Případová Studie: Objevování Inhibitory napěťově řízených Sodíkových Kanálů

Jako způsob, jak ilustruje problémy spojené s iontovým kanálem léčiv je uvedeno výše, zbývající část tohoto článku bude popsat případovou studii se zaměřením na identifikaci napěťově řízených sodíkových kanálů inhibitory k léčbě chronické neuropatické bolesti. Léčba bolesti je vážným zdravotním problémem a ve farmaceutickém průmyslu existuje velké úsilí o vývoj nových terapií pro tento stav. Zejména v léčbě neuropatické bolesti definována jako „chronická bolest, která vyplývá z primární léze či dysfunkce periferního nervového systému“ od Mezinárodní Asociace pro Studium Bolesti (IASP), zůstává hlavní neuspokojená potřeba lékařské péče.

je zřejmé, že napěťově řízené sodíkové (Nav1) kanály hrají klíčovou roli při vzniku a šíření senzorických nervových akčních potenciálů nezbytných pro signalizaci bolesti. Lokální aplikace nesubtypových selektivních blokátorů sodíkových kanálů, jako je novokain, poskytují úplnou úlevu od bolesti prostřednictvím vodivého bloku. Nicméně, tento přístup k úlevě od bolesti, je omezena na velmi málo aplikací, jako jsou zubní postupy, protože sodíkové kanály jsou také životně důležité pro vedení vzruchu v srdci, CNS, kosterní svalstvo, a nonnociceptive smyslové neurony. Nav1 super Rodina se skládá z 10 členů (Yu A Catterall, 2004). Sedm z těchto podtypů, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, a Nav1.9, jsou přítomny v periferním nervovém systému (PNS). Z nich jsou Nav1. 7, Nav1. 8 a Nav1. 9 exprimovány převážně v nociceptivních neuronech a Nav1.3 je převážně embryonální, ale po poranění je u dospělých PNS regulován. Tento omezený vzorec exprese činí tyto podtypy atraktivními cíli pro vývoj nových analgetik. Jejich relativní příspěvek k signalizaci bolesti a konkrétně k neuropatické signalizaci bolesti je však nejasný a může se lišit s různými etiologiemi a smyslovými vlastnostmi bolesti.

V nepřítomnosti molekulární selektivitou pro jeden Nav1 podtypu, je možné konkrétně se zaměřit na Nav1 kanály v daném konformační státu při zachování sodíkových kanálů–závislá vzruchu. Tento typ státu-dependentní inhibice je základem pro terapeutické okno viděl s sodíkových kanálů blokování antikonvulziva a antiarytmika, jako je lamotrigin a lidokain. Tyto léky mají vyšší afinitu pro programy v otevřené a/nebo inaktivované státy než pro odpočinek, uzavřené programy. Tento mechanismus inhibice laskavosti závazné v rychle střílet nebo částečně depolarizované tkání. Neuropatické bolesti by měly být citlivé na tento inhibiční mechanismus, protože to je si myslel, že vznikají z poškození vyvolané oblastech depolarizations, hypotéza je podporována klinické účinnosti lidokain podáván systémově na subanesthetic dávkách. Navíc nesubtypově selektivní blok závislý na stavu může dovolit největší účinnost, protože individuální knockout Nav1. 3, Nav1. 7, Nav1. 8 nebo Nav1.9 neposkytl přesvědčivé důkazy o dominantní roli některého z těchto kanálů v neuropatické signalizaci bolesti.

na Základě tohoto odůvodnění, bylo rozhodnuto, aby nejprve věnovat nonsubtype selektivní, stát závislé na Nav1 inhibitory, při sledování molekulární selektivita testování sloučenin zájem na Nav1.7, Nav1.5 (primární srdeční sodíkových kanálů) a Nav1.8 paralelně.

byl použit test na bázi membránového potenciálu pro screening ∼200 000 sloučenin na Nav1. 8 stabilně exprimovaných v rekombinantní buněčné linii. Tento test HTS byl založen na přenosu fluorescenční rezonanční energie (FRET) mezi dvěma členy dvojice barviv citlivých na membránový potenciál vyvinutá Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Nav1. 8 kanály byly předinkubovány zkoušenou sloučeninou a chemickým agonistou deltamethrinem v nepřítomnosti extracelulárního sodíku. Následné přidání sodíku vedlo k depolarizaci membrány a Nav1 blok byl kvantifikován jako interference s tímto buněčným depolarizačním procesem.

ačkoli počáteční obrazovka na Nav1.8 přineslo různé zásahy, pouze jedna sloučenina byla považována za životaschopné olovo pro úsilí o léčivou chemii. Před spácháním zdroje, aby to olovo, sloučeniny, sekundární-sukcinimid označují BPBTS (N-{ methyl }-N‘-(2,2′-bithien-5-yl-methyl) – sukcinimid), byla podrobně prozkoumána manuální celá buňka napětí svorky. Bylo zjištěno, že BPBTS inhibuje všechny subtypy Nav1 s podobnou účinností a inhibice byla závislá na membránovém potenciálu a stimulační frekvenci. Tento inhibiční mechanismus byl v souladu s vyšší afinitou sloučeniny pro kanály v otevřeném a inaktivovaném stavu ve srovnání s kanály v klidovém stavu. Kromě toho, BPBTS byl o dva řády účinnější než klinicky používaný antikonvulzivní a antiarytmické Nav1 blokátory, inhibice inaktivovaný stav Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5, a Nav1.2, s Ki hodnoty 0,09, 0.15, 0.08, 0.14 µM a klidovém stavu s Kr hodnoty 1.5, 1.3, 0.3, a 1.2 µM, respektive (Priest et al., 2004).

jako takový byl BPBTS atraktivním olovem pro léčivou chemii; jeho hlavním závazkem je špatný farmakokinetický profil. V průběhu profilování analogy BPBTS, stejně jako zveřejněné Nav1 inhibitory, pomocí membránového potenciálu, založené na fluorescenční detekční assay, struktury založené na rozdíly mezi energiemi stanovena ve fluorescenčním testu a elektrofyziologie byly zaznamenány pro několik sloučenin. Tyto nesrovnalosti byly vysledovány v interakci mezi těmito sloučeninami a agonistou veratridinem používaným k otevření kanálů Nav1. 7. Následně byl fluorescenční test upraven tak, že Nav1 kanály byly předinkubovány zkoušenou sloučeninou ve fyziologických extracelulárních koncentracích sodíku a depolarizace závislá na Nav1 byla zahájena přidáním agonisty (obr. 1). Kanál inhibiční energie měřené v této modifikované zkoušky koreluje velmi dobře s inaktivovaný stav inhibice určena elektrofyziologie v mnoha strukturálních tříd Nav1 inhibitory (Felix et al., 2004; Liu a kol., 2006).

i když analogy BPBTS nepodařilo překonat počáteční vedení v potenci, medicinal chemistry se podařilo zlepšit farmakokinetický profil, nakonec vytváří trans-N-{methyl }-N-methyl-N‘-cyclopentane-1,2-dicarboxamide (CDA54) s 44% perorální biologickou dostupnost, jedna hodina poločas a clearance 14 ml/min/kg, což byl široce profilované in vivo (Brochu et al., 2006). U dvou potkaních modelů neuropatické bolesti cda54 (10 mg/kg, podávaná perorálně) významně snížila hypersenzitivitu vyvolanou nervovým poškozením o 44-67%. Stejná dávka/koncentrace v plazmě z CDA54 nemělo vliv akutní nociception (rat hot plate test), motorické koordinace (potkan rotorod testu), nebo poruchou srdeční vodivosti (elektrofyziologické parametry měřené v kardiovaskulárním pes). Tyto vlastnosti jsou na rozdíl od vlastností současných blokátorů sodíkových kanálů používaných na klinice, které způsobují zhoršenou motorickou koordinaci u potkanů a vedlejší účinky na CNS u člověka ve všech účinných dávkách. Zajímavé je, že po perorálním podání byl poměr mozku k plazmě pro CDA54 0,03. Naproti tomu klinicky používané blokátory Nav1 se hromadí v CNS, přičemž poměr mozku k plazmě je větší než 10 pro mexiletin. Tyto údaje získané s CDA54 silně navrhl, že inhibice PNS sodíkové kanály na pokoji je účinný u zvířecích modelů neuropatické bolesti, a že omezení CNS expozice Nav1 inhibitory je životaschopný přístup k rozvoji Nav1 inhibitory s lepší terapeutický index.

UHTS kampaň, pomocí membránového potenciálu–podle testu je popsáno na obrazovce pro inhibitory Nav1.7, objevil román 1-benzazepin-2-jeden kanál inhibitory (Hoyt et al., 2007; Williams a kol., 2007). Této třídy inhibitorů prokázala definován vztah mezi strukturou a aktivitou a při hodnocení in vivo, členové této série byly perorálně účinný na hlodavce neuropatické bolesti a epilepsie modely. Důležité je, že někteří členové této třídy vykazovali molekulární selektivitu pro kanály Nav1.7 (Williams et al., 2007). Například sloučenina 2 z obr. 2 byl vysoce závislý na stavu a ∼10krát selektivní pro Nav1. 7 oproti Nav1.8 a Nav1.5. Nejúčinnější, i když ne subtypově selektivní, člen této třídy inhibitorů Nav1.7 (sloučenina 1, BNZA; obr. 2) byl tritiován. BNZA se váže s vysokou afinitou (KD 1,6 nM) na rekombinantní Nav1.7 kanály. Toto je první demonstrace vazby ligandu s vysokou afinitou na Nav1. 7 a poskytuje cenný screeningový nástroj, pomocí kterého lze hledat selektivní sloučeniny Nav1.7. Údaje získané se strukturní řadou 1-benzazepin-2-one naznačují, že Nav1.7-selektivní analogy mohou být identifikovány, a s příslušnými farmakokinetiky a metabolismu léku vlastnosti, tyto sloučeniny by mohly být vyvinuty jako analgetické prostředky, potenciálně zobrazování lepší snášenlivost než stávající léky používané k léčbě neuropatické bolesti. Podpora pro možnost vytvoření podtypu selektivní sodíkových kanálů inhibitory jako román analgetika pochází z nedávné zprávě vysokou afinitu Nav1.8 selektivní činidlo, které podáván intraperitoneálně byl účinný v širokém rozsahu hlodavce bolest modely (Jarvis et al., 2007).

potenciálním alternativním přístupem k hledání subtypově selektivních inhibitorů sodíkových kanálů by bylo screening sloučenin, které se zaměřují na mechanismy hradlování kanálů. Několik peptidů již dříve bylo prokázáno, upravit vtokové sodíkových kanálů, ale několik malých molekul, zejména inhibitory, byly popsány funkce v tomto módu. Jeden takový agent je ProTx-II, 30–aminokyselina peptid purifikován z jedu tarantule; tento peptid blokuje sodíkové kanály a ukazuje, selektivity pro Nav1.7 (Smith et al., 2007). ProTx-II se váže na klidový stav sodíkových kanálů a posouvá napěťovou závislost aktivace kanálu na depolarizované potenciály. Silné depolarizace překonávají inhibici kanálu, což je charakteristickým znakem tohoto typu peptidu modifikátoru brány. Jednou z možných strategií identifikovat malé molekuly mimetik z vtokové modifikátor peptid je značení ProTx-II v biologicky aktivní formě, a aby vypracovala závazné testu s Nav1.7 kanálů heterologously vyjádřil v buněčné linii. Promítání pro malé molekuly, které modulují ProTx-II vazba by mohla odhalit nové třídy kanálu inhibitory že oddíl do membrány a narušovat pohyb vtokové pádlo, čímž se zabrání otevření kanálu. Výhodou tohoto typu UHTS je, že vysoké koncentrace zkoušené látky by mohly být využity v situaci, že je vyloučena v dye-based screening v důsledku fluorescence rušení, které obvykle dochází s vysokou koncentrací z mnoha malých organických molekul. Vzhledem k tomu, že některé vtokové modifikátor peptidy se váží na regiony, které jsou jedinečné pro konkrétní kanály, v super rodině, podtypu selektivní inhibitory by mohly být identifikovány pomocí této strategie.