myeloidní prostoru vrozený imunitní systém se skládá z několika typů buněk, jejichž funkce zahrnují clearance poškození a apoptotických buněk, antigen prezentace, imunosuprese, a chrání hostitele z cizí mikroorganismy.

monocyty představují vysoce plastickou podmnožinu buněk, které tvoří vrozený imunitní systém. Tyto buňky jsou schopné přeletět vaskulatury a, když je vystavena specifické cytokiny, podstoupit diferenciace do různých buněčných typů. Cirkulující monocyty jsou klasifikovány jako neklasické nebo klasické a lze je rozlišit podle jejich vzoru exprese buněčného povrchu receptoru. Klasické monocyty v oběhu displej CD14+++Hi/CD16−/lo a jsou přítomny zejména v místech infekce nebo onemocnění (1,2).

lidské neklasické monocyty v cirkulaci vykazují povrchovou expresi CD16+++Hi/CD14+/lo (1). Po aktivaci procházejí monocyty několika morfologickými a biochemickými funkčními změnami, což vede k diferenciaci monocytů na nové typy buněk, jako jsou makrofágy (3).

V paradigmatu označují klasické aktivaci lidských monocytů zobrazení fenotypové plasticity, která může být zahájena expozice k Th1 odpovědi—podpora cytokinu interferon-γ (IFN-γ) nebo faktor nádorové nekrózy α (TNF-α), stejně jako endotoxin lipopolysacharid (LPS) (4,5). Tento mechanismus klasické aktivace generuje makrofágy M1, které fungují tak, že produkují prozánětlivé mediátory, které poskytují ochranu hostitele před bakteriemi a viry (6). Lidské monocyty mohou být také diferencovány M2 makrofágů působením Th2 odpovědi—podpora cytokinů jako je interleukin-10 (IL-10) a transformační růstový faktor-β (TGF-β) (4,7). M2 makrofágy express vysokou úrovní CD206 (receptor manózy) a CD163, produkují nízké hladiny prozánětlivých cytokinů a podporují hojení ran a matice přestavby.

dendritické buňky (DCs) jsou další sadou imunitních buněk odvozených od monocytů, jejichž funkcí je prezentovat antigeny T buňkám za účelem zahájení adaptivní imunitní odpovědi založené na T-buňkách. DCs lze rozdělit do velké části do tří podskupin: klasické (CDC), plazmocytoidní (PDC) a monocyty odvozené (modc). CDC se obvykle nacházejí v lymfatické tkáni, slezině, lymfatických uzlinách a kostní dřeni. PDC se podobají plazmatickým buňkám a obvykle se nacházejí v krevním oběhu (8). Monocyty se mohou diferencovat na DCs, které se často nazývají DCs odvozené od monocytů (modc) po expozici faktoru stimulace kolonie granulocytů makrofágů (GM-CSF) a IL-4 (9,10). bylo hlášeno, že modc exprimují markery CD80, CD83, CD86 a CD1a in vitro (11-13). Zatímco modc se liší od makrofágů ve tvaru a funkci buněk, sdílejí expresi několika antigenů buněčného povrchu, včetně CD11c, CD206 a CD1a (14).

několik skupin hlásilo úspěšnou diferenciaci lidských CD14 + monocytů na makrofágy; mnoho z těchto publikovaných protokolů je však odlišných. Běžnou variací mezi těmito metodami je zahrnutí (15) nebo vynechání (16) IL-6. Dalším rozdílem mezi protokoly je načasování léčby. Tento nedostatek konzistence mezi protokoly je problematický.

k řešení těchto problémů jsme zkoumali a porovnávali zahrnutí a vynechání IL-6 v léčbě cytokiny používané v běžných metodikách diferenciace lidských monocytů. Zjistili jsme, že při absenci IL-6 tyto strategie produkují buňky s nízkým stupněm homogenity, což může přinést nejednoznačné experimentální výsledky. Za druhé, abychom tento problém dále řešili, vyvinuli jsme novou postupnou strategii in vitro se zahrnutím IL-6. Zjistili jsme, že tato strategie výrazně zlepšila buněčnou homogenitu makrofágů M1 a M2 a modc, které byly odlišeny od lidských monocytů CD14+. Toto zlepšení metodiky poskytne vědcům lepší modely pro vyšetřování imunitního systému a chorobných stavů.

Materiály a metody

Buněčné přípravky

Buffy kabáty byly shromážděny z celé krve z pěti nebo více zdravých mužských dárců, které byly sloučeny. Mononukleárních buněk periferní krve (Pbmc) byly připraveny z buffy kabáty pomocí Ficoll-Paque (1.077 g/mL hustota) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) hustota přechodu odstředění na 400 x g při teplotě 18°C po dobu 35 min oddělit krevní složky. Buňky byly několikrát promyty pomocí 1× PBS a počítal pomocí Nexcelom Cellometer Auto T4 plus cell counter (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Po započítání byly monocyty CD14+ izolovány z Pbmc magnetickým značením pomocí konjugovaných mikrobů MAB CD14 (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA), následuje separace pomocí magnetického sloupce (130-042-401 a 130-042-302; Miltenyl Biotec) podle návodu výrobce, s jedinou výjimkou: při sběru CD14+ buněk z magnetického sloupce, buňky byly propláchnout nejprve pomocí 5 mL pufru spoléhat pouze na gravitaci (bez použití dodávané píst). Po počátečním 5 mL opláchnutí byl přidán další 5 mL pufru a jemně propláchnut pomocí dodaného pístu.

buněčná kultura

lidské CD14 + monocyty byly naočkovány při buněčné hustotě 2,0-3.0 × 105 buněk/mL v RPMI 1640 médiu s 2 mM/L L-glutamin (Life Technologies, Frederick, MD) doplněném 10% tepelně inaktivovaného FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penicilinu (Life Technologies) a 100 mg/mL streptomycinu (Life Technologies) při 37°C ve zvlhčené 5% CO2 inkubátoru. K odlišení buněk na M1 makrofágy, cytokiny byly použity GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) a LPS endotoxin (20 ng/mL). Pro M2 makrofágů diferenciace, cytokiny byly použity kolonie makrofágů stimulující faktor (M-CSF), IL-4, IL-6 a IL-13 v koncentraci 20 ng/mL (PeproTech). modc byly generovány přidáním GM-CSF (100 ng / mL) a IL-4 (20 ng/mL). Načasování každé strategie je dále popsáno na obrázku 1.

průtoková cytometrie

Polarizované makrofágy a DCs byly kultivovány po dobu 9 dnů na 10 cm2 jídla (BD Falcon, Billerica, MA). Na Den 9, média a non-adherentní buňky byly shromážděny; adherentní buňky byly promyty pomocí 1× PBS, odstranili pomocí buněčné disociace pufru (Life Technologies), a potom přidá do vybrané média/non-adherentní buňky, které mají být umyty. Pozastavena buňky byly odstředěny a promyje dvakrát (1× PBS, O 0,5% BSA, 2 mM EDTA), počítal, a pak inkubovány s fluorophore-konjugované primární protilátky proti CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE), a CD64 (FITC) ve tmě po dobu 45 min při 4°C. Fluorescence byla detekována pomocí S3TM Cell Sorter (Bio-Rad, Hercules, CA).

Endocytóza test

Polarizované lidské makrofágy byly naočkuje na 4-komora sklíčka (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) při hustotě 3.0 × 105 buněk / mL v 7. den a pokračovalo v kultivaci příslušnými cytokiny po zbývající 2 dny. Perylenbisimid (PBI-12-Man) (17) byl laskavý dar od Ke-Rang Wanga na Hebei University. Buňky byly kultivovány 10 µg / mL PBI-12-Man po dobu 30 minut při 37°C, poté promyty 1× PBS. Buňky byly fixovány pomocí 70% ethanolu a namontovány pomocí DAPI (P36962; Life Technologies). Pro vizualizaci endocytózy PBI-12 Man byly snímky vzrušeny a emitovány při 585 nm. Červené fluorescenční obrazy byly kvantifikovány pomocí softwaru pro skenování snímků Metafer (MetaSystems, Boston, MA). Statistické testování bylo provedeno pomocí softwaru MATLAB R2015a (The Mathworks, Inc. Natick, MA). Byly provedeny testy s hodnotovým součtem, aby se otestovala jednorozměrná statistická významnost mezi vzorky.

Imunofluorescence

Makrofágy byly rozlišeny pomocí dříve popsané metody pro 7 dny, a pak se přenesl do Nunc Lab-Tek II, 4-skleněná komora snímky s příslušnými cytokiny. Buňky byly ponechány růst dalších 7 dní; 14 dní po počátečním pokovování byly buňky fixovány pomocí 70% ethanolu a namontovány pomocí prolong Diamond anti-fade mountant s DAPI. Buňky byly vizualizovány pomocí fázového kontrastu a fluorescenční mikroskopie na EVOS FL Auto (Life Technologies).

Výsledky a diskuse

Strategií a podmínky k lidskému CD14+ monocytů diferenciace

začali Jsme tím, že posouzení toho, které strategie jsou nejefektivnější v produkci homogenních populací lidských M1 a M2 makrofágů, stejně jako moDCs. Lidské CD14 + monocyty byly izolovány a naočkovány na destičky tkáňové kultury, aby byly diferencovány na makrofágy nebo modc in vitro. Poté jsme testovali tři specifické podmínky léčby, abychom určili metodu, která poskytla nejrovnoměrnější populace makrofágů a moDC. Pro první podmínku jsme kultivovali buňky přidáním pouze GM-CSF nebo M-CSF po dobu 9 dnů (Obrázek 1). Tato podmínka se nazývá „pouze“ (Obrázek 1). Druhou léčebnou strategií bylo neustále vystavovat buňky použitelnému prostředí cytokinů v den 0, doplňovat média, cytokiny a LPS v den 5 a analyzovat buňky v den 9. Tato podmínka se nazývá „kontinuální“ (Obrázek 1). Třetí strategie byla stimulovat CD14+ monocyty buď s GM-CSF a M-CSF po dobu 5 dnů, následuje přidání čerstvého média obsahující LPS pro lidská M1 makrofágy a všechny příslušné cytokiny pro dané experimentální skupiny (GM-CSF, IFN-γ a IL-6 pro M1 makrofágy nebo M-CSF, IL-4, IL-13 a IL-6 M2 makrofágy). Tato léčebná strategie byla označena jako „fázovaná“ (Obrázek 1). Léčba CD14 + monocytů 100 ng / mL GM-CSF a IL-4 po dobu 5 dnů a nahrazení médií a všech cytokinů v den 5 generovaných modc. Modc byly poté stimulovány IL-6 a LPS po dobu 24 hodin před analýzou (den 8), aby se podpořilo DC zrání a aktivace. Tato kultivační metoda byla nazývána „stimulovaná“ (Obrázek 1). Modc, které nikdy nedostaly expozici IL-6 a LPS, byly označeny jako „nestimulované“ (Obrázek 1). Po 9 dnech kultivace za specifických podmínek popsaných výše byla analyzována exprese buněčného povrchu receptoru a funkčnost buněk.

IL-6 expozice zvyšuje M2 polarizace účinnost in vitro

Předchozí studie ukázaly, že makrofágů expozice cytokinu IL-6 není jen pokřivuje odlišení od monocytů v dendritické buňky a makrofágy fenotypu ale, že IL-6 expozice také zvyšuje expresi mRNA profil asociovaný s M2 makrofágy (15,18). Pro potvrzení těchto zjištění a testování účinku IL-6 na polarizaci M1 a M2 byly lidské CD14+ monocyty za podmínek kontinuálního a fázového kultivace ošetřeny IL-6 nebo bez něj. Vyšetření M2 makrofágů surface marker výraz v M1 diferencované buňky ukázal žádné významné změny při kultivaci s IL-6 (Obrázek 2), což naznačuje, že IL-6 léčba není zkrat M1 polarizovaných makrofágů směrem k M2 fenotypu.

naopak analýza kontinuálních a fázovaných skupin kultury makrofágů M2 odhalila, že léčba IL-6 zvýšila expresi povrchových markerů makrofágů M2. V populacích makrofágů M2 zůstala exprese CD206 i CD36 vysoká a při expozici IL-6 se jevila nezměněná (Obrázek 2, A A B). CD163 A E-cadherin však vykazovaly významné zvýšení hladin povrchové exprese a homogenity populace při léčbě IL-6 (Obrázek 2, C A D). To se projevuje snížením v low-vyjádření CD163 a E-cadherinu vrcholy (červené šipky na Obr. 2, C a D) a výsledný posun směrem k homogenně high-vyjádření obyvatel.

IL-6 se často používá k indukci zrání moDC (18,19). Aby bylo možné určit, zda léčba IL-6 může vést k nežádoucím modc v populacích polarizovaných makrofágy, byla zkoumána exprese zralého DC povrchového markeru (CD83). Pro průtokovou cytometrii analýza prokázala, že žádný z M1 nebo M2 kultivační podmínky povýšen žádné významné zvýšení exprese CD83 (Obrázek 2E). To naznačuje, že v těchto populacích makrofágů nedošlo ke kontaminaci moDC nebo že jakékoli kontaminující modc byly necitlivé na IL-6.

Postupné polarizace vede ke zvýšení exprese kanonické M1, M2, a moDC buňka-povrch značky

potvrďte, že lidské CD14+ monocyty byly plně diferencované do buď makrofágy nebo moDCs Den 9, průtoková cytometrie byla použita k analýze buněčných povrchových markerů a zhodnotit morfologické rozdíly (viz Obrázek 3, A-C). Lidské CD14 + monocyty byly diferencovány (Obrázek 1), aby bylo možné posoudit, která strategie by poskytla vysokou expresi vhodných povrchových markerů buněčného typu. Panel markerů buněčného povrchu byl testován pro každý z typů buněk. Náš panel M1 cell-surface marker se skládal z kanonických markerů CD86 a CD80 (obrázek 3, A-C). Pro M2 makrofágů panel, použili jsme CD206, CD163, CD124 (IL-4 receptor-α), E-cadherin, a CD36 (Třída B scavenger receptor) (Obrázek 3, A-C). Pro modc byly použity CD83, CD86 a CD1a. Hladiny povrchové exprese pro všechny testované markery byly stanoveny pro všechny typy buněk (Doplňkový obrázek S1). Medián fluorescenční intenzity (MFI) byla vypočtena a zobrazena jako násobná změna ve vztahu k odpovídající neposkvrněný ovládání (viz tabulky na Obrázku 3).

Zajímavé je, že analýza M2 buněčných povrchových markerů, CD36 a IL-4Ra, v M1 GM-CSF-pouze polarizovaných makrofágů odhalila dramatický nárůst (Obrázek 3A). Při porovnání buněk ošetřených pouze GM-CSF se všemi skupinami léčenými M1 měla skupina pouze GM-CSF výrazně vyšší expresi CD36. Tyto buňky pouze pro GM-CSF také exprimovaly nízké hladiny markerů CD86 a CD80 asociovaných s M1. Podobně kontinuální stav přinesl buňky, které byly nejen nízké v CD86 a CD80, ale byly také vysoké v expresi CD36 a IL-4Ra. Naopak, když člověk CD14+ monocyty byly rozlišeny v rámci M1 postupně stav, CD86 a CD80 byly znatelně up-regulovány, zatímco CD36 a IL-4Ra výraz zůstala nízká. Dále průtokovou cytometrii analýza buněk-surface marker vyjádření vyplynulo, že M1 makrofágy měly nižší expresi CD206, CD36 a CD163 relativní M2 makrofágy v rámci obou postupné a kontinuální expozice (Doplňující Údaje S1 a S4). Navíc tyto rozmanité podmínky kultivace vytvářejí buňky s odlišnými morfologickými rysy a strukturou (obrázek 3A). Zatímco GM-CSF-pouze upravené buňky se zdají být větší, forward scatter (FSC) údaje odhalily minimální rozdíly ve velikosti mezi skupinami (Doplňující Údaje, S2 a S3). Srovnání vnitřní složitosti (SSC) mezi podmínky léčby odhalila zvýšení zrnitosti v GM-CSF a postupné skupin (Doplňující Obrázek S2). Dohromady tyto výsledky ukazují, že GM-CSF-pouze a kontinuální léčba výnos buňky, které exprimují nízké hladiny M1 značky a vysoké hladiny některých M2 markerů, stejně jako vykazuje morfologické změny.

M2 podmínky kultivace makrofágů přinesly o něco nejednoznačnější výsledky než podmínky kultivace makrofágů M1 (obrázek 3B). Ve srovnání se skupinou pouze pro M-CSF vykazovaly fázované a spojité skupiny zvýšené hladiny exprese CD206. Naopak, IL-4Ra povrchu hladiny byly výrazně vyšší v M-CSF-pouze podmínky, v poměru k průběžné a postupné. Exprese e-cadherinu zůstala jednotná napříč skupinami, zatímco CD163 byl významně vyšší jak ve skupinách pouze pro M-CSF, tak ve skupinách s fázemi. Jedním z pozorování je, že kontinuální expoziční skupina byla konzistentně mnohem méně homogenní, pokud jde o expresi markerů na povrchu buněk. To je ilustrováno bimodální distribucí a velkým rozptylem úrovní exprese zjištěných na histogramu. Kromě toho lze mezi léčenými skupinami pozorovat dramatické morfologické rozdíly. Na základě snímků fázového kontrastu skupina M-CSF produkovala buňky, které se zdají být menší a vysoce granulární (obrázek 3B). Pro průtokovou cytometrii analýza ukazuje, že tyto buňky mají podobné velikosti (FSC), nicméně, tam je zvýšení buněčné granularity v postupné a kontinuální léčby podmínek (Doplňující Obrázek S2). A konečně, glutaminová deprivace změnila polarizaci M2, což dokazuje, že metabolické produkty jsou v rámci této strategie nezbytné (Doplňkový obrázek S5). Celkem, tato data naznačují, že fázové podmínky poskytují největší účinnost pro polarizaci makrofágů M2.

poté jsme zkoumali expresi povrchových markerů modc, které nebyly stimulovány nebo stimulovány IL-6 a LPS 24 h před průtokovou cytometrickou analýzou. Stimulace IL-6 a LPS vedla ke zvýšení exprese CD80, CD83 a CD86 (obrázek 3C). Zralé DC marker CD83 buňky-povrchová exprese dramaticky zvýšila po aktivaci pomocí IL-6 a LPS na Den 8 relativní osn-stimulované skupiny. To potvrdilo, že IL-6 a LPS byly schopny podporovat zrání dendritických buněk (Doplňkový obrázek S1L). Exprese CD1a zůstala jednotná mezi nestimulovanými a stimulovanými skupinami. Zajímavé je, že stimulované DC zůstaly v suspenzi, ale zdálo se, že se začínají agregovat a držet se navzájem (obrázek 3C). Tyto výsledky potvrzují předchozí zjištění týkající se polarizace moDC a poskytují další kontrolu pro analýzu povrchových markerů k identifikaci nežádoucích populací moDC v různých podmínkách kultivace makrofágů.

M2 makrofágy generované postupně cytokinů expozice vlastnit M2-spojené funkce

manóza receptor (CD206) je endocytic a recyklace receptoru, který je vysoce exprimován v naší M2 makrofágů populace v rámci postupného podmínky léčby. Dále jsme chtěli posoudit ENDOCYTÁRNÍ absorpci zprostředkovanou CD206 v našich makrofágech. To bylo stanoveno pomocí PBI-12-Man, biokompatibilního činidla, které fluoreskuje po vazbě na receptor manózy (17). Po 1hodinové léčbě makrofágů M1 i M2 PBI-12-Man byla červená fluorescence PBI-12-Man převážně intracelulární u makrofágů M2 za podmínek postupné a kontinuální léčby (obrázek 4, A A B). Toto zjištění naznačuje, že vazba na povrch buněk na CD206 a endocytózu vede k vezikulární lokalizaci. To souhlasí s předchozím dat z průtokové cytometrie, která prokázala, že v rámci postupné ošetření podmínky, M2 makrofágy zobrazí vyšší buňka-povrch vyjádření CD206 vzhledem k M1 makrofágů populace. Zajímavé je, že jsme zjistili, že buňky pouze GM-CSF vykazovaly vysoké hladiny PBI-12-Man endocytózy (obrázek 4 ,A A B). To koreluje s naší průtokovou cytometrii dat (Obrázek 2), které prokázaly, že GM-CSF-pouze podmínek kultivace produkují M1 buňky s M2-spojené surface marker výraz. Celkově prokazujeme, že tyto buňky měly normální vlastnosti makrofágů a že CD206 byl funkční v populaci makrofágů M2.

Po 14 dnech v kultuře, M2 makrofágy zobrazí také schopnost pojistky, dosahující více než 200 µm ve velikosti a obsahující více jader v buňce (Obrázek 4C). Tyto se podobaly vícejaderným obřím buňkám (Mngc), o nichž bylo hlášeno, že mají fagocytární a jiné schopnosti (20). Kromě toho byly Mngc spojeny s cizím materiálem v těle, tuberkulózou a rakovinou (20-23). Tato buněčná fúze byla nalezena výhradně v našich populacích makrofágů M2 a byla mnohem významnější ve fázovém stavu M2. Zatímco M-CSF-pouze skupiny měla některé mnohojaderné buňky (Obrázek 4C), jejich velikost a čísla jsou mnohem nižší, než postupné skupiny. S ohledem na schopnost těchto buněk k provedení této makrofágů spojené funkce, tyto výsledky dále naznačují, že postupné kultivace podmínek produkuje vysoce M2-jako makrofágy.

zde jsme popsali náš nově vyvinutý fázový protokol pro polarizaci makrofágů. Zjistili jsme, že zahrnutí IL-6 a postupné polarizace léčby načasování je naprosto zásadní při vytváření nejvíce M1 – M2-jako makrofágy in vitro. Toto zjištění bylo důkladně testováno ve srovnání s jinými polarizačními metodami. Z tohoto důvodu se domníváme, že metoda fázové polarizace poskytuje podstatný krok vpřed. To poskytne vědcům jednotné experimentální standardy pro produkci homogenních populací makrofágů pro použití in vitro a schopnost porovnávat jejich výsledky. Zatímco tento protokol nabízí celou řadu vylepšení ve srovnání se současnou polarizaci strategií, jsme přesvědčeni, že další výzkum a optimalizaci expozice, časy a cytokinů koktejl bude užitečné. To nám pomůže dále porozumět složitým rolím makrofágů M1 a M2 v různých formách progrese onemocnění a pokročit ve vývoji nových terapeutik.