukovány 10 mM TCEP při 37 °C po dobu 30 minut, alkylovány 20 mM jodoacetamidem při 37 °C po dobu 30 minut a kaleny 20 mM Cys. Každý reakční roztok byl rozdělen na dvě části. Jeden byl stráven 10 ng/µl Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) a 10 ng/µl trypsinu (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) při 37 °C přes noc. Druhý byl tráven 10 ng / µl Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) při 37 °C přes noc. Po trávení, 10% trifluoroctové kyseliny (TFA) byla přidána do konečné koncentrace 1%, a reakční roztoky byly centrifugovány na 15 000 × g po dobu 5 min, aby se vysrážela detergenty. Supernatanty byly odsoleny pomocí samočinně připravených stupňových špiček49 a sušeny Speedvacem. LC-MS analýza byla provedena pomocí hmotnostní spektrometr Orbitrap (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) vybavený iontovým zdrojem nanospray (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) a nano-LC system (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). Sušené peptidové směsi byly rozpuštěny v roztoku obsahujícím 5% acetonitrilu a 0,1% TFA a každý vzorek byl aplikován na nano-LC systém. Peptidy byly koncentrovány pomocí pasti (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) a pak odděleny pomocí nano kapilární kolona (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japonsko) pomocí dvou mobilních fází A (o 0,1% kyseliny mravenčí) a B (acetonitril a 0,1% kyselina mravenčí) s gradientem (5% B po dobu 5 min, 5-45% B za 45 min, 45-90% B, 1 min, a 90% B ve 4 min) při průtoku 500 nL/min. Eluce byla přímo elektrosprejována (2,2 kV) do MS (pozitivní režim, rozsah skenování 200-1500 m/z, rozlišení 60 000 FWHM)50.