Když přijde k rozpouštění a denaturace proteinů před isoelektrická fokusace a 2-D gelové elektroforézy, většina výzkumníků si vybrat močoviny. To není překvapující, protože tato mírná chaotropic agent může zcela narušit interakce mezi molekuly bílkovin a zvýšení účinnosti proteázy činnost v trávení bílkovin a zároveň účinně brání agregaci proteinů z a/nebo urychlovat. Kromě toho se močovina používá také pro renaturaci proteinů z dříve denaturovaných vzorků.

navzdory své popularitě jako účinného proteinového denaturantu přichází použití roztoku močoviny při trávení proteinů se zvláštní výzvou-zvyšuje riziko karbamylace. Proč by se vás to mělo týkat? Zde je několik důvodů, proč karbamylace může být pro váš experiment škodlivá a proč by se jí mělo za každou cenu vyhnout.

1. Kromě blokování N-koncových konců proteinových molekul karbamylace narušuje charakterizaci proteinu a znemožňuje jejich další použití.
2. agresivně napadá vedlejší řetězce zbytků argininu a lysinu a činí protein nevhodným pro enzymatické trávení.
3. brání enzymatickému trávení proteinů a negativně ovlivňuje identifikaci a kvantifikaci proteinů v MS analýze.
4. zaměňuje výsledky získané z peptidů s neočekávanými retenčními časy a zvyšuje složitost vzorku.
5. snižuje účinnost ionizace a negativně ovlivňuje intenzitu signálu detekovaných vrcholů.
6. indukuje změnu izoelektrického bodu proteinů a vede k umělým výsledkům.
7. může ovlivnit výsledky studií karbamylace in vivo.

Co způsobuje Karbamylaci?

podle definice se karbamylace týká posttranslační modifikace, která mění strukturální a funkční vlastnosti proteinů. To je způsobeno neenzymatickou reakcí mezi kyselinou isocyanovou a volnými aminoskupinami.

ve vodných roztocích existuje močovina v rovnováze s kyanátem amonným. Je důležité si uvědomit, že (1) močoviny v roztoku disociuje spontánně produkující kyanatan a amonné ionty, (2) to degraduje isocyanic kyseliny (CNOH), formulář, který aktivně reaguje s protein amino skupin a vyvolává carbamylation, a (3) míra, při které je močovina rozloží a rozsahu carbamylation závisí na teplotě, pH, a inkubační době.

prevence Karbamylace: některé užitečné tipy, které je třeba zvážit

nic nemůže změnit skutečnost, že močovina v přítomnosti tepla a bílkovin vždy povede k karbamylaci. Můžete použít nejkvalitnější močovinu, která je k dispozici, a stále riskujete karbamylaci.

Naštěstí Existuje několik způsobů, jak chránit peptidy před karbamylací. Zde jsou některé účinné strategie, které lze použít k dosažení tohoto cíle.

• při provádění proteomických postupů vždy používejte čerstvě připravená činidla na bázi močoviny. Používejte vysoce kvalitní suché pufry na bázi močoviny předem smíšené a připravené k použití z důvěryhodných zdrojů a při přípravě vzorků dodržujte mimořádnou opatrnost. Poznámka: skladujte pevný materiál při pokojové teplotě a udržujte manipulaci na minimu.
• odeberte močovinu ze vzorku proteinu před jeho štěpením dialýzou a / nebo rychlou chromatografií s obrácenou fází nebo pomocí spinových kolon.
• Udržujte vzorek při relativně nízké teplotě, aby se snížila rychlost rozkladu močoviny. Vyvarujte se zahřívání pufrů obsahujících močovinu nad 37 ° C, aby se snížilo riziko karbamylace.
• Deionizujte roztok močoviny pomocí iontoměničové pryskyřice ke snížení koncentrace kyanátu.
• okyselte roztok močoviny (100 mM HCl), aby se zabránilo tvorbě kyseliny isocyanaté.
• použijte činidla, jako je ethanolamin, ethylendiamin, methylamin a Tris-HCl, aby se minimalizovala karbamylace proteinů/peptidů. Tato činidla pomáhají tím, že uklízejí molekuly kyanátu, čímž je činí nedostupnými pro peptidy.

je pravda, že tyto strategie mají své vlastní nevýhody (tj. snadno denaturovaných proteinů a může být nevhodný pro řadu enzymatických technik trávení), ale protože enzymatické trávení se provádí při zvýšených teplotách po dlouhou dobu, nemáte jinou možnost, než odstranit močovinu z trávené směsi. Jinak vždy riskujete karbamylaci. Je to riziko, které bys nechtěl podstoupit.