v posledním desetiletí došlo k pozoruhodnému pokroku v oblasti proteomiky i genomiky. Kromě základní technické pokroky, které vedly ke zvýšení objemu vysoce kvalitních údajů, „- omics“ revoluce také začala poskytovat některé zajímavé pohledy do rozmanitosti procesů, které regulují tumorigenezi v mnoha různých typů lidských nádorů. Velké cestovní mapy genové a proteinové exprese produkované těmito metodami lze často použít ke klasifikaci rakoviny nebo k předpovědi reakce na určité typy léčby. Nicméně, oni často nedokážou určit specifické regulátory, které mohou sloužit jako slibné cíle pro příští generace protinádorových léčiv, do značné míry proto, že mnoho z hlavních „druggable“ tříd proteinů jsou enzymy, které jsou přísně regulována na úrovni transkripce a translace i na úrovni aktivity enzymu. Mnoho dnes běžných“ – omických “ metod tedy neposkytuje informace o dynamické regulaci daného enzymu nebo rodiny enzymů během mnoha fází vývoje rakoviny. V tomto čísle PNAS, Shields et al. (1) využít relativně novou metodu označuje jako „activity-based proteomika“ identifikovat protein s serinové hydrolázy činnost, která je základní regulátor růst nádorových buněk. Pomocí tohoto funkčního přístupu byli autoři schopni identifikovat specifický enzymový cíl, který může sloužit jako cenný cíl pro vývoj protinádorových léčiv.
oblast činnosti založené na proteomika nebo chemická proteomika se ukázal jako alternativa k standardní proteomic metod, které primárně poskytují informace o celkovém množství proteinů (pro recenze, viz refs. 2–4). Činnosti založené na proteomic přístup využívá malé molekuly sondy, které se váží na enzymy v činnost-závislá způsobem, což umožní kvantifikaci dynamiky enzym regulace a přímé izolaci a identifikaci cíle zájmu (Obr. 1). S rozvojem mnoha nových tříd sondy (2), stejně jako nové třídy afinity a fluorescenční značky (5), activity-based protein profilování (ABPP) našel větší využití v identifikaci klíčových regulátorů lidských onemocnění. Zejména řada nedávných elegantních příkladů demonstruje hodnotu ABPP při identifikaci zajímavých regulátorů progrese rakoviny (4, 6-8).
proteomika založená na aktivitě nebo profilování proteinu založené na aktivitě (ABPP). V tomto příkladu jsou vzorky nádorové tkáně značeny sondou založenou na aktivitě (ABP), která obsahuje reaktivní fluorofosfonátovou skupinu. Po označení cílových enzymů (v tomto případě serinové hydrolázy), označené proteiny jsou odděleny SDS/PAGE, a relativní úrovně aktivity jsou určeny intenzita sondy, značení. Potenciálně zajímavé cíle jsou identifikovány jako mající zvýšenou nebo sníženou úroveň aktivity ve vzorcích nádoru. Označené cíle jsou izolovány afinitním čištěním pomocí značky sondy a identifikovány hmotnostní spektrometrií.
ve studii Shields et al. (1) v tomto čísle autoři použili širokospektrální serinovou hydrolázovou sondu k profilování lidských rakovinných tkání pankreatu. Toto úsilí vedlo k identifikaci proteinu nazývaného protein 9 vázající retinoblastom (RBBP9), který měl zvýšenou aktivitu hydrolázy ve 40% analyzovaných nádorových tkání. Je zajímavé, že tento protein byl dříve identifikován jako protein vázající retinoblastom (Rb) a neměl známou enzymatickou aktivitu (9). Předchozí studie funkce tohoto proteinu naznačují, že jeho nadměrná exprese poskytuje odolnost vůči účinkům TGFß při potlačení růstu buněk. Nicméně, tyto účinky na TGFß signalizace byli myšlenka být přímým důsledkem vazba RBBP9 na Rb, což vede k uvolnění eukaryotické překlad iniciační faktor 1 (EIF-1) transkripční faktor. Ve své současné studii Shields et al. ukázat, že RBBP9 má aktivitu serinhydrolázy a co je důležitější, že tato enzymová aktivita je nutná pro transformační účinky tohoto proteinu v rakovinných buňkách. Ztráta hydrolázy činnosti mutace aktivním místě serin (označeny homologie na ostatní serinové hydrolázy) nebo RNAi-zprostředkované knock-down proteinu vede ke zvýšení Smad 2/3 fosforylace, snížení exprese adhezních molekul, jako je E-cadherin, a následné snížení růstu nádoru. Dále autoři konstatují, že RBPP9 úrovně aktivity jsou zvýšené v řadě dalších lidských nádorů, což naznačuje, že inhibice tohoto hydrolázy činnost může mít široké tumor-supresivní účinky, což je potenciálně cenný terč pro vývoj protinádorových léčiv.
na více úrovních studie Shields et al. demonstruje sílu přístupu ABPP. Za prvé, tento přístup umožnil identifikaci enzymu aktivita v proteinu je znázorněno na funkci v regulaci buněčného růstu signalizace. Pomocí přístupu ABPP bylo možné sledovat dynamiku regulace této enzymové aktivity bez nutnosti identifikovat nativní substrát a stanovit test in vitro. Za druhé, úrovně exprese RBBP9 byly ekvivalentní v normálních i rakovinných tkáních, což naznačuje, že enzymová aktivita řídí funkční příspěvek tohoto proteinu k růstu nádorových buněk. Žádná ze současných genomických nebo proteomických metod by tedy nebyla schopna identifikovat tento cíl jako klíčový regulátor nemoci.
samozřejmě zůstává mnoho otázek o přesné mechanistické roli RBBP9. A co je nejdůležitější, jaké jsou nativní substráty tohoto enzymu? Enzym skutečně hydrolyzuje své substráty? Jaký je důsledek hydrolýzy substrátu? Jak zpracování substrátu vede k regulaci signalizace Smad2/3? Bude zajímavé zjistit, zda RBBP9 může být snadno inhibován malými molekulami, takže může být validován jako potenciálně životaschopný cíl léku pomocí pokročilejších myších modelů lidské rakoviny. Odpovědi na tyto otázky jistě přijdou díky dostupnosti sond založených na aktivitě.
